分子生物學(xué)基因工程生物化學(xué)復(fù)習(xí)題

1、1、蛋白質(zhì)分子（多肽鏈）的方向性（即：N 末端和 C 末端）是如何確定的？答：由肽鍵決定即通過氨基酸 NH2 和氨基酸 COOH 的脫水縮合， 形成了 N 末端在左， C 末 端在右2、什么是多肽鏈的肽平面？什么是二面角？ 答：肽平面：肽鍵具有一定程度的雙鍵性質(zhì)，參與肽鍵的六個原子C、 H、O、N 、C1、C2不能自由轉(zhuǎn)動，位于同一平面。二面角：一個碳原子相連的兩個肽平面，由于N1C1和 C1C2（羧基碳）兩個鍵為單鍵。肽平面可以分別圍繞這兩個鍵旋轉(zhuǎn)，從而構(gòu)成不同的構(gòu)象。3、維持蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)有哪幾種力？次級鍵包括哪幾種？答：二硫鍵、 （氫鍵 疏水性相互作用力、離子鍵、范德法力。 ）第二

2、小題4、如何將蛋白質(zhì)變性？如何復(fù)性？ 答：加熱、加乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等；去除上述因素， 若變性程度較輕即可復(fù)性。5、伴侶分子有哪兩種類型？其功能如何？ 答：分子伴侶和伴侶蛋白；輔助新生肽鏈折疊的，催化對形成功能所必需的共價鍵盤變化6、人熱休克蛋白在新生蛋白質(zhì)折疊過程的作用是什么？答：輔助新生肽鏈正確折疊7、膜蛋白分為哪兩種類型？它們各通過何種化學(xué)鍵與膜相結(jié)合？ 答；外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。 1）共價鍵 2）疏水性相互作用力8、瘋牛病得病因是什么？ 蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變而凝集使其由可溶性變成不可溶性。9、蛋白質(zhì)翻譯后需要進行哪些形式的加工才能具有活性？肽鍵 N 末端

3、甲硫氨酸殘基的切除，蛋白質(zhì)前體的酶切修飾以及氨基殘基側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾。10、胃和胰腺分泌的消化蛋白酶的酶原如何加工才能具有活性？酶切加工11、什么是蛋白質(zhì)的可逆磷酸化？ 蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化分別由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。12、什么是蛋白質(zhì)的靶向輸送？靶向輸送的蛋白質(zhì)的N 端通常有何序列？定向動送送執(zhí)行功能的目的地的過程；信號肽13、何謂信號肽'？其結(jié)構(gòu)特點是什么？ 信號肽：分泌蛋白新生肽段 N 端的一段能被細(xì)胞轉(zhuǎn)動系統(tǒng)識別的特征性的序列。特點：該序列約為 1630 個氨基酸殘基分為 N 端堿性區(qū)、疏水核心區(qū)及加工區(qū)三個區(qū)段， 緊接其后的是被信號肽酶裂解的點。14、信號肽識別

4、顆粒（ SRP）的組成如何？其功能是什么？一分子 7SRNA 和 6 分子蛋白質(zhì)；功能：既能識別露出核糖體之外的信號肽并與結(jié)合，又 能識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 SRP 受體。15、真核細(xì)胞蛋白質(zhì)如何進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)？1）以 MRNA 為模板，在胞漿游離核糖體上合成多肽鏈；2）當(dāng)包括信號肽在內(nèi)的一段約70個氨酸殘基的多肽鏈被合成后， SRP與信號肽、 核糖體及 GTP結(jié)合，蛋白翻譯暫停； 3）SRP 引導(dǎo)核糖體多肽 SRP復(fù)合體與 SRP受體結(jié)合、啟動 GTP酶活性，水解 GTP 使 SRP解 離并再利用，翻譯功能恢復(fù)； 4）核糖體大亞基與 ER 膜上的核糖體結(jié)合糖蛋白結(jié)合，錨定 在 ER 膜上，水解 GTP

