微生物檢測手段及注意事項(xiàng)

1、微生物檢測手段及注意事項(xiàng)微生物檢測手段及注意事項(xiàng)微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意 義，本文對生長量測定法、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微 生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo) 的二十余種常用的檢測方法， 簡要介紹了這些方法的原理， 應(yīng)用范圍和 優(yōu)缺點(diǎn)。一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按 自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用， 則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大?。┚筒粩嘣黾?，于是出現(xiàn)了個(gè)體 的生長現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤?長時(shí)，則達(dá)到一定程度后就會(huì)發(fā)生繁殖，

2、 從而引起個(gè)體數(shù)目的增加，這時(shí)，原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體。 隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生 長，就引起了這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指 標(biāo)來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個(gè)體生長在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的， 因此，微生物的生長通常指群體的擴(kuò)增。 微生物的生長繁殖是其在內(nèi)外 各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長繁殖情況就可作為研究 各種生理生化和遺傳等問題的重要指標(biāo)，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長抑制緊密相 關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長情況的檢測方法。既然生長意味

3、著原生質(zhì)含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)， 而測定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量，可以從其 重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。1.微生物計(jì)量法 1.1 體積測量法又稱測菌絲濃度法，通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養(yǎng)液（如10 mL）放 在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間（如 5 min）和轉(zhuǎn)速（如 5000 rpm ），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為 v,則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要

4、設(shè)定一致的處理?xiàng)l件,否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有一 定偏差。稱干重法可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的1020%。在離心法中,將一定體積待測培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速,行離心，并用清水離心洗滌 15 次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105C或 100C下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80C或 40C下真空干燥,干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40C下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法, 如活性干酵母（Activity Dry Yeast

5、, ADY ），些以微生物菌體為活性物質(zhì) 的飼料和肥料。1.3 比濁法微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計(jì)測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體 生長作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測定其生長情況，而不必取菌液。 該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。如使用UNICO 公司的紫外-可見分光光度計(jì)，在波長 600 nm 處用比色管定時(shí)測定發(fā)酵液的吸光光度值 OD600，以此監(jiān)控 E.coli 的生長及誘導(dǎo)時(shí)間。1.4 菌絲長度測量法對于絲狀真菌和一些放線菌， 可以在培養(yǎng)基上測定一定時(shí)間內(nèi)菌絲 生長

6、的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生 長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。2.微生物計(jì)數(shù)法2.1 血球計(jì)數(shù)板法血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺， 兩嵴的表比兩平臺的表面 高 0.1 mm,每個(gè)平臺上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400 個(gè)小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算 出 1 mL 菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜 于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包

7、括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。2.2 染色計(jì)數(shù)法為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì) 數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。2.3 比例計(jì)數(shù)法將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒 濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。2.4 液體稀釋法對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適

8、宜的三個(gè)連 續(xù)的 10 倍稀釋液中各取 5 mL 試樣，接種 1 mL 到 3 組共 15 只裝培養(yǎng)液 的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表 MPN ( Most Probable Number )得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀 釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測， 例如飲用水 和牛奶的微生物限量檢查。2.5 平板菌落計(jì)數(shù)法這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。 保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以

9、直徑9 cm 的平板上出現(xiàn) 50500 個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。2.6 試劑紙?jiān)谄桨逵?jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基， 其中加入活性指示劑 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測 試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫 瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。2.7

10、膜過濾法用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。3間接測定法微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化， 例如酸堿度， 發(fā)酵 液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長測定的相對值。因此可利用生理指標(biāo)等間接參數(shù)來測定 生物量。3.1 測定含氮量大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的 12.5%，酵母為 7.5%，霉菌為 6.0%。根據(jù)含氮量 冷.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多,如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas 測 N2氣法。Dumas測 N2氣法是將樣品與

