人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變基因檢測(cè)試劑（PCR法）注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2021年）.doc

1、人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變基因檢測(cè)試劑（PCR法）注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2021年）附件1 人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變基因檢測(cè) 試劑（PCR法）注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則 本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，以下簡(jiǎn)稱為EGFR）突變基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。 本指導(dǎo)原則是針對(duì)EGFR突變基因檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)

2、行充實(shí)和細(xì)化。 本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。 本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。 一、范圍 本指導(dǎo)原則所述EGFR突變基因檢測(cè)試劑主要是指基于核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR法），以EGFR突變基因?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)，體外定性檢測(cè)細(xì)胞學(xué)樣本、病理組織學(xué)樣本、

3、外周血樣本或其他體液樣本提取的核酸組分中的目標(biāo)基因序列。 EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長(zhǎng)因子受體（HER）家族成員之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四個(gè)分子構(gòu)成，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域激活與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等多種信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。肺腺癌患者EGFR基因敏感突變的亞裔人群陽(yáng)性率要高于高加索人群。EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個(gè)外顯子上（1821），目前發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30

4、多種。缺失突變主要發(fā)生在外顯子19上，最常見(jiàn)的是del E746-A750，替代突變最常見(jiàn)的是發(fā)生在外顯子21上的L858R，復(fù)制或插入突變發(fā)生在外顯子20上。其中外顯子20上的T790M替代突變?yōu)橐淮鶨GFR酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI）的耐藥突變。此外，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。EGFR作為癌癥治療的分子靶標(biāo)受到普遍關(guān)注，并已陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）和?？颂婺幔↖cotinib）等TKI。 腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關(guān)信息的主要來(lái)，但大部分晚期肺癌患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)或由于種種原因

5、不能獲取腫瘤組織樣本。研究結(jié)果表明，實(shí)體腫瘤患者的外周血中存在來(lái)于凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞的游離DNA。對(duì)晚期肺癌患者，在不能獲取肺癌組織樣本時(shí)，可以選擇外周血樣本進(jìn)行EGFR突變基因檢測(cè)；如可以獲得病理組織時(shí)，建議以病理組織提取檢測(cè)結(jié)果為優(yōu)先考慮。當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，外周血樣本可以是EGFR突變基因檢測(cè)方式的重要補(bǔ)充手段之一。 本指導(dǎo)原則相關(guān)技術(shù)要求主要基于熒光探針PCR方法的EGFR突變基因試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，如基于熒光探針PCR原理的同類試劑不適用本指導(dǎo)原則部分相關(guān)技術(shù)要求，申請(qǐng)人應(yīng)闡述不適用的理由并結(jié)合自身產(chǎn)品特性提出科學(xué)合理的評(píng)價(jià)方法，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際產(chǎn)品特性選擇適合的方法或結(jié)合本指導(dǎo)原則補(bǔ)

6、充需要的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。對(duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如適用，申請(qǐng)人可參考本指導(dǎo)原則部分相關(guān)技術(shù)要求進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。 本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于EGFR基因拷貝數(shù)變化檢測(cè)、核酸序列測(cè)定、免疫組化技術(shù)、熒光原位雜交法。 EGFR病理組織學(xué)樣本和外周血樣本檢測(cè)中存在較大差異，在參考品及質(zhì)控品設(shè)置、分析p 性能評(píng)估、臨床評(píng)價(jià)要求、產(chǎn)品技術(shù)要求、產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)等多個(gè)方面均存在不同要求，為便于申請(qǐng)人對(duì)指導(dǎo)原則進(jìn)行理解，故將產(chǎn)品預(yù)期用途用于組織學(xué)樣本檢測(cè)和預(yù)期用途用于外周血樣本檢測(cè)試劑申報(bào)要求進(jìn)行分開(kāi)說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，申請(qǐng)人申報(bào)產(chǎn)品如同時(shí)包括外周血樣本和組織學(xué)樣本，

7、對(duì)于相同部分，申請(qǐng)人可合并提交注冊(cè)申報(bào)資料。如原注冊(cè)產(chǎn)品預(yù)期用途中僅為組織樣本類型，需增加外周血樣本類型，考慮到外周血樣本類型與組織樣本類型中EGFR片段長(zhǎng)度，樣本中突變比例等差異，申請(qǐng)人除完成許可事項(xiàng)變更申報(bào)資料要求，還應(yīng)提交擴(kuò)增反應(yīng)體系性能評(píng)價(jià)、外周血分析p 性能評(píng)價(jià)、外周血樣本保存及處理、臨床評(píng)價(jià)等研究資料。 申報(bào)試劑作為腫瘤個(gè)體化伴隨檢測(cè)試劑，主要用于人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）個(gè)體化治療。如申請(qǐng)人將EGFR申報(bào)試劑運(yùn)用于其他癌癥類型的研究，申請(qǐng)人可參照本指導(dǎo)原則適用的研究體系，但應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，腫瘤藥物個(gè)體化檢測(cè)試劑與治療藥物具有關(guān)聯(lián)性，申請(qǐng)人需結(jié)合EGFR突變基因檢測(cè)與治療藥物預(yù)期用途

8、所限定的癌癥類型進(jìn)行聯(lián)合評(píng)價(jià)研究。 二、注冊(cè)申報(bào)資料要求（一）綜述資料 1.產(chǎn)品預(yù)期用途。描述產(chǎn)品的預(yù)期用途，與預(yù)期用途相關(guān)的臨床背景情況。EGFR突變基因與不同人群之間的關(guān)聯(lián)，不同藥物對(duì)不同EGFR突變類型的患者治療效果描述。如適應(yīng)癥的發(fā)生率、易感人群等，相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法等。 2.產(chǎn)品描述。描述產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理，主要原材料的來(lái)及制備方法，主要生產(chǎn)工藝過(guò)程，質(zhì)控品、校準(zhǔn)品的制備方法情況。 3.有關(guān)生物安全性方面說(shuō)明。由于體外診斷試劑中的主要原材料可能是由各種動(dòng)物、病原體、人的組織和體液等生物材料經(jīng)處理或者添加某些物質(zhì)制備而成，人性材料須對(duì)有關(guān)傳染?。℉IV、HBV、HCV等）病原