5、 供能，誘導(dǎo)跨 ER 膜通道開放，新生肽鏈的信號肽插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜5 ）信號肽啟動肽鏈轉(zhuǎn)位，新生肽鏈通過跨 ER 膜通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。 信號肽被信號肽酶切除并 降解； 6)ER 腔內(nèi)的 HSP70 消耗 ATP，促進新生肽鏈折疊成空間構(gòu)象； 7)核糖體的大、小 亞基及 mRNA 分離并進入下一輪循環(huán)。16、插入 ER 膜的第類膜蛋白有哪些信號序列？ 信號肽錨定序列17、決定細(xì)胞核蛋白靶向運輸和定位的信號序列是什么？ 核定位信號18、泛素的結(jié)構(gòu)特點和主要功能是什么？ 標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)使之被水解， 決定轉(zhuǎn)錄方向， 模板鍵和轉(zhuǎn)錄效率和組合蛋白結(jié)合位 點。1、什么是操縱子？操縱子的上游調(diào)控區(qū)主要有哪

6、些調(diào)控序列？各具有哪些功能？操縱子： 原核基因上游的調(diào)控區(qū)及下游轉(zhuǎn)錄終止信號共同組成的一個基因表達(dá)單位； 上游調(diào) 控區(qū)主要有啟動子和操控基因；功能：啟動子：結(jié)合 RNA 聚合酶并啟動轉(zhuǎn)錄；操縱基因： 特異性阻遏物的結(jié)合區(qū)。2、大腸桿菌的啟動子通常是什么？-10 區(qū)、 -35 區(qū)、 +1 區(qū)、3、6 因子的功能是什么？其主要類型的是什么/？識別啟動子。 628、 632、 654、 670、4、LAC 操縱子調(diào)控區(qū)有哪些調(diào)控序列(結(jié)合位點)？各具有哪些功能？5、為什么 LAC 操縱子的阻蛋白能夠抑制轉(zhuǎn)錄？ 由于操縱子元件與啟動子有部分重疊阻蛋白與操縱元件結(jié)合后，可抑制 RNA 聚合酶與啟動 子結(jié)

7、合，抑制轉(zhuǎn)錄。6. cAMP 是如何產(chǎn)生的？ CAP 如何調(diào)節(jié) lac 操縱子的表達(dá)？CAMP 是腺苷酸催化 ATP 產(chǎn)生的，只有 CAP 結(jié)合結(jié)合到啟動子上游的 CAP 結(jié)合位點后， 促進 RNA 聚合酶與啟動子結(jié)合才能有這轉(zhuǎn)錄。7. 何謂葡萄糖效應(yīng)？細(xì)菌通常優(yōu)先以葡萄糖作為能源， 當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中有葡萄糖時， 即使加入乳糖， 阿拉伯糖等糖 類，細(xì)菌也不用這些糖， 不產(chǎn)生代謝這些糖的酶， 直到葡萄糖消耗完畢代謝其他糖的酶才會 根據(jù)相應(yīng)的糖是否存在被誘導(dǎo)產(chǎn)生，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)。8. (p)ppGpp 的功能是什么？ 調(diào)節(jié)活性大分子的協(xié)調(diào)性9. 乳糖操縱子如何由 CAP 和阻遏蛋白共同調(diào)控？1

8、0. 在 trp 操縱子中，何謂前導(dǎo)序列？其結(jié)構(gòu)特點是什么？11. 何謂衰減子？它在是如何形成的？其功能是什么？12. 原核生物 mRNA 翻譯起始位點的特點是什么？AUG 上游 10 個堿基處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與16S' rRNA 3'端識別13. mRNA 的二級結(jié)構(gòu)如何控制翻譯起始？MRNA 的二級結(jié)構(gòu)可隱蔽 SD 序列，使核糖體無法序列。14. 反義 RNA 分子是如何產(chǎn)生的？其功能如何？15. 真核生物基因表達(dá)如何在染色質(zhì)（染色體）進行調(diào)控？各舉一例說明。16. DNA 甲基化發(fā)生在哪個堿基的哪個位點？17. DNA 甲基化為什么使基因不能表達(dá)？ 甲基化影

9、響基因表達(dá)的機制有下列幾種：直接作用：基因的甲基化直接改變了基因的構(gòu)型， 影響 DNA 特異順序與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使基因不能轉(zhuǎn)錄；間接作用：基因5'端調(diào)控序列甲基化后與核內(nèi)甲基化 CG 序列結(jié)合蛋白結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄因子 與基因形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。18. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)如何影響基因表達(dá)？19. 何謂順式作用元件？何謂反式作用因子 ? 舉例說明。 順式作用元件：真核生物基因中的調(diào)控序列決定轉(zhuǎn)錄起始位點 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。 反式作用元件： 能直接或間接結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率 的蛋白質(zhì)順式：啟動子、增強子、沉默子、衰減子、終止子反式： DNA 結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子20.

