控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程

1、控制菌（大腸埃希菌）檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編制人編制日期年 月 日編制部門審核人審核日期年 月 日審核部門批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期年 月 日頒發(fā)部門編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件1 .目的建立一個(gè)控制菌大腸埃希菌控制菌大腸埃希菌檢查標(biāo)準(zhǔn)工作程序，規(guī)范QC控制菌大腸埃希菌檢查人員的控制菌大腸埃希菌檢查的操作。2 .范圍適用于本公司的口服制劑完成內(nèi)包后外包前的中間體和局部給藥制劑產(chǎn)品的內(nèi)包裝材料的控制菌大腸埃希菌的檢測。3 .責(zé)任者QC控制菌大腸埃希菌檢查人員；質(zhì)量管理部4 .內(nèi)容4.1 檢測準(zhǔn)備4.1.1 QC人員接到控制菌大腸埃希菌檢查的 工作進(jìn)程計(jì)劃單

2、后，核對(duì)取樣指令， 確定控制菌大腸埃希菌檢查所需容器具、試液、培養(yǎng)基等項(xiàng)目和數(shù)量，執(zhí)行 微生物檢查 準(zhǔn)備工作操作程序和培養(yǎng)基配制操作規(guī)程，進(jìn)行控制菌大腸埃希菌檢查前的準(zhǔn)備工作。4.1.2 為了保證被檢品在取樣后規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成檢驗(yàn)，取樣前應(yīng)準(zhǔn)備好檢驗(yàn)需要的各 種器皿（清洗一干燥一包裹）、培養(yǎng)基和稀釋劑等（配制一分裝一包裹），并滅菌備用。4.2 供試液的制備4.2.1 供試液 供試液是指按照供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法將供 試品制成供試驗(yàn)用的均勻液體。4.2.2 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物需特性，采取適宜的方法制備供試 液。如果使用了乳化劑、分散劑、中和劑和滅活劑，其

3、用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生 物的生長和存活無影響性。4.2.2.1 可溶性液體供試品第1頁/共7頁文件名稱控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,混勻，作為供試液?？?溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。4.2.2.2 非水溶性液體供試品油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯 80使供試品分散均勻，然后再加 0.9%無菌氯化鈉- 蛋白陳緩沖液至100m,混勻，作為供試液。4.2.2.3 水溶性固體、半固體或黏稠性供試品稱取供試品10g,置PH7.0

4、無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml中，用勻漿儀或其他適宜 方法，混勻，作為1: 10供試液。必要時(shí)可加適量的無菌聚山梨酯 80,并置水浴中適當(dāng) 加溫使供試品分散均勻。4.2.2.4 非水溶性供試品取供試品5g（5m1）,加入含溶化的（溫度不超過45C） 5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、 10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45CpH7.0無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,邊加邊攪拌，使其充分乳化，作為 1:20供試液。 4.2.2.5腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10 g,加PH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或 PH7.6無菌磷酸鹽緩沖 液（用于

5、結(jié)腸溶制劑）至100ml,置45c水浴中，振搖，使溶解，作為1:10的供試液。 4.2.2.7具抑菌成分供試品當(dāng)供試品抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查，一般使用培養(yǎng)基稀釋 法，取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不 含抑菌作用。取低稀釋級(jí)供試液（原液或 1:10的供試液）2份，每份各1ml,分別注入 5個(gè)或5個(gè)以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml）,每個(gè)平皿傾注培養(yǎng)基約 15ml,混勻， 凝固后，倒置培養(yǎng)，按每1ml分注的平皿點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)之和計(jì)數(shù)，即為每 1ml的菌落數(shù)， 共得2組數(shù)據(jù)，再以2組數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。4.2.2.8