9、體檢測(cè)予以說(shuō)明，并提供相關(guān)的證明文件。其他動(dòng)物及微生物來(lái)的材料，應(yīng)當(dāng)提供相應(yīng)的說(shuō)明文件，證明其在產(chǎn)品運(yùn)輸、使用過(guò)程中對(duì)使用者和環(huán)境是安全的，并對(duì)上述原材料所采用的滅活等試驗(yàn)方法予以說(shuō)明。 4.有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)。 5.其他。包括同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況。相關(guān)產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法及臨床應(yīng)用情況，申請(qǐng)注冊(cè)產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品的異同等。對(duì)于新研制的體外診斷試劑產(chǎn)品，需要提供被測(cè)物與預(yù)期適用的臨床適應(yīng)癥之間關(guān)系的文獻(xiàn)資料。 （二）主要原材料的研究資料 此類產(chǎn)品的主要原材料應(yīng)包括EGFR突變基因檢測(cè)試劑的所有主要組成成分，如引物、探針、酶、反應(yīng)緩沖液、提取成分（如包含）等。如為申請(qǐng)人

10、自行研制的主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)EGFR目的基因序列確定、引物和探針選擇、酶的選擇和驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)過(guò)程予以詳述；并提供對(duì)各主要原材料的性能研究資料，如：外觀、純度、蛋白濃度、功能性研究等。制備完成的原料成品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請(qǐng)人外購(gòu)主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購(gòu)方來(lái)，提交外購(gòu)方出具的原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請(qǐng)人對(duì)外購(gòu)主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。 1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。 2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備

11、、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容： 2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP） 核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。 2.2引物 應(yīng)優(yōu)化每一單一突變基因?qū)Ｓ靡锏南鄬?duì)濃度，避免多個(gè)核酸靶序列同時(shí)擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)相互影響和競(jìng)爭(zhēng)。引物設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)對(duì)反應(yīng)體系中所有引物進(jìn)行篩選，避免引物二聚體形成。為保證每一靶序列檢測(cè)準(zhǔn)確性，EGFR檢測(cè)試劑中每一突變基因引物的濃度必須進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)根據(jù)靶序列突變性質(zhì)、C+G含量等確定每一突變基因引物的長(zhǎng)度和濃度，且單一引物最適濃度還應(yīng)考慮所有引物濃度之間的相互影響。由一定數(shù)量的堿基構(gòu)成的特定序列

12、，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（）或其他適宜方法純化。需提供對(duì)引物的分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析p 圖譜。應(yīng)對(duì)引物結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，引物擴(kuò)增區(qū)段不應(yīng)有重復(fù)序列。 2.3探針 特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。合成后經(jīng)或其他適宜方法純化，在5-端（和/或3-端）進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物質(zhì)檢證明，如HPLC分析p 圖譜，應(yīng)對(duì)探

13、針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光基團(tuán)進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。 2.4酶 DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94保溫1小時(shí)后仍保持50活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。 3.核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。 4.企業(yè)內(nèi)部參考品 企業(yè)內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可溯的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過(guò)程、定值研究、評(píng)價(jià)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p

14、 等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部參考品的來(lái)、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行精確的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并提供參考品溯過(guò)程的測(cè)量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證實(shí)際情況自行設(shè)定內(nèi)部參考品，陽(yáng)性參考品應(yīng)著重考慮EGFR突變基因型別要求，陰性參考品則主要涉及對(duì)分析p 特異性（交叉反應(yīng)）的驗(yàn)證情況。如該類產(chǎn)品有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，在不低于國(guó)家參考品要求前提下，申請(qǐng)人可以結(jié)合實(shí)際情況設(shè)置合理的內(nèi)部參考品。具體要求如下： 4.1組織樣本參考品設(shè)置要求 4.1.1陽(yáng)性參考品 陽(yáng)性參考品中常見(jiàn)基因突變位點(diǎn)建議采用臨床樣本提取的DNA儲(chǔ)備液或細(xì)胞系作為原料。其他突變位點(diǎn)可采用DNA儲(chǔ)備液、細(xì)胞系或EGFR突變擴(kuò)增產(chǎn)物

15、模擬樣本作為原料。如采用EGFR突變擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽(yáng)性參考品，應(yīng)盡可能模擬真實(shí)樣本，需要對(duì)樣本基質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。 試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性參考品，每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)置不同突變百分率梯度，其中至少應(yīng)包括高濃度和低濃度陽(yáng)性參考品。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法（如測(cè)序方法或數(shù)字化PCR等）進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。 4.1.2陰性參考品 可采用經(jīng)確認(rèn)無(wú)相應(yīng)靶突變序列的DNA儲(chǔ)存液。如野生型人基因組DNA，HER家族DNA等。 4.1.3檢測(cè)限參考品 檢測(cè)限參考品的原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括所有的突變類型。在進(jìn)行最低檢測(cè)限性能評(píng)估時(shí)，應(yīng)設(shè)置多個(gè)梯度

16、，主要從擴(kuò)增反應(yīng)終體系總核酸濃度和突變序列所占百分率兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，建議采用95（n20）的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。 4.1.4精密度參考品 精密度參考品原料要求參考陽(yáng)性參考品，需至少包括弱陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性水平的精密度驗(yàn)證，中/強(qiáng)陽(yáng)性精密度參考品以常見(jiàn)突變類型或理論上較難測(cè)得的突變序列為主；同時(shí)設(shè)置陰性參考品精密度驗(yàn)證。 4.2外周血樣本參考品設(shè)置要求 4.2.1陽(yáng)性參考品 陽(yáng)性參考品中常見(jiàn)突變基因位點(diǎn)建議采用臨床樣本提取的DNA儲(chǔ)備液或細(xì)胞系作為原料。考慮外周血中EGFR突變基因DNA含量較低，其他突變位點(diǎn)可以采用DNA儲(chǔ)備液或細(xì)胞系或EGFR突變基因擴(kuò)增產(chǎn)物模擬樣本，樣本基質(zhì)