11、CuO 混合，在 CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)猓占?在呼吸計(jì)中，用 KOH 吸去 CO2后即可測出 N2的量。3.2 測定含碳量將少量（干重 0.22.0 mg）生物材料混入 1 mL 水或無機(jī)緩沖液中， 用 2 mL 2%的 K2Cr2O7溶液在 100C下加熱 30 分鐘后冷卻。加水稀釋至 5 mL,在 580 nm 的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用 試劑做空白對照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。還原糖測定法還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況， 常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微 生物生長的常規(guī)監(jiān)測。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入

12、斐林試劑， 沸水浴煮沸 3 分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入 Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加 入淀粉溶液，繼續(xù)加 Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。3.4 氨基氮的測定離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入 0.02 mol/L 的 NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入 0.02 mol/L 的使之變色，根據(jù) NaOH 的用量折算出氨基氮的含量。 根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。3.5 其他生理物質(zhì)的測定P, DNA , RNA , ATP , NAM （乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣, 產(chǎn) CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)）

13、，耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微 生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如在BMP-2 的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長勢。4.商業(yè)化快速微生物檢測法微生物的檢測，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡便，自動(dòng)化，當(dāng)前很 多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備， 正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測 和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如： 4.1 試劑盒，培養(yǎng)基等手段抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物 檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系

14、統(tǒng)奠 定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物 計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測。4.2 借助新型先進(jìn)儀器BACTOMETER 全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí) 內(nèi)獲得監(jiān)測結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對酵母和霉菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法(Impedanee Technology )將待測樣 本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物經(jīng) 代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化， 從而比傳統(tǒng)平 板法更快速監(jiān)測微生物的存在及數(shù)量。 測定項(xiàng)目

15、包括總生菌數(shù)，酵母菌,大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌微生物 0D 值是反映菌體生長狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，0D 是 Optical Density （光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度。 通常 400700 nm 都 是微生物測定的范圍，需要紫外分光光度計(jì)測最大吸收波長。用得最多 的是：505 nm 測菌絲菌體、560 nm測酵母、600 nm 測細(xì)菌。用測 0D 方 法畫微生物生長曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管（根據(jù) 檢測點(diǎn)的需要，如需檢測 10 個(gè)點(diǎn)，就準(zhǔn)備 10 管），然后每個(gè)點(diǎn)取一管 出來測 0D 值就行了。一般測菌體密度的0D的波長范圍是5

16、80 nm-660 nm， 如枯草芽孢桿 菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)（200 nm400 nm 為紫外光區(qū)，400 nm 800 nm 為可見光區(qū)）?？瞻兹缬盟?，需要離心洗滌菌體；空白如用不 接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培 養(yǎng)以求條件一致， 最后注意一般 OD 值在控制在0.10.4 最好，在這個(gè) 區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果 OD 大于 1.0, 般要稀釋后再測，因?yàn)镺D 太大, 分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低。一般都測吸光值，而且最好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持發(fā)酵液或菌體 的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不一定成正比，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性。且取值的時(shí)候要連

17、續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3 次的數(shù)最好。另，用分光光度計(jì)測微生物的 OD 值為什么要把波長設(shè)為 600 nm這個(gè)波長其實(shí)只是針對濁度， 而分光光度計(jì)在 600 nm 處對濁度的反 應(yīng)比較靈敏。測吸收峰的實(shí)際意義并不大，比如LB 搖瓶培養(yǎng)過夜的大 腸桿菌，其實(shí)在 400 多納米處的吸收最大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收 峰。部分發(fā)酵產(chǎn)品配方和工藝(二)纖維素酶菌種：黑曲霉 GD-6。種子培養(yǎng)基：麩皮 2.0%，葡萄糖 3.0% , (NH4)2SO40.15% , pH 5.5 6.0,2830C,培養(yǎng) 40 h。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏 1.0%，蛋白胨 0.2% , (NH4)2HPO40.2% ,K2HPO40