10、 真核轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域有哪幾種模體 ? 每種模體的主要特點是什么？1）鋅指：借助半脫氨基酸和組氨基與鋅離子結(jié)合2）間源異型域：具有螺旋回折螺旋結(jié)構(gòu) 3）亮氨基拉鏈：使兩個單位結(jié)合并形成DNA 結(jié)構(gòu)域 4）螺旋環(huán)螺旋：易于形成二聚體，能與免疫蛋白 K 鏈基因增強子結(jié)合的反式 E12 和 E17 具有這種結(jié)構(gòu)。21. 原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要是哪一種模體？22. 轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域的主要特點是什么？有哪幾種模體 ? 哪種模體的激活 能力最強 ?23. 何謂染色質(zhì)重塑 ?改變?nèi)旧w位置和結(jié)構(gòu)，改變?nèi)旧w DNA 可接近程度24. 何謂反式作用因子的組合調(diào)控 ? 每一

11、種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可發(fā)揮促進或抑制作用， 但反式作用因子對基 因表達(dá)的調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子結(jié)合發(fā)揮特定的作用。25. 真核 pre-mRNA 需要進行哪些加工 ?真核 pre-mRNA 需要進行 5'端加帽，選擇性剪接， 3'端加定26. 5'-帽子結(jié)構(gòu)分為哪幾種類型 ?脊椎動物的帽子結(jié)構(gòu)中有幾個甲基？帽子的功能是什 么？5'-帽子結(jié)構(gòu)分為 CAP0 、 CAP 、 CAP ；三個； 1）決定 mRNA 穩(wěn)定性， 2）通過核膜輸 送 3）翻譯27. 真核 mRNA 3 '-端多聚腺苷酸化的信號是什么？ poly （A）

12、尾的功能是什么 ?poly （A） 尾的功能是保護 mRNA 不受降解28. 為什么 tRNA 和 rRNA 分子要比 mRNA 穩(wěn)定得多 ?tRNA 和 rRNA 有二、三級結(jié)構(gòu)29. 什么是蛋白質(zhì)同質(zhì)異形體 ? 蛋白質(zhì)同質(zhì)異形體的功能是否相同？ 蛋白質(zhì)同質(zhì)異形體：不同基因翻譯表達(dá)同一蛋白質(zhì)；有可能相同有可能不同；30. 人類大約有多少個蛋白質(zhì)編碼基因 ? 人體內(nèi)有多少種蛋白質(zhì)？為什么一個基因可以編 碼多種蛋白質(zhì)？人類大約有 24000 左右個蛋白質(zhì)編碼基因， 10 萬種蛋白質(zhì)31. 舉例說明真核 mRNA 的 5'-UTR 和 3'-UTR 如何在翻譯水平調(diào)解基因表達(dá)水平

13、?32. 不穩(wěn)定的真核 mRNA 的 3'端序列的特點是什么 ? 以不完全互補的形式結(jié)合在 3'端 AU 段，富含 AU 序列被核苷酸切割易識別33. 線蟲編碼小分子 miRNA （lin-4 ）如何調(diào)解基因（ lin-14 ）的表達(dá) ?34. 真核基因表達(dá)調(diào)控有哪幾個主要階段 ?1）轉(zhuǎn)錄 2）轉(zhuǎn)錄加工 3） mRNA 降解 4）翻譯 5）翻譯加工 6）蛋白質(zhì)分選 7）蛋白質(zhì)降解35. 何謂基因表達(dá)的“統(tǒng)一理倫” ?36. 何謂 CTD ? CTD 的功能是什么？CTD ：RNAP 最大的亞基 C 端結(jié)構(gòu)域； 功能：CTDRNA 加工過程中起著平臺作用通過 CTD 磷酸化來調(diào)整