6、供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45C,時(shí)間為30min。第2頁/共7頁文件名稱控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3檢驗(yàn)操作4.3.1操作程序MUG蛋白陳36 C 1824hr供試品EMB或麥康凱瓊脂平36l C1824hr疑似菌落純培養(yǎng)36 土 C 1824hrMUG陽 性Indole陽MUG陰 性MUG陽 性MUG陰 性Indole陰Indole陰Indole 陽革蘭氏染色、鏡檢36 巾 61824hJ報(bào)告報(bào)告4.3.2 培養(yǎng)基選擇與標(biāo)記4.3.2.1 增菌培養(yǎng)使用膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基，標(biāo)記

7、符號(hào)為BL4.3.2.2 快速生化試驗(yàn)使用4-甲基傘形酮葡萄甘酸蛋白陳培養(yǎng)基，標(biāo)記符號(hào)為MUG4.3.2.3 分離培養(yǎng)使用曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC4.3.2.4 純培養(yǎng)使用營養(yǎng)瓊脂（YYO培養(yǎng)基，標(biāo)記符號(hào)為 YY第3頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.2.5 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)使用乳糖（RD培養(yǎng)基、5暗L糖培養(yǎng)基，標(biāo)記符號(hào)為 RT4.3.2.6 靛基質(zhì)試驗(yàn)（I ）使用蛋白陳水培養(yǎng)基，標(biāo)記符號(hào)為 RT標(biāo)記符號(hào)為I4.3.2.7 甲基紅試驗(yàn)（M）使用磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基，

8、標(biāo)記符號(hào)為M4.3.2.8 乙酰甲基甲醇生產(chǎn)試驗(yàn)（V-P）使用磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基，標(biāo)記符號(hào)為V-P4.3.2.9 枸檬酸鹽利用試驗(yàn)（C）使用枸檬酸鹽培養(yǎng)基，標(biāo)記符號(hào)為 C4.3.3 陽性對(duì)照與陰性對(duì)照4.3.3.1 陽性對(duì)照試驗(yàn) 對(duì)各供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽性對(duì)照試驗(yàn)，加菌量為 10100cfu ,培養(yǎng)、檢查等方法按照供試品的各控制菌檢查同法進(jìn)行，陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng) 檢出相應(yīng)的控制菌；已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，在該供試品檢查時(shí)可不必再做陽性對(duì)照。4.3.3.2 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋劑10ml加入100ml （或200ml）相應(yīng)控制菌檢查用的相 應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長。4.3.4 增菌培

9、養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基2份，每份各100ml。一份加入10ml供試液（相當(dāng)于供試品 1g或1ml）,另一份加入與供試液等量的稀釋劑作為陰性對(duì)照。 溫度36C,培養(yǎng)824hr, 必要時(shí)可延至48hr。陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長。4.3.5 快速生化試驗(yàn)4.3.5.1 取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMUGW養(yǎng)基的試管內(nèi)，溫度 36c培養(yǎng)，于 5hr和24hr時(shí)在366nm紫外燈光下觀察，同時(shí)用未接種的MUGg養(yǎng)基作為本底對(duì)照。在 紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈藍(lán)白色熒光，則為 MUG日性；不呈現(xiàn)熒光，則為 MU制性。4.3.5.2 觀察后，沿著培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，若液面呈玫瑰紅色，則為靛

10、基質(zhì)陽性；若呈試劑本色，則為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照的MUG口靛基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)為陰性。4.3.5.3 如果MUG日性、靛基質(zhì)陽性，則判供試品檢出大腸埃希菌；如果MUCK性、靛基質(zhì)陰性，則判供試品未檢出大腸埃希菌。4.3.6 分離培養(yǎng)第4頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.6.1 如果呈現(xiàn)MUG日性、靛基質(zhì)陰性或者 MUCK性、靛基質(zhì)陽性時(shí)，則應(yīng)將上述供 試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)蘸取 12環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB MacC平板上， 溫度36c培養(yǎng)1824hr。4.3.6.2 觀察平板，若EMBm