18、.02%,KH2PO40.08%,MgSO40.09%,pH 5.5 6.0,28 30C,培養(yǎng) 140h。黃原膠菌種：黃單抱菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 4%，酵母粉 0.05%，豆粕粉 0.02%，無機(jī)鹽適量。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 115 轉(zhuǎn)/分，罐壓 0.5 公斤，最高 通風(fēng)量1:0.5/分，pH 在 7.0 左右，28C,發(fā)酵周期 72 h，發(fā)酵液最高粘度 14600 mPas 左右。蟲草多糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 4.0%，黃豆餅粉 4.0%，酵母膏 0.5% ,KH2PO40.25% , MgSO40.15%。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 140 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量

19、1:0.5/分，罐 壓 0.5公斤，培養(yǎng) 4572 小時(shí)。細(xì)菌纖維素菌種：Acetobacter xylinum NUST4。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 2.4%，蔗糖 2.2%，蛋白胨 1.6%，醋酸 0.24% ,Na2HPO43.5% , KH2PO40.1% , MgSO40.6% , FeS040.0015% , pH 6.0。Mg2+最適添加量為 6 g/L;0.015 g/L Fe2+時(shí)纖維素產(chǎn)量達(dá)最大；添加 0.003 g/L 煙酸、0.02 g/L 生物素和 20 mL/L 乙醇時(shí)纖維素產(chǎn)量達(dá) 9.87 g/L。菌種：木醋桿菌 1.1812。發(fā)酵培養(yǎng)基： 蔗糖 5.0%， 蛋白胨 1

20、.5%， 檸檬酸 0.2%，Na2HPO40.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.03%，乙醇 1%。培養(yǎng)條件：pH 6.8，溫度 28C,培養(yǎng)周期 6d。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量干重為 2 g/L0發(fā)酵完畢后過濾收集粗纖維，再用 4% NaOH 溶液沖洗，去離子水和 0.5% 乙酸反復(fù)沖洗，即獲細(xì)菌纖維素。頭抱菌素菌種：頂頭抱霉。種子培養(yǎng)基：玉米漿，蔗糖，葡萄糖，DL-蛋氨酸，豆油，CaCO3,pH 6.56.6o發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿，淀粉，糊精，蛋氨酸，葡萄糖，豆油，CaCO3, MgSO4(NH4)2S04, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, pH 6.0 6.1。發(fā)酵參

21、考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 115 轉(zhuǎn)/分，罐壓 0.5 公斤，最高 通風(fēng)量1:1/分，pH 在 6 左右，周期 150 小時(shí)。螺旋霉素菌種：螺旋霉素鏈霉菌。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 115 轉(zhuǎn)/分，罐壓 0.5 公斤，最高 通風(fēng)量1:1/分，發(fā)酵周期 130 小時(shí)左右。根據(jù)螺旋霉素生物合成的研究結(jié)果， 短鏈脂肪酸是合成螺旋霉素的前體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)48 h 后添加 0.5%濃度的乙醇，能夠提高其發(fā)酵效價(jià) 10%左右。加入豆油能較大幅度地提高螺旋霉素的發(fā)酵效價(jià)。在培養(yǎng) 48 h 時(shí)加入較在基礎(chǔ)料中加入更能提高螺旋霉素發(fā)酵效價(jià)，豆油的濃度以 1%為好。利福霉素菌種：地中海

22、諾卡氏菌。培養(yǎng)基：葡萄糖 10%，液化淀粉 2%，黃豆餅粉 1%，蛋白胨 1%，魚粉 0.5%，各種無機(jī)鹽適量。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 115 轉(zhuǎn)/分，罐壓 0.5 公斤，最高 通風(fēng)量1:1/分，發(fā)酵周期 130 小時(shí)左右。紅霉素菌種：紅色鏈霉菌。培養(yǎng)基 A :液化淀粉 4%，葡萄糖 4%，黃豆餅粉 4%，正丙醇 1%，無機(jī) 鹽適量。培養(yǎng)基 B :黃豆餅粉 4 %,葡萄糖 4%，淀粉 4%，糊精 2%，CaCO30.6 %,(NH4)2SO40.15%，KH2PO40.02 %，NaC1 0.2% ，MgSO40.02%。發(fā)酵參考環(huán)境：10100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 115 轉(zhuǎn)/分