14、及招募不同 pre-mRNA 加工因子進行相應(yīng)加工?；蚬こ淘嚲?B名詞解釋 (每個 2 分，共 20 分)1、轉(zhuǎn)化 :2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移性 :3、DNA 文庫 :4、RACE:5、選擇標(biāo)記基因 :6、降落 PCR7、載體 :8、感受態(tài)細(xì)胞 :9CaMV35s:10、ORF:、選擇題(每題 1分，共 15 分)1( ) 限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是A 修復(fù)自身的遺傳缺陷B 促進自身的基因重組C 強化自身的核酸代謝D 提高自身的防御能力2( )生物工程的下游技術(shù)是 A 基因工程及分離工程 C 基因工程及蛋白質(zhì)工程B 蛋白質(zhì)工程及發(fā)酵工程D 分離工程 及蛋白質(zhì)工程)基因工程操作常用的酶是

15、:(I 內(nèi)切酶 II 連接酶 III 末端轉(zhuǎn)移酶 IV 聚合酶A. I + IIB. I + III + IVC. II + III + IV D. I +II + IV + III4 ( ) 限制性內(nèi)切核酸酶的星活性是指：A 在非常規(guī)條件下，識別和切割序列也不發(fā)生變化的活性。B 活性大大提高C 切割速度大大加快D 識別序列與原來的完全不同5( )下列五個 DNA 片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是A. GAAACTGCTTTGACB. GAAACTGGAAACTGC. GAAACTGGTCAAAGD. GAAACTGCAGTTTC6 ( ) 關(guān)于 cDNA 的不正確的提法是：A同mRNA 互補的單鏈 R

16、NAB同mRNA 互補的含有內(nèi)含子的 DNAC 以 mRNA 為模板合成的雙鏈 RNAD 以上都不正確7 ( ) 下列有關(guān)連接反應(yīng)的敘述，錯誤的是A. 連接反應(yīng)的最佳溫度為 37 B. 連接反應(yīng)緩沖體系的甘油濃度應(yīng)低于 10%C. 連接反應(yīng)緩沖體系的 ATP 濃度不能高于 1mMD. 連接酶通常應(yīng)過量 2-5 倍8 ( ) T 4 -DNA連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段DNA 片段連接在一起， 其底物的關(guān)鍵基團是A. 2' -OH 和5' PB. 2' -OH和3' -PC. 3' -OH 和5' PD. 5' -OH和3' -

17、P9 ( ) 載體的功能是A. 外源基因進入受體的搭載工具B. 不能為外源基因提供整合能力C. 不能提供復(fù)制能力D. 不能為外源基因提供表達(dá)能力10 ( ) 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且A 產(chǎn)生新切點 B 易于回收外源片段C 載體不易環(huán)化 D 影響外源基因的表達(dá)11 ( ) 下列哪種克隆載體對外源 DNA 的容載量最大 ?A 質(zhì)粒B 黏粒C 酵母人工染色體 (YAC)D噬菌體12 ( )考斯質(zhì)粒( cosmid)是一種A. 容量最大一種載體B. 由 -DNA 的 cos 區(qū)與一質(zhì)粒重組而成的載體C. 是一種單鏈 DNA 環(huán)狀載體D. 不能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但可以表達(dá)13 ( )某一重組

18、DNA 的載體部分有兩個 BamHI 酶切位點。用 BamHI 酶切后凝膠 電泳上出現(xiàn)四條長度不同的帶子，其長度總和與已知數(shù)據(jù)吻合，該重組分子插入片段上 的 BamHI 酶切位點共有A.4 個B. 3 個C. 1 個D. 2 個14( )下列哪一種酶作用時需要引物 ?A 限制酶 B 末端轉(zhuǎn)移酶 C 反轉(zhuǎn)錄酶 D DNA 連接酶15 用下列方法進行重組體的篩選，只有 ()說明外源基因進行了表達(dá)。(a)Southem 印跡雜交(b)Northem 印跡雜交(c)Western 印跡(d)原位菌落雜交三、簡答題(每題 5分，共 25 分)1、簡述獲得目的基因常用的幾種方法。2、什么是 - 互補篩選？

19、3、簡述酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件？4、核酸操作的基本技術(shù)有哪些？5、限制性核酸內(nèi)切酶有幾種類型？常用是哪種類型并簡述其特性。四、論述題(每題 10分，共 40 分)1 論述重組子的篩選和鑒定常用的方法。2 基因工程基本操作程序。3 試述 5 RACE 技術(shù)原理和方法4 試舉例說明基因工程中為什么常用大腸桿菌作為工程菌？基因工程試題標(biāo)準(zhǔn)答案及評分標(biāo)準(zhǔn) B一、選擇題（每題 1分，共 15 分）1、D 2、A 3、A 4、D 5、D 6、C 7、A 8、C 9、D 10、C11、C 12、B 13、D 14、C 15、C二、名詞解釋（每題 2 分，共 20 分）1、嚴(yán)格地說是指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲

