雞肝中過氧化氫酶提取,和大腸桿菌質(zhì)粒提取

1、大腸桿菌中質(zhì)粒的小量提取及核酸電泳摘要：采用堿裂解法將大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子進(jìn)行分離和純化，將分離純化后的質(zhì)粒DNA分子進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外成像儀中觀察DNA條帶，以測定所得到的質(zhì)粒DNA片段的分子量大小。結(jié)果表明，成功從大腸桿菌中提取出質(zhì)粒DNA分子，其分子量大小約為2000bp。關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA分子；堿裂解法；分子量；電泳引言質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在堿性電泳緩沖液中帶負(fù)電荷，所以

2、在外加電場作用下會向正極遷移。將提取到的DNA分子提取液中加入核酸染色劑，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，利用紫外燈照射即可觀察到所提取的DNA條帶，第一泳道加入合適的Marker與之進(jìn)行比對，即可較為準(zhǔn)確地估測出所提取出的質(zhì)粒DNA分子量。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料(1) 含質(zhì)粒Psd-T19的大腸桿菌 (2) 試劑：細(xì)菌質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖，電泳緩沖液（TAE），核酸電泳上樣緩沖液（6×），標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA等。1.2 實(shí)驗(yàn)儀器微量移液器、試管、微波爐、離心機(jī)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、天平。1.3 質(zhì)粒的提?。ㄐ×吭噭┖刑崛。?1) 首先取1.5ml混勻的菌液于1.5ml離心管中，

3、臺式離心機(jī)中12000r/m離心1min，棄上清液得到大腸桿菌菌體；(2) 按照試劑盒提取的步驟提取出大腸桿菌質(zhì)粒DNA。1.4 核酸電泳(1) 制備1%瓊脂糖凝膠，并添加GoldVied I核酸染料；(2) 加樣：在離心管中混合DNA樣品2-3ul和1ul上樣緩沖液。采用梯度上樣，上樣量分別為2ul、4ul、6ul、8ul和5ulDNA分子量標(biāo)記；(3) 電泳：120V，40min； (4) 觀察：將電泳后的凝膠放置于透射紫外光下進(jìn)行觀察，對照分子量標(biāo)記判斷DNA樣品的分子量大小。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析大腸桿菌在37恒溫?fù)u床中220r/min培養(yǎng)24h，離心收集菌液收集菌液，之后按照試

4、劑盒的操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取純化，最后進(jìn)行核酸電泳，電泳圖如圖1-1所示。其中1,2,3,4分別代表質(zhì)粒的上樣量分別為2µL，4µL，6µL，,8µL，M代表5µL標(biāo)準(zhǔn)品。DNA分子的分子量、分子構(gòu)型的差異和所帶電荷多少，都會影響電場中其遷移速率，另外瓊脂糖凝膠的濃度、電壓大小、緩沖液pH和電泳時的溫度等也影響遷移率，從而使DNA分子在凝膠中出現(xiàn)不同的區(qū)帶。如圖1-1所示，從大腸桿菌中提取的質(zhì)粒DNA分子的分子量大小為2000bp，梯度上樣的對比結(jié)果表明最適上樣量為6ul。圖1-1 1核酸電泳圖3結(jié)論所提取的質(zhì)粒DNA分子量為2000kb，瓊脂糖

5、凝膠電泳最適上樣量為6ul。參考文獻(xiàn)1 葉楓,董興齊,彭何碧.四種提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA方法的比較J.地方病通報(bào),1994,9(4):66.2 黃永蓮.瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究J.湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(6):83-85.雞肝中過氧化氫酶的提取、分離及檢測摘要：為得到雞肝中的過氧化氫酶，首先從肝中提取可溶性的蛋白質(zhì)，并測定其蛋白質(zhì)的含量和過氧化氫酶的活力；然后采用硫酸銨分級鹽析及透析，并測定過氧化氫酶活力；最后采用SDS-凝膠電泳鑒定過氧化氫酶的純度和測定其分子量。選用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量，利用分光光度計(jì)測定過氧化氫酶活力。結(jié)果表明，純化后過氧化氫酶的總活性是477

6、4U，比活性是155.43 U/(mg.N)，回收率是34%，純化倍數(shù)是4.88，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定的蛋白質(zhì)含量是15.41 mg/ml，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量是。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)含量；酶活力；鹽析及透析引言過氧化氫酶（Catalase， CAT）是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶1。其普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動物的肝和紅細(xì)胞中，其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理2，其次過氧化氫酶的應(yīng)用也十分廣泛3。CAT在不同的組織中其活性水平高低不同。過氧化氫在肝臟中分解速度比在腦或心臟等器官快，就是