23、，最高通風(fēng)量 1:1/分, pH 自然，28C,周期 160 小時(shí)。潔霉素菌種：鏈霉菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉 2.5%，玉米漿 0.6%，(NH4)2SO40.5%，NaNO34%， NaCl 0.6% ， CaCO30.9%， 玉米淀粉 2.5%， 葡萄糖 3%，KH2PO40.07%。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:0.5/分，罐 壓 0.7 公斤，pH 6.5 7,培養(yǎng)溫度：060 h，31C；60 130 h，30C；130 h 至放罐 31C。發(fā)酵液初期粘度最大到 130 mPas，發(fā)酵周期 150 小時(shí)。土霉素培養(yǎng)基: 黃豆餅粉 3%，玉米漿 0

24、.65%，淀粉 8% , (NH4)2SO41.2% ,NaCI 0.2% , CaCO31.1% , KH2PO40.015%，每罐外加 CoCi25 10 g/ 噸。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 140 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:0.7/分，罐 壓 0.7公斤。環(huán)抱素培養(yǎng)基: 葡萄糖 2%，面粉 4%，干酪素 0.61.2%，NaNO30.15%，KH2PO40.2%，KCI 0.05% ，MgSO40.005%，CaCO30.2%。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 140 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:0.7/分，罐 壓 0.7公斤，pH 6.5，發(fā)酵時(shí)間 4 天左右，溫度 25 度左右

25、。其中通氣和培養(yǎng) 溫度對 CyA 的生物合成量影響非常大。納他霉素菌種：褐黃抱鏈霉菌。培養(yǎng)基. 大豆蛋白胨 I.8%，酵母粉 0.45%，葡萄糖 3.6%，pH 7.5。發(fā)酵 時(shí)間 96h 左右。慶大霉素菌種：慶大小單抱菌。培養(yǎng)基：淀粉 4%，玉米粉 2%，黃豆餅粉 3%，蛋白胨 0.3%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.5%，每罐外加 CoCi28 10 g/ 噸。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 140 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:1/分，罐壓0.5 公斤，pH 7.58.0，發(fā)酵周期 80 小時(shí)。金霉素菌種：金色鏈霉菌。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：玉米淀粉 8.5%，花生粉 1.5%，黃豆

26、粉 2.5%，淀粉酶(酶活力 2000 IU/mL) 0.004%，NaCI 0.25% ，(NH4)2SO40.5%，CaCO30.7%，蛋白胨 1.0%，酵母粉 0.2%，MgSO40.025%，豆油 4.0 mL/100mL。在溫度 29 0.5C，發(fā)酵培養(yǎng) 166 h。小諾霉素菌種:棘抱小單抱種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉 1.5%，葡萄糖 0.1%，玉米粉 2%，魚粉 0.2%，淀 粉 4%，pH 7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 0.5%，淀粉 4%，玉米粉 1.5%，熱榨黃豆餅粉 2.5% 蛋白胨0.2%，硫酸銨 0.05%，pH7.2。四環(huán)素培養(yǎng)基主要成分：液化淀粉，玉米漿，黃豆粉，KH2PO

27、4，每罐外加二巰基苯并噻唑和 NaBr。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 140 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:0.7/分，罐 壓 0.7公斤，pH 6.0 左右。部分發(fā)酵產(chǎn)品配方和工藝(一)赤霉素發(fā)酵1060 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 115 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:1/分，培養(yǎng)溫度大多采用29C32C。培養(yǎng)基的起始 pH 值控制在 5.5 左右，而將發(fā)酵過程的 pH 值 維持在 3.54.5 之間為宜。種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 1.5%， 豆餅粉 1.5%， 淀粉 1.0%， KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.05%，MgSO40.1%，自然 pH 值。發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉 0.9% 淀粉 7.0%，葡