20、和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA 分子的生命過程2、質(zhì)粒不親和性：在沒有選擇壓力的情況下，兩種不同質(zhì)粒不能夠在同一宿主細(xì)胞系中穩(wěn) 定地共存的現(xiàn)象。3、cDNA 文庫：是指某生物某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄形成的cDNA 片段與某種載體連接而成的克隆的集合。4、RACE ：是一種通過 PCR 進行 cDNA 末端快速克隆的技術(shù)，是以 mRNA 為模板反轉(zhuǎn)錄 成 cDNA 第一鏈后用 PCR 技術(shù)擴增出某個特異位點到 3，或 5，端之間未知序列的方法。5、基因文庫：通過克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物，組織，器官或細(xì)胞類型的所有 DNA 片段而構(gòu)成的克隆集合體。6、RT-PCR:先用逆轉(zhuǎn)錄酶作用于 mRNA ，以寡聚

21、 dT為引物合成 cDNA 第一鏈， 然后用已知 一對引物，擴增嵌合分子，這種方法稱為逆轉(zhuǎn)錄 PCR7、載體：指基因工程中攜帶外源基因進入受體細(xì)胞的運載工具，它的本質(zhì)是DNA 復(fù)制子。8、S-D 序列：在大腸桿菌 mRNA 的核糖體結(jié)合位點上，含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同 16S 核糖體 RNA 3 ，末端堿基互補的序列，該序列最初由Shine 、Dalgarno 發(fā)現(xiàn)，故后來命名為Shine Dalgarno 序列，簡稱 S-D 序列。9、穿梭質(zhì)粒載體：指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點的選擇標(biāo)記，因而可在兩種 不同宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。10、MCS ：指載體上人工合成的含有緊密

22、排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點的DNA 片段。三、簡答題（共 25分，每題 5 分）1、什么是包涵體？重組蛋白在胞內(nèi)表達(dá)時， 常常以不溶性蛋白聚集成的晶狀物形式存在， 這種晶狀體即包 涵體。包涵體的形成是外源蛋白的高效表達(dá)時的普遍現(xiàn)象， 這是由于肽鏈折疊過程中部分折 疊的中間態(tài)發(fā)生了錯誤聚合，而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。2、什么是 - 互補篩選？質(zhì)粒載體具有 -半乳糖苷酶基因（ lac Z），當(dāng)外源 DNA插入到它的 lac Z，可造成表達(dá) 后的 - 半乳糖苷酶失活， 利用這一點就可以通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加有 X-gal-IPTG 培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子

23、。有些大腸桿菌上帶有 lac Z 基因的部分編碼 序列，質(zhì)粒載體中含有別一部分編碼序列， 當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入載體后， 可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。 這種 lac Z 基因上缺失了一部分編碼序列的突變體與帶有這一部分編碼序列的突變體之間實 現(xiàn)互補的現(xiàn)象叫互補。3、限制性核酸內(nèi)切酶的活性受哪些因素影響？酶的純度。 DNA 樣品的純度。 DNA 的甲基化程度。酶切反應(yīng)的溫度與時間。 DNA 分子的構(gòu)型。限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液。4、核酸操作的基本技術(shù)有哪些？ 核酸提取與純化核酸的檢測與保存核酸的凝膠電泳核酸分子雜交5、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是什么？是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明。

24、理論上的三大發(fā)現(xiàn)： 證實了 DNA 是遺傳物質(zhì) 揭示了 DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機理 遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定 技術(shù)上的三大發(fā)明：限制核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與 DNA 切割 DNA 連接酶的發(fā)現(xiàn)與 DNA 片段的連接 基因工程載體的研究與應(yīng)用四、問答題（每題 10分，共 40 分） 1 如何有效地提高外源基因的表達(dá)效率？提高啟動子強度 縮短啟動子同克隆基因間距離 高效的翻譯起始序列高效的轉(zhuǎn)錄終止區(qū) 提高質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性 用以下方法提高翻譯水平：調(diào)整SD序列與 AUG間的距離用點突變的方法改變某些堿基增加mRNA的穩(wěn)定性的 減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷：誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制

