細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)

1、細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞部分動(dòng)物細(xì)胞部分實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)安排：第九周 實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的器材準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)用液的配制及過濾除菌 第十周 實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)四 動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)五 培養(yǎng)細(xì)胞的超低溫凍存第十一周 實(shí)驗(yàn)六 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)七 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性測定第十二周 實(shí)驗(yàn)八 動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)（大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)）細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 是在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境（溫度、pH值、營養(yǎng)條件等）使從體內(nèi)取出的細(xì)胞生存、生長繁殖的技術(shù)方法。原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 又叫初代培養(yǎng)，是指從動(dòng)物或人體內(nèi)取出細(xì)胞，經(jīng)過一定的處理和分離，置于適當(dāng)?shù)钠髅蠡蚺?/p>

2、養(yǎng)基等條件下，培養(yǎng)至第1次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段。P17傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 是指原代培養(yǎng)細(xì)胞在適應(yīng)體外條件下后持續(xù)生長增殖，達(dá)到一定細(xì)胞密度后，需要將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)器皿以一定的比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有新鮮培養(yǎng)基的器皿中的這樣一個(gè)過程稱為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)及不足之處原代細(xì)胞培養(yǎng)的生命歸宿 1.原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期：有細(xì)胞分裂，不旺盛；原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和動(dòng)能活動(dòng)上相似性大；細(xì)胞群呈異質(zhì)性 2. .傳代期傳代期：持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞增殖旺盛 3.3.衰退期衰退期：細(xì)胞增殖緩慢或不增殖；細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，最后衰退死亡培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式 1.貼壁依賴型貼壁依賴型：必須貼附于支持物表面才能生長

3、，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞都屬于貼附生長型。 2.懸浮生長型懸浮生長型：見于少數(shù)造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞，胞體呈圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長，這類細(xì)胞容易大量繁殖。培養(yǎng)過程中需定期搖勻，使細(xì)胞與培養(yǎng)基充分接觸。每代貼壁細(xì)胞的生長過程1.游離期游離期 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)，胞體呈圓形，持續(xù)時(shí)間約為10分鐘-4小時(shí)2.貼壁期貼壁期 細(xì)胞附著于培養(yǎng)介質(zhì)上，游離期結(jié)束，細(xì)胞株一般在10分鐘-4小時(shí)貼壁，初代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁慢，可長達(dá)24小時(shí)或者更多。3.潛伏期潛伏期 此期細(xì)胞有生長活動(dòng)，少有細(xì)胞分裂，基本無增殖。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。細(xì)胞株潛伏期一般為6-24小時(shí)。4.對數(shù)生長期

4、對數(shù)生長期 細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)刻，細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，細(xì)胞活力最佳，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)期。5.停滯期停滯期 細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和狀態(tài)，細(xì)胞雖有活力但不再分裂，細(xì)胞數(shù)量不再增加，應(yīng)盡早傳代。發(fā)生機(jī)制：接觸抑制，密度依賴。培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件1.營養(yǎng)需要：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、促生長及促粘附因子2.生存條件：溫度 370.5 氣體條件 5%CO2 pH值條件 7.2-7.4 滲透壓：等滲3.無污染4.無毒 實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的器材準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?.了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的潔凈要求，建立無菌操作的概念。2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的材料準(zhǔn)備過程。3.掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制和酸堿度調(diào)節(jié)方法。實(shí)驗(yàn)原理

5、實(shí)驗(yàn)原理：準(zhǔn)備內(nèi)容：1.實(shí)驗(yàn)用品的洗滌、包裝和滅菌 2.準(zhǔn)備酒精棉球，整理超凈臺(tái) 3.配制PBS KH2PO4 0.24g Nacl 8.0g KCl 0.2g NaHPO4 1.44g 加適量純水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.4，定容至1000ml實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物培養(yǎng)用液的配制及過濾除菌培養(yǎng)用液包括：培養(yǎng)基（需要添加血清） 消化液 平衡鹽溶液一、培養(yǎng)基 現(xiàn)在多采用合成培養(yǎng)基，其成分包括氨基酸、葡萄糖、維生素、無機(jī)鹽及一些促生長因子、促貼壁因子等。常用的有RPMI1640、DMEM等。二、血清 多使用胎牛血清或優(yōu)質(zhì)小牛血清三、消化液 常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA以及膠原酶溶液，以胰蛋白酶使用最多。酶液

6、用于解離細(xì)胞間的蛋白質(zhì)、膠原等，使細(xì)胞離散。EDTA是二價(jià)螯合劑，能結(jié)合鈣離子、鎂離子，使以來鈣離子的的鈣粘著蛋白失活而使細(xì)胞解離。四、平衡鹽溶液 如PBS、Hanks液等酚紅對pH值的指示： pH值6.5 黃色 pH值7.0 橘紅色 pH值7.4 紅色 pH值7.8 紫紅色細(xì)胞生長的最適pH值范圍：7.2-7.4實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.濾器的安裝和消毒2.0.25%胰酶：0.25g胰蛋白酶溶于適量PBS中，調(diào)節(jié)pH值至7.6，定容至100ml，過濾除菌。3.1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：1包（10.4g）溶于適量純水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，完全溶解后定容至1000ml，過濾除菌。4.1640完全培

