qPCR試驗(yàn)操作流程演示教學(xué)

1、qPCR實(shí)驗(yàn)操作流程精品文檔Q-PCR實(shí)驗(yàn)流程1、 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備,每天早上到實(shí)驗(yàn)室后,先把超凈工作臺(tái)的紫外燈翻開15-20分鐘.超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn),需佩戴干凈的橡膠手套 /一次 性薄膜手套,RNA抽提需帶口罩.取EP管/槍頭時(shí)需用銀子,不 可以用使用過的手套直接取用.取完 EP管/槍頭后,袋子及時(shí)封 好.橡膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外,實(shí)驗(yàn)操作過程中不得帶出 超凈臺(tái),移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程,并用 75%乙醇清 潔移液器,槍頭盒及超凈臺(tái)面.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過程中或觀看實(shí)驗(yàn) 時(shí),沒有帶口罩不要在超凈臺(tái)前講話.2、 總RNA抽提1細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用1*PBS洗兩次后,用1ml槍將PBS吸干 凈,參

2、加1ml Trizol Invitrogen溶液,吹打混勻,并吸至 1.5ml RNase free EPW中使細(xì)胞充分裂解,室溫靜置 5min；組織樣品用液氮充分研磨,參加1ml Trizol Invitrogen溶液,混 勻,室溫放置5min使其充分裂解；管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱2參加200小氯仿,劇烈振蕩混勻30s,使水相和有機(jī)相充分接觸,室 溫靜置3-5min ；離心時(shí)離心管按順序排放,離心完畢,離心管的 順序也按順序排好,與第一步的順序一致3 4c下,14,000g離心15min,可見分為三層,RNA在上層水相,移 至另一個(gè)新的 RNase free EPt；用20-200ul的槍

3、吸取上清.吸上清 時(shí). 槍頭應(yīng)沿著液面 上層吸取 卜:青. 槍頭不可碰至h 吸至U中 間層收集于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系治理員刪除精品文檔4沉淀RNA:參加等體積異丙醇,輕柔地充分混勻顛倒 6-8次不應(yīng)用振蕩器混勻,室溫靜置 10min；5） 4c下,14,000g離心10min,收集RNA沉淀如離心后仍不見EP管底部有沉淀,應(yīng)將 EP管放置在-80度冰箱過夜,繼續(xù)在4c下,14,000g離心10min,收集RNA沉淀,去上清；6） 用75%乙醇洗滌兩次12,000g離心5min參加乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可,不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀,超凈臺(tái)風(fēng)干;沉淀不能過干或過濕,過干那么不易溶解,過濕那

4、么乙醇?xì)埩?7） 視沉淀量參加適量DEPC水至少15ul溶解沉淀.三、去基因組使用RNase-free的DNase ? Promegaj,按以下體系配置反響液,37 c 消化 30min, 65 c 滅活 10min.RNA30DNase ?2010 x buffer10H2O(RNase free)39.5RNasin0.5總體積100然后按以下步驟操作：1參加等體積的苯酚/氯仿,上下顛倒混勻,室溫放置 5min,后14,000rpm,離心 15min,取上清.2參加等體積的氯仿,上下顛倒混勻,靜置分層后14,000rpm,離心15min,取上清.3參加等體積異丙醇,輕柔地充分混勻顛倒 6-

5、8次,-20C靜置15min ；收集于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系治理員刪除精品文檔4） 4c下,14,000g離心15min,收集RNA沉淀,去上清；5） 用75%乙醇洗滌兩次12,000g離心5min,超凈臺(tái)風(fēng)干；6） 參加適量DEPC水至少15ul溶解沉淀.四、總RNA純度和完整性檢測(cè)1純度檢測(cè)：取1 QRNA樣品50倍稀釋,在核酸蛋白檢測(cè)儀上測(cè)定 OD值, OD260/OD280的比值大于1.8,說明制備的RNA較純,無蛋白質(zhì)污染.2總RNA完整性檢測(cè)：取RNA樣品1口1 %瓊脂糖凝膠電泳80VX20min, EB染色10min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照,總 RNA的5s rRNA, 18s

6、rRNA和28s rRNA條帶,三條條帶完整的話即可證實(shí)總 RNA抽提比擬完 整.五、逆轉(zhuǎn)錄1. mRNA :1在RNase free的PCR管中配置以下溶液.-Total RNA10H2Opl總體積122將上述溶液吹打均勻,置 85c保溫5min,使RNA變性.隨后立即冰上致冷,以預(yù)防RNA復(fù)性；3在該P(yáng)CR管中參加以下試劑Promega收集于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系治理員刪除精品文檔oligo (dT)0.5Random primer0.510mM dNTP2.0RNase inhibitor0.55 x buffer4.0M-MLV0.5總體積8.0d4)將上述20仙反響溶液30c保溫10m