25、 提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解： 克隆一段原核序列，表達(dá)融合蛋白采用某種突變菌株表達(dá)分泌蛋白質(zhì)2 試述載體構(gòu)建一般方法A 目的基因分析（ 1） ORF 分析（ 2）酶切位點分析B 載體選擇與分析（ 1 ）多克隆位點分析（ 2）抗性標(biāo)記分析（ 3）啟動子與其他篩選標(biāo)記 分析C 連接體系與連接時間確定3 試述 5 RACE 技術(shù)原理和方法PCR用于擴增代表 mRNA轉(zhuǎn)錄物某一單位點與其 3或 5末端之間區(qū)域的部分 cDNA稱 為快速擴增 cDNA末端技術(shù)（ RACE）。如果已知 mRNA的一片段鏈內(nèi)短序列，據(jù)此或設(shè)計基因 特異引物，用原先存在的 poly（A） 尾（ 3末端）或附加的同聚尾（

26、5末端）互補的序列做 末端引物，就可以獲得從未知末端直到已知區(qū)域的部分cDNA序列。為獲得 5末端部分 cDNA克隆需用基因特異引物，產(chǎn)物第一鏈產(chǎn)物，可用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶及 dATP 加 poly（A） 尾。通過 QT引物和反轉(zhuǎn)錄使用的上游基因特異引物生成第二鏈cDNA。4 大腸桿菌作為基因工程受體菌的優(yōu)缺點是什么？ 優(yōu)點：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的背 景知識清楚，對其基因表達(dá)調(diào)控的分子機理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實踐， 大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實驗體系， 有多種適用的寄主菌株和載體系列， 大 腸桿菌易于進行工業(yè)化批量生產(chǎn)。

27、缺點： 在通常情況下， 細(xì)菌的 RNA聚合酶不能識別真核的啟動子； 許多真核基因的蛋白 質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過翻譯后的加工修飾， 如正確的折疊和組裝， 而細(xì)菌中通常并沒有這樣的修飾 機制，從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無法產(chǎn)生有活性的蛋白； 外源真核基 因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識別，并被當(dāng)做“異已分子”降解掉。三、關(guān)于酶的組題（答題要簡潔，條理清晰，有針對性。如果你要回答的內(nèi)容在前面已經(jīng)給出，可以采用“參見”的引用方式，以便節(jié)省答題時間）12酶為什么具有催化功能？（ 4 分）為什么糜蛋白酶（ Chymotrypsin ）屬于絲氨酸蛋白水解酶家族？你還知道那些絲氨酸蛋 白水

28、解酶以及蛋白水解酶家族？（4 分）3酶為什么具有最適催化溫度和 pH 值？（ 分）4糜蛋白酶的催化動力學(xué)曲線與肌紅蛋白的 氧合曲線類似；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 個變構(gòu)酶， 它的催化動力學(xué) 為什5（ATCase）是 曲線是否與血紅蛋白的氧合曲線類似， 么？（ 4 分） 糜蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)及其激活過程如圖所 示，這個激活順序能否顛倒？給出理由（ 分）6對于人工酶（如環(huán)糊精）、核酶（ RNA ）、 抗體酶、同工酶、以及具有催化功能的脂類 分子集合體等具有明顯區(qū)別的概念或?qū)ο螅?你能用什么基本原理將他們統(tǒng)一在 “催化 的旗幟下？給出理由（ 4 分）drug that inhibits an overpro

29、duced enzymeIII.You are working on a compound as a potentialwhose uncontrolled activity leads to uncontrolled cell proliferation (cancer). A steady-state kinetic analysis of the enzyme-catalyzed reaction was carried out, with velocities measured as a function of the concentration of the substrate in

30、 the absence and in the presence of 10 nM inhibitor. The results of the kinetics experiment are plotted for you below. Please answer the following questions. (10 pts)1. What type of inhibitor is this compound (be as specific as you can)? Show the diagram of the inhibitor 's mechanism (by E denot

31、ing enzyme, S denoting substrate, I denoting inhibitor; for example: E+S ES E+P ).2. Calculate the Km, Kcat in the absence of inhibitor and K mapp, K catapp in the presence of inhibitor (app denoting apparent. The total concentration of enzyme is 2nM).3. Calculate the inhibitor constant K I.IV. Lyso

