微生物的接種、分離和培養(yǎng)

1、實驗六 微生物的接種、分離和培養(yǎng)一、目的要求1理解和掌握微生物接種、分離基本技術的原理及操作要領。 2熟悉微生物接種、分離的無菌操作過程。3了解微生物需氧培養(yǎng)的方法。 4學會觀察和描述微生物的各種培養(yǎng)性狀。二、實驗原理1. 微生物接種 指將微生物純種或含菌材料轉移到另一營養(yǎng)基質上的過程。 根據不同的目的可采用的不 同的接種方法，如平板劃線法、斜面劃線法、浸洗法、涂布法、傾注法、穿刺法、點植法和 影印法。2. 微生物分離指依據微生物的特征， 采用各種方法從含菌樣品中獲得由單一個體 （如單一菌體或孢子） 或一段菌絲生長繁殖形成的微生物群體的過程。 常用的分離方法有： 平板劃線法、 稀釋涂布 平板分

2、離法、稀釋傾注平板分離法和單細胞分離法。平板分離法的基本原理包括兩個方面：（ 1）選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入 某種抑制劑造成只利于該微生物生長， 而抑制其他微生物生長的環(huán)境， 從而淘汰一些不需要的 微生物。（ 2）微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。 因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。值得指出的是從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。 因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定， 有些微生物的純培養(yǎng)要經過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。

3、3. 微生物培養(yǎng)指微生物被接種到營養(yǎng)基質后， 在一定條件下生長繁殖的過程， 分需氧培養(yǎng)法和厭氧培 養(yǎng)法。本實驗所做的需氧培養(yǎng)法，是采用生化培養(yǎng)箱和恒溫搖床進行的。4. 微生物的培養(yǎng)形狀 培養(yǎng)性狀是微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的群體形態(tài)和生長情況。 平板菌落特征、 斜面和液 體培養(yǎng)特征、半固體穿刺培養(yǎng)特征等培養(yǎng)性狀，是鑒定微生物的重要形態(tài)學依據。菌落是由單個或少數細胞在固體培養(yǎng)基表面或里面生長繁殖所形成的內眼可見的子細 胞群體。 菌落形態(tài)會因菌種不同或菌種相同但所用培養(yǎng)基、 培養(yǎng)溫度和時間等條件不同而存 在不同程度的差異。 若所用培養(yǎng)基、 培養(yǎng)溫度和時間等條件相同， 則同一種菌所形成的菌落 形態(tài)具有相

4、對的穩(wěn)定性和專一性。三、實驗材料1. 菌種 大腸桿菌 (Escherichia coli)，枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis )，金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) ，啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)，熱帶假絲酵母( Candida tropicalis )，毛霉 (Mucor sp.)，根霉( Rhizopus sp.)，黑曲霉，青霉 (Penicillium sp.)，混合菌 液。2. 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂斜面和平板，半固體營養(yǎng)瓊脂直立柱， PDA 斜面和平板。3. 接種工具 接種環(huán)，接種針，涂布棒，無菌吸管等。4.

5、其他 酒精燈，生化培養(yǎng)箱等。四、實驗方法與步驟(一)實驗項目接種前的準備： 接種的試管、 培養(yǎng)皿等應做好標記， 注明菌種的名稱， 日期、 接種者等。表 6-1 實驗項目目 項 驗 實菌基 養(yǎng) 培 用 所名稱量 用接種方法平板劃法1.線黃菌 金球營1皿皿后 開菌 掀取 責， 左蓋平酵 絲 假帶 熱母ADP皿12.斜線法菌營管17 ；圖 側照 外參 在后。 管菌線 種取劃 菌，上 管種斜 拿接在 手持1 左手管1法 布 涂 3營皿1滅用入涂4.穿刺菌養(yǎng)瓊體營固體半脂管 各由內 直基 垂養(yǎng) 培 菌體 許固 少半 取入針 針扦退 種上路 接而原 用下黃菌 金球霉 根 霉 毛ADP一皿 各 許上 少板

6、取平霉 青 霉 曲 黑分離方法劃離1.平線法滴 菌 合 混營2皿皿少 啟菌。 開取線 責，劃 左蓋后實驗項目所用菌種所用培養(yǎng)基方法提示名稱用量分 離 方 法2.稀釋傾 注平板 分離法大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂平板1皿 取稀釋好的菌液 1mL 加入 滅菌的空平皿內 加入 15mL45 的融化瓊 脂，水平轉動平皿3.稀釋涂 布平板 分離法大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂平板1皿取稀釋好的菌液加入到平板 上用滅菌涂布棒涂開涂勻二）各種接種方法的操作步驟所有待接種的培養(yǎng)基在接種前都要先貼好標簽，整個接種過程都必須在酒精燈旁進行。1斜面接種斜面接種是從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一支新鮮斜面培養(yǎng)基上的 一種接種方法。