17、應(yīng)為人血漿或人工模擬樣本，使用人血漿時(shí)，應(yīng)提前確認(rèn)人血漿中DNA背景濃度；使用人工模擬樣本時(shí)，應(yīng)盡可能模擬真實(shí)樣本，并對(duì)模擬樣本進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。 試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性參考品，每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)置不同突變百分率梯度，其中需至少包括弱陽(yáng)性參考品。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法（如測(cè)序方法或數(shù)字PCR等）進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。 4.2.2陰性參考品 可采用經(jīng)確認(rèn)無(wú)相應(yīng)靶突變序列的DNA儲(chǔ)存液。如野生型人基因組DNA，HER家族其他DNA等。 4.2.3檢測(cè)限參考品 檢測(cè)限參考品的原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括所有的突變類型。在進(jìn)行最低檢測(cè)限性能

18、評(píng)估時(shí)，應(yīng)設(shè)置多個(gè)梯度，建議采用95（n20）的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。 4.2.4精密度參考品 精密度參考品原料要求參考陽(yáng)性參考品，需至少包括弱陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性水平的精密度驗(yàn)證，中/強(qiáng)陽(yáng)性精密度參考品以常見(jiàn)突變類型或理論上較難測(cè)得的突變序列為主，同時(shí)設(shè)置陰性參考品精密度驗(yàn)證。 5.試劑盒內(nèi)對(duì)照品（質(zhì)控品） 試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品來(lái)實(shí)現(xiàn)，質(zhì)控體系需考慮對(duì)樣本核酸分離/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。對(duì)照品可采用質(zhì)粒、假病毒或臨床樣本的核酸提取液等進(jìn)行配置。申報(bào)資

19、料應(yīng)對(duì)試劑盒對(duì)照品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料詳細(xì)說(shuō)明。申請(qǐng)人應(yīng)視申報(bào)產(chǎn)品具體情況設(shè)置合理的試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品），試劑盒質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求： 5.1陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品） 申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)各陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品）的Ct值提出明確的范圍要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢測(cè)（分型或不分型），相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)選擇較常見(jiàn)突變序列或理論上較難測(cè)得的突變序列作為陽(yáng)性對(duì)照。 5.2陰性對(duì)照 陰性對(duì)照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白對(duì)照，對(duì)交叉污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。陰性對(duì)照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。 5.3內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)） 內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假

20、陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。 （三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料 生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如：臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值或臨界值確定等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。主要包括以下內(nèi)容： 1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。 2.反應(yīng)原理介紹。 3.基因位點(diǎn)選擇、方法學(xué)特性介紹。 4.確

21、定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度等。 5.確定PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。如反應(yīng)體系相同，多個(gè)突變基因在相同反應(yīng)條件下核酸擴(kuò)增效率是否存在差別。 6.對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。應(yīng)明確相同反應(yīng)條件下，多個(gè)基因類型Ct是否相同。 7.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。 8.如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。 （四）分析p 性能評(píng)估資料 分析p 性能評(píng)估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)置是否合理的客觀評(píng)

22、價(jià)指標(biāo)。檢測(cè)試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理、臨床用途、使用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析p 等詳細(xì)資料。 1.病理組織學(xué)樣本類型評(píng)價(jià)要求 1.1最低檢測(cè)限 病理組織學(xué)樣本類型最低檢測(cè)限研究應(yīng)包括擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和申報(bào)產(chǎn)品反應(yīng)體系中總核酸濃度兩個(gè)因素。 對(duì)于常見(jiàn)突變基因類型建議采用EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和EGFR野生型的NSCLC FFPE樣本或細(xì)胞系制備DNA存儲(chǔ)液，對(duì)于罕見(jiàn)突變基因類型，建議采用DNA儲(chǔ)備液、細(xì)

23、胞系或質(zhì)粒與EGFR野生型NSCLC FFPE樣本制備DNA存儲(chǔ)液。 EGFR突變基因類型不同比例混合應(yīng)注意的事項(xiàng)：每種突變基因類型樣本儲(chǔ)存液按照不同突變序列所占比例進(jìn)行混合，結(jié)合PCR方法檢測(cè)靈敏度及病理組織學(xué)樣本類型，此處主要針對(duì)EGFR突變基因類型低比例情況進(jìn)行配比，如從10或8起始按不同比例混合。至少應(yīng)包括目標(biāo)檢測(cè)限和檢測(cè)限上下至少各2個(gè)梯度比例范圍的研究資料，對(duì)于按不同比例混合后的不同樣本，建議采用數(shù)字化PCR或高通量測(cè)序法等方法檢測(cè)不同樣本的實(shí)際混合比例，并以實(shí)際混合比例作為EGFR突變基因的最低檢測(cè)限進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)，在EGFR突變基因不同比例研究過(guò)程中應(yīng)設(shè)置EGFR野生型樣本

24、作為空白對(duì)照。 確定反應(yīng)體系總樣本加樣量以及反應(yīng)體系中需要的DNA總量，申請(qǐng)人需說(shuō)明每uL的DNA加樣量和總DNA濃度確定方法。在進(jìn)行混合稀釋時(shí)，使用的FFPE樣本應(yīng)與原混合配置樣本類型相同。建議申請(qǐng)人設(shè)計(jì)一個(gè)顯著高于反應(yīng)體系最高DNA加樣量的DNA存儲(chǔ)濃度。在實(shí)際的EGFR不同突變比例下，進(jìn)行不同梯度DNA濃度的檢測(cè)，不同DNA濃度各檢測(cè)至少3次，不同梯度DNA濃度范圍應(yīng)涵蓋申報(bào)產(chǎn)品反應(yīng)體系中設(shè)定的最高DNA濃度和最低DNA濃度。待確定組織中最低檢測(cè)限后，在組織樣本最低檢測(cè)限水平附近再額外檢測(cè)部分接近最低檢測(cè)限的樣本，確認(rèn)最低檢測(cè)限D(zhuǎn)NA濃度。 1.1.1如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的核酸提取方法，每