11、MacC平板上無菌落生長或生長的菌落與大腸埃希菌菌落 形態(tài)特征不符，則判供試品未檢出大腸埃希菌。4.3.6.3 觀察平板，當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈典型菌落生長時(shí)，若 EMB| MacC平板上生長 的菌落與大腸埃希菌菌落形態(tài)特征相符或疑似時(shí)，應(yīng)挑取可疑菌落23個(gè)以上菌落分別 進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗(yàn)，確認(rèn)大腸埃希菌。4.3.6.4 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征菌落形態(tài)EMB呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心， 圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常后金屬光澤MacC鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形、扁平，邊緣整齊，表面光滑， 濕潤4.3.7 純培

12、養(yǎng)4.3.7.1 如果EM嗽MacC板上生長的菌落與大腸埃希菌菌落形態(tài)特征相符或疑似時(shí)， 以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，蘸取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個(gè)以上疑似菌落,分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，溫度 36c培養(yǎng)1824hr,進(jìn)行以下檢查。4.3.7.2 如果平板上無單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（如呈紫黑色或有金屬光澤），則 應(yīng)蘸取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EMB MacC平板,溫度36c培養(yǎng)1824hr,再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，進(jìn)行以下檢查。4.3.8 革蘭氏染色、鏡檢4.3.8.1 以接種環(huán)蘸取無菌水于潔凈無劃痕的載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜 面新鮮培養(yǎng)物少許

13、，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰23次固定。第5頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.8.2 在載玻片的菌斑上滴加結(jié)晶紫染液，染色 1min,水洗。4.3.8.3 滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。4.3.8.4 滴加95叱醇，嚴(yán)格控制時(shí)間脫色 2030s,水洗。4.3.8.5 滴加沙黃染液，復(fù)染1min,待干后，鏡檢。4.3.8.6 鏡檢結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色；大腸埃希菌為革蘭 氏陰性短桿菌或球桿菌。4.3.9 生化（IMViC）試驗(yàn)4.3.9.1

14、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，溫度36 c培養(yǎng)2448hr,觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色，指示劑為澳麝香草酚藍(lán)者為黃色）， 產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大?。榱吮苊膺t緩發(fā)酵產(chǎn)生假陰性，也可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于 24hr出現(xiàn)陽性，或適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí) 問。4.3.9.2 靛基質(zhì)試驗(yàn)（I ）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白陳水培養(yǎng)基中，溫度 36c培 養(yǎng)2448hr,沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈 試劑本色為陰性。98%勺大腸埃希菌靛基質(zhì)t僉為陽性，一般 24Hr即可出現(xiàn)陽性結(jié)果， 以無菌操作先從管中取出1ml

15、或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)陰性，余下的蛋白陳水 培養(yǎng)物再培養(yǎng)24hr,做靛基質(zhì)試驗(yàn)。4.3.9.3 甲基紅試驗(yàn)（M 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基中，溫 度36c培養(yǎng)48及hr,于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液 23滴（約每1ml培養(yǎng)液1滴）， 輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。4.3.9.4 乙酰甲基甲醇生產(chǎn)試驗(yàn)（V-P）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基中，溫度36c培養(yǎng)48支hr,于2ml培養(yǎng)液中加入a-蔡酚乙醇試液1ml,混勻， 再加40%6氧化鉀試液0.4ml,充分振搖，在4hr （通常在30min時(shí)）內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽 性，無紅色判

16、為陰性。第6頁/共7頁控制菌大腸埃希菌檢查操作規(guī)程文件類型操作規(guī)程（SOP文件編號(hào)編訂依據(jù)中國約典2010年版、GMP 2010年版替代文件4.3.9.5 枸檬酸鹽利用試驗(yàn)（C）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上， 溫度36c培養(yǎng)24天,培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，判為陽性， 培養(yǎng)基顏色無變化、無菌苔生長，判為陰性。4.4結(jié)果判定4.4.1 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽性對(duì)照試驗(yàn) MU（陽性、靛基質(zhì)陽性，供試品 MUG日 性、靛基質(zhì)陽性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；供試品 MU制性、靛基質(zhì)陰 性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。4.4.2 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽性對(duì)照試驗(yàn) MUG1陽性、靛基質(zhì)陽性，供試品 MUG日 性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗(yàn)為“-+ -”、革蘭氏陰性桿菌，報(bào)