7、具體操作如下：1）操作前，先用 75%酒精擦手，待酒精揮發(fā)后才能點燃酒精燈。2）用斜面進行接種時，將原菌種管和待轉接斜面試管夾在左手的大拇指和其它四指之間，斜面朝上，并處于水平位置。（圖6-1， 1）1235圖 6-1 斜面劃線接種示意圖3）先將原菌種管和待轉接斜面試管的硅膠塞旋轉一下，以便接種時便于拔出。4）右手拿接種環(huán)（與日常拿筆一樣）在火焰上將環(huán)金屬絲部分燒紅滅菌，然后將其余要伸入試管部分的金屬柄也反復通過火焰滅菌。（圖6-1，2）（5）用右手小指、無名指或手掌將原菌種管和待轉接斜面試管的硅膠塞同時拔出并把 硅膠塞握住， 不得任意放在桌上或與其它物品相接觸 ，再以火焰燒管口（圖 6-1，

8、 3）。（ 6）將上述在火焰上滅菌過的接種環(huán)伸入菌種管內，接種環(huán)在接觸菌種前先在試管內 壁上或未長菌落的培養(yǎng)基面上接觸一下， 使接種環(huán)充分冷卻， 以免燙死菌種， 然后用接種環(huán) 輕輕沾取少量菌苔， 接著將接種環(huán)自菌種管內抽出。 抽出時勿與管壁相碰， 也勿通過火焰 （圖 6-1， 4）。（7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面試管中，自斜面培養(yǎng)基底部向上劃線，使 菌體沾附在培養(yǎng)基的斜面上， 劃線時環(huán)要平放， 勿用力， 否則會使培養(yǎng)基表面劃破 （圖 6-1，5）（ 8）接種完畢后將接種環(huán)抽出，灼燒一下管口，塞上硅膠塞，塞棉塞時勿要用試管口去迎棉塞，以免試管在移動時納入不潔空氣 。（圖 6-1， 6）

9、。（ 9）接種環(huán)放回原處前要在火焰上徹底滅菌，接種致病菌時更要注意這點。將棉塞旋 緊。注意：棉塞與火焰的距離要適當，以免棉塞燃燒。2穿刺接種（ 1） 操作方法見圖 6-2，可以水平穿刺，也可以垂直穿刺，所使用的接種針要筆直。（ 2） 將接種針自培養(yǎng)基中心刺入，直到接近管底，但勿穿透，然后沿原穿刺途徑慢慢拔出。圖 6-2 穿刺接種示意圖3平板接種1）劃線接種 見分離劃線法。2）涂布接種 用無菌吸管吸卻菌液注入平板后，用滅菌的玻璃在平板表面作均勻涂（圖 7-3）。（3）三點接種法 標明三點位置： 欲使點接的三點分布均勻， 可用記號筆先在平板底部以等邊三角形 狀標上三點。 取接種針：拿接種針，先在火

10、焰上燒紅滅菌，并在平板培養(yǎng)基的邊緣冷卻且蘸濕。 沾取孢子：將滅過菌并蘸濕的接種針伸入菌種管, 用針尖沾取少量霉菌孢子。 點接：操作方法基本同穿刺接種，以垂直法或水平法把接種針上沾著的孢子以垂直 的方向輕輕的點接到平板培養(yǎng)基表面預先做好標記的部位。注意在點接時切勿刺破培養(yǎng)基。4分離方法（1）涂布平板分離法 涂布平板分離法是樣品經過適當稀釋后， 用無菌吸管吸取于固體培養(yǎng)基平板中， 用無菌 玻璃涂棒將稀釋液均勻地涂布，使樣品中的菌體經過培養(yǎng)后能在平板表面上形成單個菌落。（圖 6-3）（2）稀釋傾注平板分離法 傾注平板分離法是最常用的純種分離法,先將待分離的材料作一系列的稀釋（如1:10,1:100,

11、1:1000,1:10 ,000 然）,后分別取不同稀釋液少許 （一般?。?與已熔化并冷卻至 45 的瓊脂培養(yǎng)基相混合 ,搖勻后 ,傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中 ,待瓊脂凝固后 ,保溫培養(yǎng)一定時間即可 出現(xiàn)菌落 .如果稀釋得當 ,平皿上就可出現(xiàn)分散的單個菌落,這個菌落可能就是由一個細胞繁殖形成的 .隨后挑取該單個菌落 ,或重復以上操作數次 ,便可得到純培養(yǎng)。（圖 6-4 ）（3）平板劃線分離法劃線的方法很多， 但無論采用哪種方法， 其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋， 使之形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線1 2條，再轉