28、萄糖 1.0%，KH2PO40.15%MgSO40.08%，a-淀粉酶 0.003%，pH 5.0 5.5 發(fā)酵周期 130 小時(shí)阿維菌素：種子培養(yǎng)基：淀粉 3.0%，豆餅粉 2.0%，酵母粉 0.2%，C0CI2 6HO 0.5 ppm ，pH 7.0 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉 5.0%，玉米粉 1.0%，酵母粉 1.0%，豆餅粉 1.0% ,CaCO30.2% , CoCi2 6HO 0.5 ppm , pH 7.0 7.2。妥布霉素發(fā)酵菌種：黑暗鏈霉菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉 2.5%，葡萄糖 1.0%，玉米粉 1.0%，玉米淀粉 1.5%(NH4)2SO40.5%，魚粉 0.4% ； M

29、gS040.6%，油 1.0%，ZnSO40.05%，CaCO30.6%，溫度 37C,發(fā)酵時(shí)間 112 h 左右。氫化可的松菌種：藍(lán)色犁頭霉(AS365)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 1.0%，酵母浸膏 0.23%，玉米漿 1.5%，硫酸銨 0.5% pH 6.46.5。28C培養(yǎng) 24 h，投入 0.25%的 RSA (醋酯化合物：17a-羥 基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，RSA)，轉(zhuǎn)化 3642 h。寧南霉素菌種：諾爾斯鏈霉菌西昌變種抱子斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉 2%，蔗糖 1.0%，硝酸鉀 1.0%，K2HPO40.5%， MgSO40.5%， NaCl 0.5% ， CaCO30

30、.5%， 硫酸亞鐵 0.01% 瓊脂 2.0%，滅菌前 pH 7.27.4。種子培養(yǎng)基：玉米粉 2.0%，黃豆餅粉 3.0%，酵母粉 0.01%，K2HPO40.01%，MgSO40.0025% ，NaCl 0.02% ，CaCO30.03%，初始 pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉 2.0%，淀粉 1.0%，花生餅粉 3.5%，酵母粉 0.05% K2HPO40.02%，MgSO40.05%，(NH4)2SO40.25%，CaCO30.5%，初始 pH 7.0。發(fā)酵 48 h達(dá)到發(fā)酵高峰。多抗霉素發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉 1.5%，豆餅粉 2.0%，飴糖 2.0% , KH2PO40.1% ,NaC

31、I 0.1% , CaCO30.3% , pH 6.5。10 %接種量，28C,120h。BT該菌生長的最適 pH 在 7.07.2，弱堿性條件有利于芽泡及晶體的形成；增加培養(yǎng)基中糖含量顯著提高菌體的生長量，但對芽抱及晶體的形成均有一定 影響；高通氣量有利于菌的生長，并可縮短發(fā)酵周期，但后期通氣量過大影響芽抱及晶體形成。該菌發(fā)酵的最佳工藝條件為：控制發(fā)酵溫度在30C；發(fā)酵前期（包括延遲期、加速期、對數(shù)期）：pH 控制在 7.0，采用達(dá) 1:2.0 v/（v mi 的大通氣量，達(dá) 1:2.0 v/（v m 為菌的生長提供良好的環(huán)境，盡 可能提高菌數(shù)（高于 7.5 1010/mL）;發(fā)酵后期（減速

32、期、恒定期）：不控 pH，并適當(dāng)減小通氣旦到 1:0.5、1:1.0 v/（v min，更有利于菌體向芽抱及伴抱晶體轉(zhuǎn)化（98 %以上）。液體培養(yǎng)基：I 號培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.5%，NaCl 0.5%，pH 7.2 ; II號培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖 1.0%， pH7.2。衣康酸菌種：土曲霉。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:0.2/分，罐 壓 0.7公斤，pH 4.0 左右。培養(yǎng)基: 葡萄糖 14%，米糠 0.3%，各種無機(jī)鹽適量。發(fā)酵周期 90 小時(shí)。 曲酸菌種：黃曲霉。發(fā)酵參考環(huán)境：510