25、種核酸提取方法應(yīng)配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各突變基因類型最低檢測(cè)限驗(yàn)證。 1.1.2如申報(bào)產(chǎn)品適用不同適用機(jī)型，每種適用機(jī)型應(yīng)配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各突變基因類型最低檢測(cè)限驗(yàn)證。 1.1.3病理組織切片的提取方法應(yīng)與說(shuō)明書(shū)一致，如申報(bào)產(chǎn)品適用于多種病理組織切片制作方法，最低檢測(cè)限應(yīng)對(duì)每種病理組織切片制作方法進(jìn)行驗(yàn)證。 1.2分析p 特異性 1.2.1交叉反應(yīng) 該類產(chǎn)品主要與肺部腫瘤存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)交叉反應(yīng)研究時(shí)應(yīng)將此點(diǎn)納入考慮。 1.2.1.1申請(qǐng)人應(yīng)考慮與靶序列的核酸序列相近或具有同性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類型序列的交叉反應(yīng)。建議交叉反應(yīng)驗(yàn)證考慮以下因素：EGFR基因不同序列；HER

26、家族不同基因；不同濃度的野生型人DNA樣本、非人類基因組基因、肺部相關(guān)感染微生物等。 1.2.1.2對(duì)于可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的病原體，需在有臨床意義相關(guān)濃度下進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)菌濃度水平建議至少106 cfu/mL，病毒濃度水平建議至少105 pfu/mL。需明確進(jìn)行交叉反應(yīng)的病原體類型及滴度。人野生型DNA至少包含100ng/L野生型核酸樣本，應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型序列來(lái)、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。 1.2.2干擾物質(zhì) 1.2.2.1申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型確定潛在的干擾物質(zhì)，如：常見(jiàn)治療藥物，病理組織處理過(guò)程及樣本穿刺過(guò)程的緩沖液、處理液等。 1.2.2.2用于干擾試

27、驗(yàn)的樣本，建議選擇醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物質(zhì)濃度，至少對(duì)EGFR突變基因弱陽(yáng)性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。 1.2.3有關(guān)分析p 特異性的信息應(yīng)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。 1.3精密度 申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。針對(duì)本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求： 1.3.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報(bào)試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)PCR分析p 儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。 1.3.2合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

28、如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。 1.3.3用于精密度評(píng)價(jià)的樣本應(yīng)考慮部分EGFR常見(jiàn)突變基因類型的臨床樣本、陽(yáng)性精密度參考品、陰性精密度參考品等。 1.4陽(yáng)性/陰性參考品符合率 各水平、各突變位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品均應(yīng)按要求檢出陽(yáng)性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)置相應(yīng)Ct值的限制；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條件下均應(yīng)檢出為陰性；如有野生型參考品的設(shè)置，在其相應(yīng)的引物探針組合下檢測(cè)應(yīng)為陽(yáng)性。 1.5樣本的穩(wěn)定性 1.5.1樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性 對(duì)于經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片樣本，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)組織樣本保存溫度，保存年限進(jìn)行限定。建議

29、明確組織切片樣本的規(guī)范采集標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證不同時(shí)間段保存的組織樣本對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。 對(duì)于新鮮冰凍切片樣本，應(yīng)限定新鮮冰凍切片樣本檢測(cè)時(shí)限，明確新鮮冰凍切片的切片要求。 1.5.2樣本核酸提取評(píng)價(jià)要求 申請(qǐng)人需設(shè)置評(píng)價(jià)方案（如：對(duì)同一NSCLC FFPE組織樣本中段部分平行切去10份切片樣本等）和評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)樣本核酸提取過(guò)程的重復(fù)性。 樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增過(guò)程成敗的要素之一。石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過(guò)程中，會(huì)使樣品中的核酸與核酸之間、核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)。

30、由于不同組織的蛋白種類和含量存在差異，不同組織核酸提取試劑的效率可能也有所不同。因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)核酸分離/純化環(huán)節(jié)做充分的驗(yàn)證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見(jiàn)的核酸分離純化方法均有其優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。 1.5.3樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性 應(yīng)檢測(cè)核酸的含量，設(shè)置反應(yīng)體系需要的核酸含量上限和下限。如反應(yīng)體系中起始DNA濃度過(guò)高，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系發(fā)生非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。如反應(yīng)體系中起始DNA濃度過(guò)低，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系無(wú)靶序列擴(kuò)增

31、反應(yīng)，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量，通過(guò)260 nm/280 nm處的吸光度比值（OD260/OD280）或其他方法評(píng)價(jià)其純度。設(shè)置反應(yīng)體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度超過(guò)所需濃度上限或下限，應(yīng)提供相應(yīng)的改進(jìn)措施。同時(shí)，應(yīng)對(duì)核酸提取物的保存時(shí)間，保存溫度進(jìn)行驗(yàn)證。并評(píng)價(jià)凍融次數(shù)、儲(chǔ)存條件等對(duì)樣本提取后核酸序列穩(wěn)定性的影響。 1.5.4樣本完整性 在樣本提取前、提取過(guò)程、提取后以及在儲(chǔ)存期間，核酸會(huì)發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提取前或提取后），應(yīng)避免樣品的多次冷凍/融化。必要時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)價(jià)提取前、提取后的凍融次數(shù)、儲(chǔ)存條件等因素。

32、在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，應(yīng)在使用前評(píng)價(jià)核酸的完整性。比較檢測(cè)結(jié)果與儲(chǔ)存前檢測(cè)結(jié)果的一致性，如采用瓊脂糖凝膠電泳或者內(nèi)參基因PCR檢測(cè)等方法。 2.外周血類型評(píng)價(jià)要求 2.1最低檢測(cè)限 EGFR在外周血中含量較低且片段較短，易于降解。在評(píng)價(jià)該部分最低檢測(cè)限時(shí)，建議將擬定量的DNA儲(chǔ)備液、細(xì)胞系或EGFR突變擴(kuò)增產(chǎn)物放入確定體積的血漿中，然后逐步稀釋，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)檢測(cè)3次，待確定外周血中最低檢測(cè)限后，在外周血最低檢測(cè)限水平附近再額外檢測(cè)部分接近最低檢測(cè)限的樣本，確認(rèn)最低檢測(cè)限D(zhuǎn)NA濃度。申請(qǐng)人可設(shè)置一個(gè)基礎(chǔ)濃度范圍，如從50pg/L濃度進(jìn)行稀釋，至少包括目標(biāo)檢測(cè)限和檢測(cè)限上下至少各2個(gè)梯度比例范圍的研

