糖尿病大鼠腎臟病變及其SnoN蛋白表達(dá)的變化

1、糖尿病大鼠腎臟病變及其SnoN蛋白表達(dá)的變化 作者：崔龍 劉瑞霞 李曉穎 石明雋 肖瑛 郭兵 張國忠【摘要】 目的： 復(fù)制2型糖尿病動物模型，并觀察其腎臟病變及SnoN蛋白表達(dá)的變化。方法: SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC)、高脂高糖組（HG）。高脂、高糖飲食12周后又隨機(jī)分為高脂高糖對照組（HC）、糖尿病組（DM）。采用高脂、高糖飲食12周加小劑量鏈脲佐菌素注射( 30 mg/ kg )的方法復(fù)制2型糖尿病動物模型，成模大鼠隨機(jī)分別于糖尿病8周（DM8）、12周（DM12）和16周（DM16）處死；Western印跡法檢測腎皮質(zhì)SnoN蛋白的水平；生物化學(xué)方法測血糖、血清胰島素水平、甘油三

2、酯、總膽固醇、血肌酐及24 h尿蛋白；光鏡檢查腎組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果: DM組大鼠出現(xiàn)高血糖、高血脂、腎功能和腎組織形態(tài)學(xué)改變；HG組血清胰島素水平、甘油三酯和總膽固醇明顯升高，血糖與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)DM8組腎組織中SnoN蛋白的表達(dá)明顯低于NC組，且隨病程進(jìn)展逐漸減少，至DM16時(shí)減至NC組的64.20%。結(jié)論： 成功復(fù)制了2型糖尿病動物模型；SnoN蛋白的表達(dá)變化可能參與了2型糖尿病腎臟病變的發(fā)生、發(fā)展過程。 【關(guān)鍵詞】 糖尿病，非胰島素依賴型； 糖尿病腎病； 大鼠，Sprague-Dawley； 轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN Abstract Object

3、ive: To establish type 2 diabetic rat model and observe its renal lesions and SnoN protein expression. Methods: Sprague-Dawley rats were divided into normal control, high-fat and high-sucrose groups. High-fat and high-sucrose groups were then divided into high-fat and high-sucrose controls and diabe

4、tes mellitus groups after taking high-fat and high-sucrose diet for 12 weeks. The diabetic rats were injected with low dose of streptozotocin (30 mg/kg) and were killed at the 20th, 24th, and 28th weeks respectively. The SnoN proteins in renal cortex were detected with Western blotting. Blood glucos

5、e, serum insulin concentration, trigly-ceride, total cholesterol, serum creatinine and 24 h urine protein were examined with biochemistry methods. The renal morphology on HE stained sections was checked with light microscope. Results: Diabetic rats showed hyperglycaemia, hyperlipemia, kidney morphol

6、ogical lesion and renal function changes. High-sucrose control group showed hyperinsulinemia and hyperlipemia, but the blood glucose was normal. Western blotting results showed that the expression of SnoN in diabetic renal tissues significantly decreased (P<0.01). Conclusions: Rat models of t

7、ype 2 diabetes mellitus have been established successfully which can be used as a diabetic nephropathy model. The change of SnoN protein expression may play a role in the mechanisms of type 2 diabetic nephropathy. Key words diabetes mellitus，non-insulin-dependent; diabetic nephrosis； rats,Sprague-Da

8、wley；transcription co-repressor SnoN 糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的以高血糖為特征的代謝性疾病，其中2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生在國外占整個(gè)糖尿病比例的85%95%，國內(nèi)報(bào)道則在90以上1。但目前國內(nèi)糖尿病的研究多采用大劑量鏈脲佐菌素（streptozoticin,STZ）誘導(dǎo)的1型糖尿病模型，國外對2型糖尿病的研究亦大多采用價(jià)格昂貴的自發(fā)性動物模型，并且其特點(diǎn)是遺傳因素在發(fā)病過程中占主導(dǎo)地位，與臨床上的發(fā)病特征不完全吻合。而對于膳食加小劑量STZ注射誘導(dǎo)的與臨床發(fā)病過程相近的2型糖尿病模型的復(fù)制方法，目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)2。引起糖尿病患者死亡的主要原因是其血管并

9、發(fā)癥，而糖尿病腎病即是其常見的微血管并發(fā)癥之一。以往的研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN蛋白的表達(dá)變化與STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)3。2007年8月2008年8月采用高脂、高糖飲食加小劑量STZ腹腔注射的方法，通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)和飼喂時(shí)間探討2型糖尿病模型的復(fù)制，并對其發(fā)病過程中腎臟病變及SnoN蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行觀察。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 動物和試劑 Sprague-Dawley （SD）大鼠30只, 雄性，體重（200±20）g,由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。STZ購于美國Sigma公司；SnoN抗體購于美國Santa Cruz公司；-a