12、動培養(yǎng)皿約 70 °角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作 第二次平行劃線， 再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線 部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。（圖6-5）將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。 劃線完畢后， 蓋上培養(yǎng)皿蓋， 倒置于溫室培養(yǎng)。圖 6-3 稀釋涂布平板分離法圖 6-4 稀釋傾注平板分離法a（適用于濃度較低的菌液）b（適用于濃度較高的菌液）圖 6-5 平板劃線分離法（三）培養(yǎng)細菌于 37恒溫箱中培養(yǎng)， 24 h 后開始觀察生長情況。酵母菌、霉菌28恒溫箱中培養(yǎng)，48h 后開始觀察生長

13、情況。注意：平板應倒置培養(yǎng)。（四）微生物培養(yǎng)形狀觀察 參照下表內容，認真觀察和記錄接種的各種細菌、酵母菌、霉菌的培養(yǎng)性狀。表 6-2 微生物培養(yǎng)性狀容 內 察 觀語 述 述 描 用 常平板菌落特征大?。?落 mm 菌6 等大（ 中 落（ ） m大 m巨 2、 ） 1mm （6 落 菌4 ?。?、落 菌 m大 1m、 1 m 落4 菌 微 2（形態(tài)狀 絲 形 圓度 起 隆面 凸 起 隆 展 擴邊等 狀 葉 裂 狀 波 形 齒 鋸 圓 齊 整度 明 透明 透 不 明 透狀 形 面 表狀 樹 狀絲 狀等糙 粗 滑平閃光色 顏等 色 黑 色 無質地等 潤 濕 燥 干 狀 蠟（劃直線接種） 斜面培養(yǎng)性狀

14、長 生 不 弱 微態(tài) 形 苔 菌狀 根 狀 線起 凸 平 扁態(tài) 形 面 表糙 粗 滑 平度 明 透明 透 不 明 透質地潤 濕 燥 干 狀 臘色 顏色 無刺培養(yǎng)性狀 半固體穿長 生 不 弱 微 般線狀 刺形 穿長 沿生狀 根 狀 珠 狀 棘 狀 線圖 6-6 菌落形態(tài)特征菌落總體形狀和邊緣狀況可由菌落上方俯視觀察，而菌落高度則由平板邊緣水平觀察。圖 6-7 細菌菌落的隆起度（ A）邊緣（ B）、表面形狀及透明度（ C）圖 6-8 細菌在瓊脂培養(yǎng)基中穿刺圖 6-9 細菌在明膠培養(yǎng)基中穿刺培養(yǎng)的生長特征培養(yǎng)并液化明膠的特征a）絲狀；（b）有小刺；（c）念珠狀； a）不液化；（b）火山口狀；（c）蕪

15、箐狀；d）絨毛狀；（ e）假根狀；（ f）樹狀 d）漏斗狀；（ e）袋狀（ f）層狀五、實驗結果分“菌種名稱、培養(yǎng)基名稱、接種方法、培養(yǎng)溫度、及時間、培養(yǎng)性狀描述”等欄目， 制表記錄觀察結果。六、實驗思考題1. 微生物接種方法的共同點是什么據此可否想出其它接種方法2. 若沒有接種環(huán)，可否用別的接種工具照樣接種3. 平板劃線分離純種的依據是什么操作中應該特別注意哪些環(huán)節(jié)4. 傾注平板用的瓊脂培養(yǎng)基為何要冷卻至455. “無菌操作”在微生物接種、分離工作中有何意義6. 若沒有電熱恒溫培養(yǎng)設備，可否另想辦法也能使接種在培養(yǎng)基上的微生物照樣生長7. 如何區(qū)別某種菌產生的是水溶性色素還是非水溶性色素8. 混濁度（ OD560 值）相同、體積相等的大腸桿菌菌液和啤酒酵母菌液所含的菌數是否 相同為什么9. 同一種菌在同一平板上所形成的菌落會否一樣大七、注意事項1微生物的接種、分離操作，最好在無菌室或無菌罩內進行。若在普通室內做，酒精 燈火焰應稍大，要防止外來污染。2平板或斜面的劃線要迅速、輕捷，不要劃破培養(yǎng)基。3做平板分區(qū)劃線分離時，劃完一小區(qū)，均勻將接種環(huán)徹底灼燒滅菌