32、zyme destroys the cell wall of bacteria by catalyzing the hydrolysis of 1,4- -linkages between N-acetylmuramic acid (NAM) and N-acetyl-D-glucosamine (NAG) residues in a peptidoglycan. Six hexoses of the substrate fit into the active site of lysozyme, a deep cleft across part of the globular protein

33、surface this cleft. Figure A shows the hydrolytic process of 1,4-linkages between NAM and NAG and figure B shows the pH-activity profile oflysozyme. Please calculate the ratio of the enzyme molecules which really work at pH 3.8, 5.2,6.6 to all enzyme molecules, and explain figure B according to your

34、 calculation (pH = pKa +lg(A -/HA) ； pKaGlu = 5.9, pKa Asp = 4.5；102.1126，、關(guān)于酶的組題（答題要簡潔，條理清晰，有針對性。如果你要回答的內(nèi)容在前面已經(jīng)給出，可以采用“參見”的引用方式，以便節(jié)省答題時間）7酶為什么具有催化功能？（ 4 分）答：酶可以降低反應(yīng)的活化能， 使反應(yīng)速度加快 【2 分】，降低活化能的因素有： （1）酶與底物的相互誘導(dǎo)結(jié)合產(chǎn)生結(jié)合能【 1 分】，包括反應(yīng)物的商減少效 應(yīng)、脫溶劑效應(yīng)、電子云的定向重排效應(yīng)、酶對過渡態(tài)的穩(wěn)定效應(yīng)； （ 2）活 性中心特殊基團的催化作用【 1 分】，包括酸堿催化、共鍵催化

35、、金屬離子 催化等。8為什么糜蛋白酶（ Chymotrypsin）屬于絲氨酸蛋白水解酶家族？你還知道那 些絲氨酸蛋白水解酶以及蛋白水解酶家族？（ 4 分）答：糜蛋白酶活性中心的 Ser 殘基在蛋白質(zhì)水解反應(yīng)中起重要的催化作用【 1】酸堿催化和共價催化【 1】其它絲氨酸蛋白酶如 ：trypsin （胰蛋白酶）， elastase（ 彈性蛋白酶），subtilisin （枯草桿菌蛋白酶， thrombin（凝血酶） ，plasmin（血纖維蛋白溶酶） 等【中 英文皆可，寫出兩個以上給 1 分，寫出 1 個給 0.5 分】。其它蛋白水解酶家族 ：天冬氨酸（ Asp）蛋白水解酶家族，光氨酸（ Cys）

36、蛋 白水解酶家族，金屬蛋白水解酶家族等 【中英文皆可， 寫出兩個以上給 1分， 寫出 1 個給 0.5分】。9酶為什么具有最適催化溫度和 pH 值？ （ 4 分）答： 最適溫度 ：溫度的升高可以使任何化 學(xué)反應(yīng)的速度加快【 1 分】；過高的 溫度會使酶的構(gòu)象變化， 使酶的催化 能力降低【 1 分】，矛盾雙方的調(diào)和 使酶有一個最佳的催化溫度。最適 pH 值 ：酶的酸堿或共價催化需 要催化基團處于質(zhì)子化或脫質(zhì)子化狀 態(tài)【 1 分】，對 pH 有依賴性；同時 pH 的變化對穩(wěn)定酶構(gòu)象的相互作用， 特別是靜電相互作用有較大影響【 1 分】。上述因素的綜合，會使酶有一 個最佳的催化 pH 值。10 糜蛋

37、白酶的催化動力學(xué)曲線與肌紅蛋白的氧合曲線類似；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨 甲酰酶（ ATCase）是一個變構(gòu)酶，它的催化動力學(xué)曲線是否與血紅蛋白的氧 合曲線類似，為什么？（ 4 分）答：類似【 2 分】。理由： ATCase和血紅蛋白都屬于寡聚體變構(gòu)（別構(gòu)）蛋白， 它們包含多個與底物 /效應(yīng)物結(jié)合位點【 1 分】；某一結(jié)合位點與底物 /效應(yīng) 物的結(jié)合通過構(gòu)象變化會影響（加強或減弱）到其它位點與底物/效應(yīng)物的結(jié)合（變構(gòu)效應(yīng)）【 1 分】。它們的催化或結(jié)合動力學(xué)不遵從 Michaelis-Menten 方程（雙曲線），一般為 S 形曲線。11 糜蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)及其激活過程如圖所示，這個激活順序能否顛倒？ 給出