7、養(yǎng)基的配制: 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基 85ml 血清 15ml 雙抗(青霉素和鏈霉素) 0.5ml實(shí)驗(yàn)三 動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)一（胰酶消化法） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的基本方法和操作過程。2、了解原代培養(yǎng)細(xì)胞觀察的方法。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)可分為組織塊培養(yǎng)法和消化法。 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1.將大鼠頸椎脫臼處死，置醫(yī)用酒精中泡23分鐘，取大鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)，置平皿中，解剖取肝臟，置于一新的平皿中。2

8、.用 Hanks液 洗滌三次，并剔除脂肪、結(jié)締組織血液等雜物。3.用一新的手術(shù)剪將肝臟剪成小塊，再用Hanks液 洗三次，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。4.視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37消化20-40分鐘，每隔5分鐘震蕩一次。5.加入3-5ml培養(yǎng)基以終止胰酶消化作用。6.靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到10ml離心管中。7.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。8.加入Hanks液 5ml，重懸細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。9.加入適量培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1、自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。 2、在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、

9、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。 3、凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。 無菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng)無菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng) 1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3、操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。 4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。 5、瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6、吸溶液的吸

10、管等不能混用。 實(shí)驗(yàn)四 動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)二（大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)） 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓內(nèi)的一種多能干結(jié)締組織前體細(xì)胞，具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下能分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。在胚胎發(fā)育過程中，軟骨、骨、肌肉、肌腱、脂肪、神經(jīng)和髓基質(zhì)等多種間充質(zhì)組織由中胚層細(xì)胞分化而來，這些前體細(xì)胞具有干細(xì)胞特性而被定義為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymai stem ceiis，MSC)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中的非造血干細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1.將大鼠頸椎脫臼處死，置醫(yī)

11、用酒精中泡23分鐘，取大鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)，置平皿中，無菌條件下完整取出雙側(cè)股骨 。2.在另一平皿中倒入適量PBS，將股骨浸泡于PBS中，無菌條件下剔除肌肉和脂肪組織。 3.暴露股骨骨骺端，經(jīng)PBS沖洗干凈后剪去兩端干骺端，暴露骨髓腔。4.用注射器吸取2ml 1640完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，沖洗液收集在小燒杯中收集細(xì)胞，反復(fù)沖洗，直至沖出的液體發(fā)白為止。5.加入適量新鮮培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置5% CO、37飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆召N壁細(xì)胞傳代的方法。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶增殖到一定密度后，細(xì)胞的生長和分裂的速度就會(huì)

12、減慢甚至停止，如不及時(shí)分離、傳代，細(xì)胞將逐漸衰老死亡。為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟： 1、在超凈臺(tái)內(nèi)的酒精燈旁，將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去，加入37預(yù)溫的PBS，輕輕振蕩漂洗1-2次。 2、加入適量 0.25胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。蓋上瓶蓋，在37消化2-3min。 3、倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入5ml培養(yǎng)液終止消

13、化。 觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為13分鐘。 4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另1瓶中，蓋上瓶蓋，在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，（細(xì)胞種類、日期等）置37下繼續(xù)培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)七 培養(yǎng)細(xì)胞的超低溫凍存與復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞凍存和復(fù)蘇的方法。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，為防止細(xì)胞株不斷傳代引起的細(xì)胞老化、支原體污染、染色體和基因的變異等現(xiàn)象的發(fā)生，可以通過凍存技術(shù)保存細(xì)胞。在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變

14、、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞，減少冰晶的形成。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的50，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：（一）細(xì)胞凍存1、超凈臺(tái)中消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)基。4、將懸液分至凍存管中，每管0.8 ml。旋緊凍存管管蓋。5、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞種類，凍存日期。6、按下列順序降溫：室溫4（20分鐘冰箱冷

15、凍室（30分鐘）低溫冰箱（30 1小時(shí)）氣態(tài)氮（30分鐘）液氮。（二）細(xì)胞復(fù)蘇1、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37的溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。3、在超凈臺(tái)中用75%乙醇擦拭凍存管外壁并打開，用吸管將細(xì)胞懸液吸到離心管中。4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。5、沉淀加入適量培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)八 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法2、掌握細(xì)胞細(xì)胞活力測定的方法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下

16、要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。細(xì)胞活性測定方法：1.染料排斥法：如臺(tái)盼蘭法，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞著色。2.FDA-PI雙色熒光鏡檢法：活細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色熒光，熒光越強(qiáng)，細(xì)胞活性越高；死細(xì)胞呈橘紅色熒光。3.MTT法：活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使四甲基偶氮唑鹽（MTT）分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。 4.Cell blue法：活細(xì)胞可將氧化還原染料刃天青轉(zhuǎn)化為紅色