7、因?yàn)楦沃械腃AT含量水平高4?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液，用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行吸光值的測定，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中蛋白質(zhì)含量5。酶活力單位指每毫升樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmolH2O2 降解定義為一個酶活力單位。過氧化氫酶檢測試劑盒(Catalase Assay Kit)是一種簡單易行的

8、通過顯色反應(yīng)來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中過氧化氫酶(Catalase)活性的試劑盒。 過氧化氫酶的活性可以用紫外分光光度計(jì)測定A240，H2O2在240nm有特征吸收峰，CAT能夠分解H2O2，使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT活性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪

9、失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小6。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。1材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料(1) 新鮮雞肝、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、透析袋。(2) 試劑

10、：硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、過氧化氫酶檢測試劑盒、聚丙烯酰胺、SDS、TEMED、4%濃縮膠、12%分離膠、樣品緩沖液、染色液、脫色液、電泳緩沖液。1.2 實(shí)驗(yàn)儀器可見分光光度計(jì)、研缽、冷凍離心機(jī)、電泳儀、垂直板電泳裝置。1.3 水浸提法提取過氧化氫酶(1) 肝臟研磨液的制?。?(2) 水浸提法提取過氧化氫酶 按研磨液與水的體積比為1:5計(jì)算，加入相應(yīng)體積的樣品提取緩沖液浸提，浸提溫度為25，浸提時間為5 h左右。4 10000r/min離心20 min，得上清液備用；(3) 將上清液分為3份：一份用于測總蛋白含量及過氧化氫酶活性；一份保存冰箱中用于最后SDS-PAGE

11、電泳；另取一份用于鹽析、透析等。1.4 過氧化氫酶粗酶液的分級鹽析及透析(1) 將硫酸銨研磨成粉末加入粗酶液中，使達(dá)40%飽和度（使大部分雜蛋白沉淀），在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入，然后置冰箱放置12h。(2) 12000 r/min冷凍離心20min。收集上清液S1（取部分上清液測總蛋白及酶活力）。上清液中再加入硫酸銨使達(dá)80%飽和度，放置1h左右，12000r/min冷凍離心20min，收集上清液S2（取部分上清液測總蛋白及酶活力）。(3) 將第二次離心的沉淀復(fù)溶于1/20原始體積的緩沖液中，裝入透析袋中，用大量的此緩沖液在冰箱中進(jìn)行透析過夜（4），其間更換緩沖溶液約3-4次，直至無白色沉淀

12、析出為止（用BaCl2溶液檢查）。透析完畢后，將提取液保存于冰箱中備用，取部分提取液測總蛋白及酶活力，也留部分進(jìn)行SDS電泳。1.5 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量1.5.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5.2樣品測定取一支試管，加入末知濃度稀釋20倍的蛋白質(zhì)溶液1ml，考馬斯亮藍(lán)G250試劑5ml，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A595nm。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得末知蛋白濃度。1.6 過氧化氫酶活力的測定(1) 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到240nm，蒸餾水調(diào)零。(2) 測定前將CAT檢測工作液25水浴10

13、min。(3) 加入10ul樣本和190ul工作液，混勻5s并立即計(jì)時，記錄240nm下初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2。CAT（U/ml）=反應(yīng)液總體積÷樣本體積÷反應(yīng)時間÷H2O2消光系數(shù)（43.6×10-3）×A=459×A1.7 SDS-PAGE電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(1) 配膠：4%濃縮膠、12%分離膠。(2) 制備凝膠板：混合分離膠各組分，用移液管快速加入分離膠，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置至溶液聚合。(3)加樣樣品在沸水中加熱5min，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合，上樣量10ul。(4) 電泳：開始電壓恒定在70V

14、，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為150V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約1cm時，停止電泳。(5) 凝膠板剝離與染色：取出凝膠板，加入染色液，染色30min左右。(6) 脫色：蒸餾水漂洗，脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定的牛血清蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0062x+0.0072(R2=0.9985)，標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖如圖1所示。圖1牛血清蛋白含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖表1酶 液酶液總體積（ml）蛋白質(zhì)（mg/ml）酶活性（U/ml）總活性（U）比活性U/(mg.N)回收率（%）純化倍數(shù)粗酶液577.662441391231.851001上清S1595.371901121035.38811.11上清S2550.95/透析后1115.4123954774155.43344.883結(jié)論參考文獻(xiàn)1劉昌玲,王國慶.細(xì)菌過氧化氫酶的分離結(jié)晶及性質(zhì)J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1900,17(5):380-383.2黃永洪,花慧,等.豬肝過氧化