33、0 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:0.2/分，罐 壓 0.7公斤，pH 4.0 左右。培養(yǎng)基：主要成分為液化淀粉 14%，各種無機(jī)鹽適量。發(fā)酵周期 130 小時(shí)。菌種：米曲霉。利用豆渣的發(fā)酵培養(yǎng)基：豆渣 80%，麩皮 24%，酵母膏 1.2% ,MgSO4 7HO 0.16% , pH 自然；30C發(fā)酵培養(yǎng)，56 d 菌體生長量和曲酸 產(chǎn)量最大。利用黃漿水發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖 12%，酵母膏 0.5 %, MgSO4 7HO0.05%，K2HPO40.05%，黃漿水 100%，pH 為 6.0。30C發(fā)酵培養(yǎng)，56 d 菌體生長量和曲酸產(chǎn)量最大。檸檬酸菌種：黑曲霉。發(fā)酵參考環(huán)境：

34、5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:1/分，罐壓0.7 公斤，pH 在 3 左右；培養(yǎng)基主要成分為液化淀粉 14%，各種無機(jī)鹽適量，產(chǎn)酸溫度為 3436C,發(fā)酵周期 90 小時(shí)。谷氨酸菌種：谷氨酸棒桿菌。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:1/分，罐壓0.7 公斤，pH 在 7.0 左右；培養(yǎng)基一 主要成分：葡萄糖 13%，MgSO4 7HO 0.08%，KH2PO40.08%， 玉米漿 3%9%，糖蜜 0.5%1%，豆?jié)?3%5% ，KCl 0.1%，發(fā)酵周期 30 小時(shí)。賴氨酸菌種：谷氨酸棒桿菌。發(fā)酵參考環(huán)境：5100 噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速 10

35、0 轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量 1:1/分，罐壓 0.7 公斤，pH 在 7.0 左右。種子培養(yǎng)基：葡萄糖 1.5%，(NH4)2SO40.4%，MgSO4 7HO 40 mg ， 玉米漿 2.0%，尿素 0.1%，CaCO33.0%，乙酸銨 0.1%，K2HPO40.15%，豆?jié)?0.86%，pH 7.2 7.4，115 C 高壓滅菌 15 min發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 15.0% , （NH4）2SO43.5% , MgSO4 7HO 20 mg , 玉米漿 2.5%，乙酸銨 0.9%，生物素 20pg,K2HPO40.15%，豆?jié)?1.6% , pH7.2 7.4。115 C 高壓滅菌 15 min。堿

36、性蛋白酶菌種：芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基 I :可溶性淀粉 1%，蛋白胨 0.5% , Na2HPO40.4% ,KH2PO40.03%，CaCl20.1%，pH 中性，121C滅菌 25 min。發(fā)酵培養(yǎng)基 II :玉米粉 2%，豆餅粉 3%，麩皮 3%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，ZnCl20.1%，pH 8.0，121C滅菌 25 min。發(fā)酵培養(yǎng)基 III :黃豆餅粉 5%，玉米粉 5%，麩皮 2.5%，KH2PO40.03% Na2HPO40.4%，Na2CO30.1%，自然 pH。在 36C下通風(fēng)培養(yǎng)，前期通風(fēng) 1:0.15，后期通風(fēng) 1:0.2，培養(yǎng) 40 h 左右。 低溫堿性蛋白酶菌種：黃海黃桿菌。發(fā)酵培養(yǎng)基 I:豆餅粉（水解液，加 0.5% NaOH ，121C水解 30 min，冷 卻、過濾）4.5%、玉米漿 6%，Na2HPO40.4%，KH2PO40