38、理由（ 4 分）答：不能顛倒【 2 分】。理由：可能糜蛋白酶原上只暴露有胰蛋白酶的切割位點 （水解），而糜蛋白酶的切割位點尚未暴露【 1 分】；當(dāng)胰蛋白酶對糜蛋白 酶原進行切割后，結(jié)構(gòu)會發(fā)生調(diào)整變化， 才暴露出糜蛋白酶（ -Chymotrypsin, -Chymotrypsin）的切割位點【 1 分】。12 對于人工酶（如環(huán)糊精）、核酶（ RNA ）、抗體酶、同工酶、以及具有 催化功能的脂類分子集合體等具有明顯區(qū)別的概念或?qū)ο?，你能用什么基?原理將他們統(tǒng)一在 “催化”的旗幟下？給出理由（ 4 分）答：用酶的催化機理來統(tǒng)一【 2 分】。理由：這些對象雖然屬于不同物質(zhì)類別或 分子整體結(jié)構(gòu)大不相同

39、，但他們一定有能與他們各自的底物相結(jié)合的活性 中心，通過各種效應(yīng)（參見答 1）來完成催化功能【 2 分】，因此，酶不一 定是蛋白質(zhì)，只要是能提供執(zhí)行催化機理的有序基團集合（即活性中心） 的物質(zhì)（分子）結(jié)構(gòu)，就具有酶的功能。III 答案要點1 Noncompetitive inhibitor ，a special mixed inhibitor【1pts】 【 2pts】2Km 1/0.8 1.25 M【1pt】Kcat Vmax/E 1/（2×106） 5×105 mM/s【1pt】Kmapp 1.25 M【1pt】Kcatapp （1/4）/ （2×106） 1

40、.25×105 mM/s【1pt】3 （1I/K I） Vmax / Vmaxapp【1pt】KI I/（ Vmax / Vmaxapp 1） 10×106/（41） 3.3×106 mM【2pts】IV.1pH3.8【2】lg（Asp-/HAsp） pH pKa 3.8 4.5 = -0.7 ，Asp-/HAsp 1/5起堿作用的 Asp 所占比例Asp- / （ HAsp Asp- ） Asp-/ （5Asp- Asp- ） 1/6同理， lg（Glu-/HGlu） 3.8 5.9 -2.1， Glu-/HGlu 1/126起酸作用的 Glu 所占比例HGlu

41、/ （ HGlu Glu- ） HGlu/ （HGlu/126 HGlu ） 126/127真正能工作的酶分子比例（ 1/6 ）×（ 126/127） 16.5%2. pH5.2【 2】類似 1 的計算，此時真正能工作的酶分子比例（5/6）×（ 5/6） 69.4%3. pH 6.6 【2】類似 1 的計算，此時真正能工作的酶分子比例（126/127）×（ 1/6） 16.5%此計算說明， 反應(yīng)體系 pH 值的變化影響作為催化基團 GLu35和 Asp52 的解離狀 態(tài)，從而影響酸堿催化和共價催化。要使溶菌酶保持高活性，需要一個恰當(dāng)?shù)?pH值 所謂最佳催化 pH值

42、【 4】。、填空（不要求很深的機理）1、丙酮酸進入三羧酸循環(huán)的第一步反應(yīng)，即丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的過程，是由 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體 催化的。2、肝細(xì)胞能維持血糖濃度的穩(wěn)定，是因為肝細(xì)胞具有 葡萄糖-6- 磷酸酶,腦細(xì)胞 和肌肉細(xì)胞無此酶。3、在肌肉組織中 , 由于缺乏 葡萄糖-6- 磷酸酶 肌糖原不能直接補充葡萄糖 .4、Ketone bodies are fuels for extrahepatic tissues. They are actone,acetoacetate and5、Lipids are carried in the blood plasma from one tissue to another as plasma lipoproteins. LDL Is responsible for carrying cholesterol to extrahepatic tissue.二、是非（清楚字眼，如氧化、還原）1、細(xì)胞培養(yǎng)物由供氧條件轉(zhuǎn)為厭氧條件時 , 葡萄糖的利用速度提高 .R2、哺乳動物體內(nèi)不能合成的脂肪酸是 油酸和亞油酸 .W3、膽固醇合成的限速酶