33、究資料，應(yīng)對(duì)本試劑可檢測(cè)的所有基因型別按照上述方法驗(yàn)證最低檢測(cè)限。申請(qǐng)人同時(shí)需說(shuō)明總DNA濃度的確定方法。 2.1.1如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的核酸提取方法，每種核酸提取方法應(yīng)配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各突變基因類型最低檢測(cè)限驗(yàn)證。 2.1.2如申報(bào)產(chǎn)品適用不同適用機(jī)型，每種適用機(jī)型應(yīng)配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各突變基因類型最低檢測(cè)限驗(yàn)證。 2.1.3如申報(bào)產(chǎn)品適用不同外周血采血管、采集方法或保存方法，每種外周血采集方法或保存方法應(yīng)配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各突變基因類型最低檢測(cè)限驗(yàn)證。 2.2分析p 特異性 2.2.1交叉反應(yīng) 該類產(chǎn)品主要與肺部腫瘤存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)交叉反應(yīng)研究時(shí)應(yīng)將此點(diǎn)納入考慮。 2.2.1.1申

34、請(qǐng)人應(yīng)考慮與靶序列的核酸序列相近或具有同性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類型序列的交叉反應(yīng)。建議交叉反應(yīng)驗(yàn)證考慮以下因素：EGFR基因不同序列；HER家族不同基因等；不同濃度的野生型人DNA樣本、非人類基因組基因等。 2.2.1.2對(duì)于可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的病原體，需在有臨床意義相關(guān)濃度下進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)菌濃度水平建議至少106 cfu/mL，病毒濃度水平建議至少105 pfu/mL。需明確進(jìn)行交叉反應(yīng)的病原體類型及滴度。人野生型DNA至少包含100ng/L野生型核酸樣本，應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型序列來(lái)、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。 2.2.2干擾物質(zhì) 2.2.2.1申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)

35、試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質(zhì)，如：外周血中干擾成分、人類DNA、樣本采集管及保存管中活性成分、常見(jiàn)治療藥物等。 2.2.2.2用于干擾試驗(yàn)的樣本，建議選擇醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物質(zhì)濃度，至少對(duì)EGFR突變基因弱陽(yáng)性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。 2.2.3有關(guān)分析p 特異性的信息應(yīng)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。 2.3精密度 申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。針對(duì)本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求： 2.3.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報(bào)試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)

36、PCR分析p 儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。 2.3.2合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2.3.3用于精密度評(píng)價(jià)的樣本應(yīng)考慮血漿基質(zhì)的部分EGFR常見(jiàn)突變基因類型的樣本、陽(yáng)性精密度參考品、陰性精密度參考品等。 2.4陽(yáng)性/陰性參考品符合率 各水平、各突變位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品均應(yīng)按要求檢出陽(yáng)性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)置相應(yīng)Ct值的限制；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條件下均應(yīng)檢出為陰性；在其相應(yīng)的引物探針組合下檢測(cè)應(yīng)為陽(yáng)性。 2.5樣本的穩(wěn)定

37、性 2.5.1樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性 外周血采集后，應(yīng)對(duì)外周血存放條件、存放時(shí)限及溫度設(shè)置等進(jìn)行驗(yàn)證，包括采用抗核酸降解或防細(xì)胞裂解采血管的要求。采樣所用的防腐劑、抗凝劑、保護(hù)劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程造成干擾。申請(qǐng)人還需對(duì)抗凝劑、防腐劑、保護(hù)劑等成分進(jìn)行驗(yàn)證。 對(duì)于外周血樣本，因晚期肺癌患者外周血樣本中EGFR含量相對(duì)較少，基因片段較短，半衰期短。建議明確最少的外周血提取總量，必要時(shí)可以增加外周血提取總量，從而增大外周血中EGFR基因片段被提取的機(jī)率。同時(shí)，在核酸提取過(guò)程中應(yīng)盡量減少核酸損耗和降解。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)外周血樣本保存時(shí)間及溫度，離心參數(shù)設(shè)置等進(jìn)行驗(yàn)證。 外周血樣本除滿

38、足上述要求外，還應(yīng)注意全血中血漿和血清中均能分離出循環(huán)游離DNA（cfDNA，cell free DNA），但通過(guò)和同性的血清樣本比較，血漿中cfDNA有更高的檢出率。血漿cfDNA通常片段較短，且在血液中濃度非常低。抽血后延遲血漿分離會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中，大量增加的gDNA會(huì)稀釋腫瘤來(lái)的cfDNA，使得突變難以檢出。因此在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中，防止游離DNA的降解是首要考慮的因素。其次，也應(yīng)防止血液中白細(xì)胞的裂解，避免因野生型DNA的增加導(dǎo)致cfDNA中的EGFR突變基因無(wú)法檢測(cè)。 因cfDNA含量低，為提高EGFR突變基因檢出率，在臨床允許的情況

39、下推薦增加血漿用量，為采集到最佳血漿標(biāo)本用于后續(xù)提取游離DNA進(jìn)行EGFR突變基因檢測(cè)，推薦在采血管中加入保護(hù)劑，如：游離DNA保護(hù)劑及防細(xì)胞裂解保護(hù)劑等。全血采集后建議盡快離心，分離出不含細(xì)胞成分的血漿。 2.5.2核酸提取評(píng)價(jià)要求 樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物。樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增過(guò)程成敗的要素之一。一般而言，相對(duì)于單一靶序列的檢測(cè)，多基因序列檢測(cè)對(duì)樣本核酸的濃度和質(zhì)量更為敏感，核酸提取步驟對(duì)于成功獲得結(jié)果至關(guān)重要。應(yīng)確保具有滿足檢測(cè)反應(yīng)體系數(shù)量和質(zhì)量的核酸用于檢測(cè)。不同提取方法產(chǎn)出的