7、in；5) 42 c 保溫 50min；6) 85 c 保溫 10min；7) -20 C 保存.2. microRNA :使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法,原理如以下圖:COMA與加p 2:Rsal-time PCRForward primerReverseprlm-tr1)在去RNase的PCR管中配置以下溶液total RNAX個(gè)miR逆轉(zhuǎn)錄引物H2O1.00.5*X聞 d總體積12.5收集于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系治理員刪除精品文檔2)將上述溶液混勻,85c孵育5min,以翻開RNA二級(jí)結(jié)構(gòu).隨后立即置于冰上,以預(yù)防RNA復(fù)性再次恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)；3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM d

8、NTP (promega)2.0RNase inhibitor (promega)0.5U6逆轉(zhuǎn)錄引物0.55x buffer4.0M-MLV (promega)0.5總體積7.5pl4) 將3)溶液參加到1)溶液中,混勻后30c保溫10min；5) 42 c 孵育 50min；6) 85c孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶.四、定量PCR檢測(cè)1 .引物測(cè)試：根據(jù)mRNA設(shè)計(jì)的引物正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行qPCR測(cè)試其特異性和擴(kuò)增效率,具體反響體系和反響條件如正式實(shí)驗(yàn),每對(duì)引物需做模板水對(duì)照.得到結(jié)果后,首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性,選擇標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)畏迩曳逍纹⑺畬?duì)照無明顯引物二聚體熔解曲線峰.假設(shè)設(shè)計(jì)的多

9、對(duì)引物熔解曲線均 顯示特異性良好,那么應(yīng)比照各引物的擴(kuò)增曲線,優(yōu)先選擇Ct值小、擴(kuò)增效率高的引物進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn).收集于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系治理員刪除精品文檔2 .確定上機(jī)內(nèi)容后,首先在記錄本上編排好上機(jī)的樣品排放順序.1 一個(gè)樣品的加樣盡可能安排在同一行2如正式實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)不能安排在同一板 上,那么需把三次重復(fù)中的實(shí)驗(yàn)分開,但同一次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)不能分開兩板3 .正式實(shí)驗(yàn)：體系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul TOYOBO使用前需振蕩均勻上游引物0.5ul 10uM下游引物0.5ul 10uM總體積15ul計(jì)算好實(shí)驗(yàn)中需用多少份體系,那么按具體量配置.

10、體系分裝會(huì)有損失,一 般多配0.5份-1份體系.總的體系配好后,在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻、然后 15ul每管 分裝至8連管中.3 . cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛?一般為 1:20稀釋,如遇到基因表達(dá)低的 樣品,那么適當(dāng)降低稀釋比例至1:10或1:5.cDNA按一定順序排好后,即可加至 剛配好的反響體系中.加樣完畢,蓋好八連管蓋,并在八連管蓋最上沿的邊上 標(biāo)記好1-12的順序不可將標(biāo)記寫在反響管的蓋子上,八連管蓋預(yù)防裸手觸摸 中間透明的熒光采集區(qū)域,且保證每孔均蓋緊,否那么影響重復(fù)性或可能出現(xiàn)熔 解曲線峰漂移.4 .把各排八連管放在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒.收集于網(wǎng)絡(luò),如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系治理員刪除精品文檔五.上機(jī)：5.1 先開電腦,進(jìn)入 Windows界面.接著翻開PCR儀電源開關(guān).5.2 翻開7500軟件,選擇“新建,template下拉菜單中選擇60或65 普 通基因檢測(cè)為60,MicroRNA檢測(cè)為65 5.3 翻開樣品架,放入八連管,關(guān)上樣品架,并在軟件上選擇已放反響管的孔位,剔除無反響管的孔位.5.4 點(diǎn)擊File菜單中Save,輸入要保存結(jié)果的文件名,命名為日期-上機(jī)時(shí)間-客戶名字簡(jiǎn)寫,如100830-1008-WL表示8月30日10點(diǎn)08分魏立的實(shí)驗(yàn).5.5 點(diǎn)擊Start鍵,開始運(yùn)行程序.5.6 程序運(yùn)行完畢后,取出樣品架上