微生物菌種保藏技術(shù)

1、微生物菌種保藏技術(shù) 微生物具有簡(jiǎn)單變異的特性，因此，在收藏過程中，必需使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，因此，菌種收藏辦法雖多，但都是按照這3個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。國(guó)際國(guó)內(nèi)常用的菌種保存辦法包括傳代培養(yǎng)法、液態(tài)石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法、-80冰箱凍結(jié)法、液氨超低溫凍結(jié)法。 (一)傳代培養(yǎng)收藏法 將菌種接種在相宜的固體斜面培養(yǎng)基上或穿刺接種于半固體培養(yǎng)基(細(xì)菌；養(yǎng)分瓊脂；真菌：pda；：mrs培養(yǎng)基；：庖肉培養(yǎng)基；嗜鹽性弧菌：含3% nacl的tsa或養(yǎng)分瓊脂)，在相宜的溫度下培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，移至28的冰箱中收藏。棉塞部分用油

2、紙包扎好，使微生物在低溫下維持很低的新陳代謝，緩慢生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基中的養(yǎng)分物被逐漸耗盡后再重新移植于新奇培養(yǎng)基上，定期移植的間隔時(shí)光依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存24個(gè)月，移種一次。2個(gè)月移種一次，細(xì)菌最好每月移種一次。 此法為試驗(yàn)室和工廠常用的收藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作容易，用法便利，不需特別設(shè)備，能隨時(shí)檢查所收藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是簡(jiǎn)單變異，由于培養(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝轉(zhuǎn)變，而影響微生物的性狀，污染雜菌的機(jī)會(huì)也較多。 (二)甘油管收藏法 取細(xì)菌培養(yǎng)物于保存管中，按1：1的體積比例加入40%滅菌甘油，振蕩使甘油分布勻稱，

3、密封，在液氮中凍結(jié)后再轉(zhuǎn)至-20或-80長(zhǎng)久保存。 (三)液態(tài)石蠟收藏法 液態(tài)石蠟收藏法是建立在傳代培養(yǎng)收藏法之上的，能夠適當(dāng)延伸收藏時(shí)光。將菌種斜面接種或半固體穿刺接種，待其充分生長(zhǎng)后，以無菌操作將滅菌液態(tài)石蠟加入，加入的量以高出斜面頂端或半固體培養(yǎng)基表面1cm為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。棉塞外包牛皮紙或換上無菌橡皮塞，將試管豎立放置于低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)光還要長(zhǎng))。石蠟油的滅菌除水：將液態(tài)石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121滅菌30min，延續(xù)滅菌2次，然后在40溫箱中放置2周(或置于105110烘箱中烘2h)，使水汽蒸發(fā)掉，除凈水分的石蠟油呈

4、勻稱透亮狀液體。 此法有用，且效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可收藏2年以上不死，酵母菌可收藏12年，普通無芽孢細(xì)菌也可收藏1年左右。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作容易，不需特別設(shè)備，且不需常常移種。缺點(diǎn)是保存時(shí)必需豎立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶。 注重事項(xiàng)： (1)溫度。按照菌株特性在相宜的溫度下收藏。如副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌等致病弧菌，室溫(2123)保存，不能冷藏。 (2)氧氣。按照菌株特性收藏在相應(yīng)的氧氣環(huán)境中，如厭氧環(huán)境、微需氧環(huán)境。 (3)當(dāng)用液態(tài)石蠟收藏法時(shí)，應(yīng)對(duì)需收藏的菌株做一定的預(yù)試驗(yàn)，由于某些菌株能利用石蠟為碳源，還有些菌株對(duì)液態(tài)石蠟收藏敏感。 (四)液氮冷凍收藏法 (1)預(yù)備安瓿管

5、。用于液氮收藏的安瓿管，要求能耐受溫度驟然變幻而不致破碎，因此，需要采納硼硅酸鹽玻璃創(chuàng)造的安瓿管，安瓿管的大小通常用法75mm×10mm的或能容1ml液體的。 (2)加庇護(hù)劑。當(dāng)滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等簡(jiǎn)單簇?fù)淼募?xì)胞時(shí)，將空安瓿管塞上棉塞，121滅菌15min；若作保存霉菌菌絲體用，則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入庇護(hù)劑，如10%的甘油蒸餾水溶液或10%蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用121滅菌15min。 (3)接入菌種。將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有庇護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，

6、然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。 (4)凍結(jié)。將已封口的安瓿管以每分鐘下降1的慢速凍結(jié)至-30。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。 (5)收藏。將凍結(jié)至-30的安瓿管立刻放入液氮冷凍收藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮收藏器內(nèi)。液氮收藏器內(nèi)的氣相溫度為-150，液態(tài)氮內(nèi)溫度為-196。 (6)復(fù)原。培養(yǎng)收藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立刻放入3840的水浴中舉行急劇解凍，直到所有溶化后，再打開安額管，將內(nèi)容物移入相宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法除相宜于普通微生物的收藏外，也可長(zhǎng)久收藏一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物(如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體等)，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特別設(shè)備。 (五)瓷珠收藏法 該法操作極為容易，近些年得到了十分廣泛的應(yīng)用，適合試驗(yàn)室菌種的短期或中期收藏。菌種保存管主要由保存液、保存管和小瓷珠3個(gè)部分組成，保存管可耐-197低溫，保存管內(nèi)裝25個(gè)左右多孔小瓷珠，該小瓷珠表面多孔，細(xì)菌可以很便利地吸附在上面。菌種保存液特殊添加了凍存庇護(hù)液，使菌株免受溶液和冰晶損傷。操作過