40、核酸的濃度和質(zhì)量不同（如：分子量、純度、單鏈/雙鏈、pH值變化）。如有多種不同的提取方法和樣品基質(zhì)被推薦用于檢測(cè)，應(yīng)確保同一反應(yīng)體系中不同基因片段和對(duì)照品的提取效率相近。因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)核酸分離/純化環(huán)節(jié)做充分的驗(yàn)證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見(jiàn)的核酸分離純化均有其優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。 2.5.3樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性 應(yīng)檢測(cè)核酸的含量，設(shè)置反應(yīng)體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度低于所需濃度，應(yīng)提供相應(yīng)的改進(jìn)措施。通

41、過(guò)熒光染料法或其他方法評(píng)價(jià)其純度。同時(shí)，應(yīng)對(duì)核酸提取物的保存時(shí)間和保存溫度進(jìn)行驗(yàn)證。 2.5.4樣本完整性 在樣本提取前、提取過(guò)程、提取后以及在儲(chǔ)存期間，核酸會(huì)發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提取前或提取后），應(yīng)避免樣品的多次冷凍/融化。必要時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)價(jià)提取前、提取后凍融次數(shù)、儲(chǔ)存條件等因素。在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，應(yīng)在使用前評(píng)價(jià)核酸的完整性。比較檢測(cè)結(jié)果與儲(chǔ)存前檢測(cè)結(jié)果的一致性，如采用瓊脂糖凝膠電泳或者內(nèi)參基因PCR檢測(cè)等方法。 （五）陽(yáng)性判斷值確定資料 在設(shè)定申報(bào)試劑檢測(cè)結(jié)果cut-off值確定依據(jù)時(shí)，應(yīng)包括cut-off值研究方案、設(shè)定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、研究過(guò)程以及研究原始數(shù)據(jù)等。方案應(yīng)

42、考慮不同影響檢測(cè)結(jié)果的因素，如人群流行病學(xué)信息、疾病類型等。應(yīng)列舉cut-off值計(jì)算過(guò)程中采用的所有統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。如果試劑存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說(shuō)明如何確定灰區(qū)范圍。明確臨界值在不同的樣本類型是否有差異。應(yīng)在獨(dú)立樣本人群中對(duì)研究擬確定的cut-off值進(jìn)行充分驗(yàn)證。 （六）穩(wěn)定性研究資料 穩(wěn)定性研究資料主要涉及申報(bào)試劑的穩(wěn)定性。主要包括效期穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于效期穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)

43、際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。 （七）臨床評(píng)價(jià)資料 申請(qǐng)人應(yīng)在符合要求的臨床機(jī)構(gòu)，在滿足臨床試驗(yàn)最低樣本量要求的前提下，根據(jù)產(chǎn)品臨床預(yù)期用途、相關(guān)疾病的流行率和統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，制定能夠證明其臨床性能的臨床試驗(yàn)方案，同時(shí)最大限度地控制試驗(yàn)誤差，提高試驗(yàn)質(zhì)量并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)合理的分析p 。 1.臨床試驗(yàn)方案 臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)機(jī)構(gòu)的

44、技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。 方案中臨床樣本信息應(yīng)明確以下信息：采集時(shí)間要求、標(biāo)本類型要求、采樣質(zhì)量的要求，該類要求應(yīng)與產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的要求一致，如產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中未列明，應(yīng)在臨床方案中進(jìn)行列明。 試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例在被排除出臨床研究時(shí)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各研究機(jī)構(gòu)選用的參比試劑應(yīng)完全一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p 。臨床方案中還應(yīng)明確復(fù)核試劑及方法。另外，考核試劑適用的樣本類型、可檢測(cè)的突變基因類型不應(yīng)超越參比試劑的相應(yīng)檢測(cè)范圍，若

45、此種情況發(fā)生，則應(yīng)選擇其他合理參比方法對(duì)額外的樣本類型和突變基因類型進(jìn)行驗(yàn)證。 2.臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則，必須獲得臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的同意。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得或試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)性，應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見(jiàn)及受試者的知情同意書(shū)。對(duì)于例外情況，如客觀上不可能獲得受試者的知情同意或該臨床試驗(yàn)對(duì)受試者幾乎沒(méi)有風(fēng)險(xiǎn)，可經(jīng)倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)后免于受試者的知情同意。 3.臨床研究機(jī)構(gòu)的選擇 建議申請(qǐng)人在選擇臨床機(jī)構(gòu)時(shí)，應(yīng)在國(guó)內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床機(jī)構(gòu)，盡量使各機(jī)構(gòu)的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行EGFR突變基因檢測(cè)應(yīng)建立PCR標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，并建立實(shí)驗(yàn)室

46、質(zhì)量管理體系以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。PCR實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員應(yīng)接受過(guò)PCR上崗培訓(xùn)，且技能熟練。操作人員必須是接受過(guò)良好培訓(xùn)的技術(shù)人員，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評(píng)價(jià)方案。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，考核試劑和參比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。 4.考核試劑適用樣本類型設(shè)置要求 科學(xué)研究表明，NSCLC病理組織樣本與外周血樣本EGFR突變基因陽(yáng)性檢出率存在差異，且在EGFR-TKIs藥物臨床研究中兩類樣本類型的EGFR-TKIs藥效學(xué)評(píng)價(jià)方式也存在差異。因此，本部分對(duì)病理組織樣本類型臨床研究要求與外周血樣本類型臨床

47、研究要求分別進(jìn)行說(shuō)明，其中病理組織樣本總臨床樣本例數(shù)不少于1000例，包含4.1項(xiàng)中一致性評(píng)價(jià)臨床例數(shù)要求與5項(xiàng)中EGFR突變基因個(gè)體化治療相關(guān)臨床例數(shù)要求。外周血樣本總臨床樣本例數(shù)不少于1000例，包含4.2項(xiàng)中一致性評(píng)價(jià)臨床例數(shù)要求與5項(xiàng)中EGFR突變基因個(gè)體化治療相關(guān)臨床例數(shù)要求。 4.1 NSCLC病理組織樣本類型具體要求 4.1.1對(duì)比方法選擇 4.1.1.1如申報(bào)試劑已有同類上市產(chǎn)品，其臨床研究可以選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，同時(shí)應(yīng)充分了解產(chǎn)品方法學(xué)、臨床預(yù)期用途、主要性能指標(biāo)、陽(yáng)性判斷值、突變基因位點(diǎn)選擇等，以便對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析p 。采用擬申

