羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序doc

1、羅氏公司 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序作者： Roche發(fā)表于： 2009-03-0614:54來源：丁香園（In situcelldeathdetectionkit-POD 法）一、 原理：TUNEL（TdT-mediateddUTP nick end labeling ）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA 的斷裂情況。其原理是熒光素（ fluorescein ）標(biāo)記的 dUTP 在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（ TdT Enzyme ）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂 DNA 的 3-OH 末端，并與連接辣根過氧化酶（ HRP ，horse-radishpero

2、xidase ）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP 底物二氨基聯(lián)苯胺（ DAB ）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞， 因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞； 由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有 DNA 斷裂，因而沒有 3-OH 形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本 （石蠟包埋、冰凍和超薄切片） 和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。 還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)， 以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。二、 器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；

3、試劑：試劑盒含 TdT 10×、熒光素標(biāo)記的 dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP ；自備試劑： PBS 、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（ 100 、95 、90、80、70% ）、DAB 工作液（臨用前配制， 5 l 20× DAB+1 L 30%H2O2+94 l PBS ）、 Pr oteinase K 工作液（ 10- 20 g/ml in 10 mM Tris/HCl ， pH 7.4-8 ）或細(xì)胞通透液（ 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodiumcitrate ，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、 DNase 1（3000 U/ml

4、3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5 ， 10mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。三、 實(shí)驗(yàn)步驟操作流程圖： 制作石蠟切片 脫蠟、水合 細(xì)胞通透 加 TUNEL 反應(yīng)液 加 converter- POD 與底物 DAB 反應(yīng)顯色 光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。具體操作步驟：1. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min ；2. 用梯度乙醇（ 100 、95 、90、 80、70% ）各浸洗 1 次，每次 3min ；3. PBS 漂洗 2 次；4. 用 Proteinase K 工作液處理組織 15-30 min 在 21 37°C（溫度、時(shí)間、濃度均需

5、摸索）或者加細(xì)胞通透液 8min ；5. PBS 漂洗 2 次；6. 制備 TUNEL 反應(yīng)混合液，處理組用 50 l TdT+450 l 熒光素標(biāo)記的 dU TP 液混勻；而陰性對(duì)照組僅加 50 l 熒光素標(biāo)記的 dUTP 液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入 100l DNase 1，反應(yīng)在 1525 ×10min ，后面步驟同處理組。7. 玻片干后，加 50 l TUNEL 反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加 50 l 熒光素標(biāo)記的 dUTP 液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ×1h。8. PBS 漂洗 3 次；9. 可以加 1 滴 PBS 在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光

6、波長(zhǎng)為450500nm ，檢測(cè)波長(zhǎng)為 515565nm ）；10. 玻片干后加 50 l converter -POD 于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng) 37×30min 。11. PBS 漂洗 3 次；12. 在組織處加 50100 lDAB 底物，反應(yīng) 1525 ×10min ；13. PBS 漂洗 3 次；14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染， 幾秒后立即用自來水沖洗。 梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15. 加一滴 PBS 或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì) 200 500 個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷 （未染色細(xì)胞變

7、小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象， 晚期出現(xiàn)凋亡小體， 貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、 變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）四、 注意事項(xiàng)1. 進(jìn)行 PBS 清洗時(shí)，每次清洗 5 min 。2. PBS 清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行， 這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體， 又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。4. TUNEL 反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。5. 如果 20×DAB 溶液顏

8、色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6. 用甲基綠（ Methyl Green ）染液（ 3-5% 甲基綠溶于 0.1M 醋酸巴比妥PH4.0 ）染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100% 乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用8090% 的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。7. 熒光素標(biāo)記的 dUTP 液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。8. 試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20 （ -1525 ）； converter-POD 液一旦解凍，以后就保存在4（ 28）下，至少在 6 m 內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存； TUNEL 反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上