48、報(bào)產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，至少證明本品與已上市產(chǎn)品等效。對(duì)比已上市同類試劑應(yīng)具有相同的突變位點(diǎn)且對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果應(yīng)可以區(qū)分每個(gè)突變型別，以確保考核試劑與對(duì)比試劑具有明確可比性。 4.1.1.2如選擇核酸序列測(cè)定方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的對(duì)比方法，驗(yàn)證考核試劑檢測(cè)結(jié)果與核酸序列測(cè)定（測(cè)序）結(jié)果之間的一致性情況，臨床研究報(bào)告中應(yīng)對(duì)選用的測(cè)序方法作詳細(xì)介紹。 申請(qǐng)人應(yīng)提供以下關(guān)于測(cè)序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，并經(jīng)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)簽章確認(rèn)。 4.1.1.2.1測(cè)序方法原理、測(cè)序儀型號(hào)、測(cè)序試劑及消耗品的相關(guān)信息。 4.1.1.2.2測(cè)序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇、分子量、純度、

49、功能性實(shí)驗(yàn)等資料。引物設(shè)計(jì)應(yīng)能區(qū)分所有基因型但需避開(kāi)考核試劑擴(kuò)增的靶核酸區(qū)段。 4.1.1.2.3應(yīng)對(duì)所選測(cè)序方法的分析p 性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測(cè)限的確認(rèn)，建議將所選測(cè)序方法與申報(bào)試劑的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析p 。 4.1.1.2.4測(cè)序方法應(yīng)建立合理的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。 4.1.1.2.5應(yīng)選擇有代表性的樣本測(cè)序圖譜及結(jié)果分析p 資料。 4.1.2病例選擇 臨床試驗(yàn)應(yīng)以非小細(xì)胞肺癌腫瘤患者為主要研究對(duì)象，其中應(yīng)涵蓋考核試劑所聲稱的所有基因型且每種突變型別應(yīng)有一定量的陽(yáng)性病例。對(duì)于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)驗(yàn)證的需要，從臨床角度考察其分

50、析p 特異性。若產(chǎn)品適用于多種樣本類型，則應(yīng)對(duì)所有樣本類型均進(jìn)行臨床驗(yàn)證。具體要求如下： 4.1.2.1臨床樣本類型以肺腺癌為主，還應(yīng)包括一定數(shù)量的其他類型肺癌及肺部腫瘤初治/復(fù)發(fā)人群等。 4.1.2.2如申報(bào)試劑樣本類型適用于冰凍新鮮樣本，應(yīng)完成不少于20_例冰凍新鮮樣本。 4.2外周血樣本類型具體要求 4.2.1對(duì)比方法學(xué)選擇 4.2.1.1如申報(bào)試劑已有同類上市產(chǎn)品，其臨床研究可以選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，同時(shí)應(yīng)充分了解產(chǎn)品方法學(xué)、臨床預(yù)期用途、主要性能指標(biāo)、陽(yáng)性判斷值、突變基因位點(diǎn)選擇等，以便對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析p 。采用考核試劑與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究

51、，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。對(duì)比已上市同類試劑應(yīng)具有相同的突變位點(diǎn)且對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果應(yīng)可以區(qū)分不同突變型別，以確保考核試劑與對(duì)比試劑具有明確可比性。 4.2.1.2如選擇核酸序列測(cè)定方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的對(duì)比方法，驗(yàn)證考核試劑檢測(cè)結(jié)果與核酸序列測(cè)定（測(cè)序）結(jié)果之間的一致性情況，臨床研究報(bào)告中應(yīng)對(duì)選用的測(cè)序方法作詳細(xì)介紹。 4.2.1.3因外周血中EGFR突變基因片段較短、含量較低，在外周血檢測(cè)EGFR突變基因片段中可選擇高通量核酸序列測(cè)定方法或其他靈敏度較高的檢測(cè)方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的對(duì)比方法，驗(yàn)證考核試劑檢測(cè)結(jié)果與核酸序列測(cè)定（測(cè)序）結(jié)果之間的一致性情況，臨床研究報(bào)告中應(yīng)對(duì)選

52、用的測(cè)序方法作詳細(xì)介紹。 申請(qǐng)人應(yīng)提供以下關(guān)于測(cè)序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，并經(jīng)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)簽章確認(rèn)。 4.2.1.3.1測(cè)序方法原理、測(cè)序儀型號(hào)、測(cè)序試劑及消耗品的相關(guān)信息。 4.2.1.3.2測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建組分的主要組成、原理介紹。 4.2.1.3.3數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）類型、數(shù)據(jù)庫(kù)的溯信息、完整性等信息。 4.2.1.3.4生物信息學(xué)分析p 軟件、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心、異常情況處置方案等信息。 4.2.1.3.5測(cè)序方法所用引物、探針、接頭、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶相關(guān)信息，如序列選擇，分子量、純度、保存穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)及所有酶的酶活性等資料。引物設(shè)計(jì)應(yīng)能區(qū)分所有基因型但需避開(kāi)考核試劑擴(kuò)增

53、的靶核酸區(qū)段。 4.2.1.3.6應(yīng)對(duì)所選測(cè)序方法的分析p 性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測(cè)限的確認(rèn)，建議將所選測(cè)序方法與申報(bào)試劑的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析p 。 4.2.1.3.7測(cè)序方法應(yīng)建立合理的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。 4.2.1.3.8應(yīng)選擇有代表性的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)和注釋文件資料。 4.2.2病例選擇 臨床試驗(yàn)應(yīng)以非小細(xì)胞肺癌腫瘤患者為主要研究對(duì)象，其中應(yīng)涵蓋考核試劑所聲稱的所有基因型且每種突變型別均應(yīng)有一定量的陽(yáng)性病例。對(duì)于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)驗(yàn)證的需要，從臨床角度考察其分析p 特異性。具體要求如下： 4.2.2.1臨床樣本類型以肺腺癌為

54、主，還應(yīng)包括一定數(shù)量的其他類型肺癌及肺部腫瘤初治/復(fù)發(fā)人群等。 4.2.2.2臨床樣本類型比對(duì)方式 應(yīng)包括至少20_例腫瘤患者同性外周血樣本和組織學(xué)樣本對(duì)比臨床研究資料。 4.2.2.3如考核試劑檢測(cè)系統(tǒng)適用不同類型外周血保存方法，建議每種外周血保存方法應(yīng)配合申報(bào)檢測(cè)系統(tǒng)，完成不少于20_例同性臨床對(duì)比研究。 5.EGFR突變基因個(gè)體化治療相關(guān)臨床研究要求 依據(jù)EGFR-TKI靶向治療臨床需求，申請(qǐng)人除在完成與同類產(chǎn)品一致性臨床研究外，還需提供EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒與相關(guān)腫瘤藥物關(guān)聯(lián)臨床研究資料，表明考核試劑與特定腫瘤藥物伴隨使用可以使患者臨床獲益的客觀證據(jù)。主要考慮以下幾種情況： 5.1

55、考核試劑應(yīng)滿足臨床需求，申請(qǐng)人可采用基于特定藥物研究觀察終點(diǎn)的前瞻性隊(duì)列或回顧性隊(duì)列臨床研究，或其他臨床研究方法。采用其他臨床研究方法時(shí)，臨床研究方案應(yīng)考慮包括該產(chǎn)品預(yù)期目標(biāo)人群，如經(jīng)過(guò)特定腫瘤藥物治療的患者人群。同時(shí)，為保證其他臨床研究效能，應(yīng)考慮選用已聯(lián)合特定腫瘤藥物臨床研究的體外診斷試劑作為全部或部分考核試劑檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比方法。 隨著腫瘤個(gè)體化藥物研究持續(xù)深入，基于腫瘤患者直接臨床獲益證據(jù)，EGFR部分突變基因位點(diǎn)（如耐藥突變基因位點(diǎn)）可能被賦予新的臨床意義。申請(qǐng)人可采用基于新上市藥物研究觀察終點(diǎn)的前瞻性隊(duì)列或回顧性隊(duì)列臨床研究，或其他臨床研究方法。采用其他臨床研究方法時(shí)，臨床研究方案應(yīng)

56、考慮包括該產(chǎn)品預(yù)期目標(biāo)人群，如經(jīng)過(guò)新上市腫瘤藥物治療的患者人群。同時(shí)，為保證其他臨床研究效能，應(yīng)考慮選用已聯(lián)合新上市腫瘤藥物臨床研究的體外診斷試劑作為全部或部分考核試劑檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比方法。 5.2考核試劑部分突變基因類型在中國(guó)境內(nèi)若屬于首次申報(bào)，因EGFR突變基因在不同種族中人群易感性不同，申請(qǐng)人應(yīng)考慮EGFR突變基因可能在不同人群中的差異。在注冊(cè)申報(bào)時(shí)，應(yīng)提供突變類別在中國(guó)人群中的突變比例等臨床評(píng)價(jià)資料。 5.3 EGFR突變基因個(gè)體化治療相關(guān)臨床研究的臨床樣本量受研究疾病、研究目的和研究終點(diǎn)的影響。樣本量大小的估計(jì)應(yīng)根據(jù)治療作用大小的預(yù)期、變異程度的預(yù)估、統(tǒng)計(jì)分析p 方法等來(lái)確定。5.EG

57、FR突變基因個(gè)體化治療相關(guān)臨床研究要求中樣本量統(tǒng)計(jì)方法如與（七）臨床評(píng)價(jià)資料其他部分臨床樣本量統(tǒng)計(jì)方法存在區(qū)別，申請(qǐng)人需合理選擇該項(xiàng)樣本量的計(jì)算方法。 因與EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒聯(lián)合使用的不同藥物臨床研究療效存在差異，該部分EGFR突變基因檢測(cè)試劑臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)置需主要依據(jù)藥物臨床部分評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合設(shè)置。應(yīng)明確抗腫瘤藥物臨床試驗(yàn)終點(diǎn)。如：總生存期（Overall Survival，OS）、基于腫瘤測(cè)量的終點(diǎn)如無(wú)病生存期（DFS）、客觀緩解率（ORR）、疾病進(jìn)展時(shí)間（TTP）、無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和治療失敗時(shí)間（TTF）等，或基于癥狀評(píng)價(jià)的終點(diǎn)等。在該部分研究中，申請(qǐng)人應(yīng)提交患者相關(guān)臨床

58、診療信息如治療前/后的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物、CT或PET-CT等影像檢查結(jié)果，并匯總分析p 相關(guān)藥物治療非小細(xì)胞肺癌患者前后的臨床效果。 5.4考核試劑適用樣本類型如包括組織學(xué)樣本或/和外周血樣本。組織學(xué)樣本與外周血樣本需分別進(jìn)行相關(guān)臨床研究，依據(jù)考核試劑不同樣本類型預(yù)期用途，該部分臨床試驗(yàn)要求原則可參照5.1項(xiàng)要求執(zhí)行。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p 在采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一致性研究時(shí)，臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測(cè)結(jié)果一致性分析p 、陰性/陽(yáng)性符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、ka檢驗(yàn)等，統(tǒng)計(jì)分析p 應(yīng)可以證明不同方法的檢測(cè)結(jié)果有無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，設(shè)置a值及P值假設(shè)條件，即評(píng)價(jià)考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。 建議采用四格表對(duì)考核試劑和對(duì)比方法學(xué)統(tǒng)計(jì)分析p 。統(tǒng)計(jì)每個(gè)突變類別陽(yáng)性符合率和在所有陽(yáng)性病例中所占比例。對(duì)本次臨床研究中人群基本特征進(jìn)行分析p ，例如：年齡，性別，疾