10、ctin單克隆抗體及DAB顯色劑和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于武漢Boster公司；Western印跡用PVDF膜，3 mm Whatman濾紙購于美國milli-pore公司；膽固醇購于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；胰島素測定試劑盒購自天津九鼎生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；TG和TC測定試劑盒購自四川邁克有限公司；考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。 1.1.2 主要器材 日本京都血糖儀；高速低溫離心機(jī)（美國Beckman公司）；核酸蛋白分析儀（美國Amersham公司）；電泳系統(tǒng)及電轉(zhuǎn)移裝置（美國Amersham公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-RAD公司）。 1.2 方法 1.2.1

11、動物分組 將SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組(NC，n=6)、高脂高糖組（HG，n=24）。高脂高糖組喂養(yǎng)12周后又隨機(jī)分為高脂高糖對照組（HC，n=6）、糖尿病組（DM，n=18）。成模大鼠隨機(jī)分別于糖尿病8周（DM8，n=6）、12周（DM12，n=6）和16周（DM16，n=6）處死。NC組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，各組大鼠均自由飲水。 1.2.2 飲食誘導(dǎo)胰島素水平升高 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，HG組以高脂、高糖飼料喂養(yǎng)，飼料組成如下：67%常規(guī)飼料、20%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇、1%蛋黃。喂養(yǎng)12周時(shí)，稱體重，測空腹血糖，尾動脈取血測血清胰島素水平。 1.2.3 小劑量STZ注射誘導(dǎo)糖尿病 高脂

12、、高糖飲食12周后,DM組大鼠按30 mg/kg劑量腹腔注射STZ (以pH4.5、0.01 mol/L無菌枸櫞酸緩沖液配成1%濃度)。72 h后測空腹血糖，血糖值13.8 mmol/L者作為2型糖尿病大鼠，18只大鼠全部建模成功。 1.2.4 動物標(biāo)本的采集 分別于試驗(yàn)的第20周、24周和28周時(shí)處死DM8、DM12和DM16各組大鼠，于28周時(shí)一并處死NC和HC組大鼠。處死前代謝籠留24 h尿液，稱體重，股動脈取血；開腹取腎臟，稱腎重，一側(cè)腎臟固定于4%多聚甲醛，另一腎臟于-80 保存供Western印跡檢測。 1.2.5 生化檢測 氧化酶（GOD-PAP）法測血清葡萄糖；放免法測血清胰島

13、素水平；考馬斯亮藍(lán)法測尿蛋白濃度，尿蛋白濃度與24 h尿量的乘積為24 h尿蛋白量；血甘油三酯和膽固醇測定均按試劑說明書操作。 1.2.6 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 多聚甲醛固定的腎臟組織行石蠟切片，經(jīng)HE染色后光鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。 1.2.7 Western印跡檢測 取-80 保存的各組大鼠腎皮質(zhì)，每組100 mg，分別加入組織蛋白提取液后勻漿、離心、取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定各組蛋白質(zhì)濃度，每個(gè)樣品上樣150 g，按所測得濃度計(jì)算各樣品所需體積，加入2倍上樣緩沖液煮沸10 min。經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入SnoN或-actin一

14、抗，工作濃度均為1100，4 孵育過夜。復(fù)溫45 min，TBST洗膜后，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（濃度均為15 000）室溫孵育2 h，加DAB顯色液顯色。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，用Quantity one軟件分析蛋白條帶，測定各條帶的面積和灰度值，二者乘積為積分灰度值，以SnoN與-actin的積分灰度值比值為SnoN蛋白相對值，取3次重復(fù)測定值之均數(shù)。 1.2.8 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.5軟件處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。 2 結(jié)果 2.1 高脂、高糖飲食對各組大鼠體重、血糖及血清胰島素的影響 高脂、高糖飲食1

15、2周時(shí)，與NC組相比，HG組大鼠體重及血清胰島素水平顯著增加(P<0.01)；空腹血糖與NC組相比差異無顯著性（P>0.05），見表1。表1 飲食對各組大鼠體重、血糖及胰島素的影響(1)與正常對照組相比，P<0.01 2.2 小劑量STZ注射后對各組大鼠血糖、血清胰島素、血清甘油三酯及膽固醇的影響 注射STZ后8、12及16周，DM各組空腹血糖均明顯高于未注射的28周的NC組和HC組，差異有顯著性（P<0.01）；血清胰島素較注射STZ前明顯下降且顯著低于HC組(P<0.01)，但與NC組相比差異無顯著性。DM組各組血清甘油

16、三酯（TG）和總膽固醇（TC）均顯著高于NC組(P<0.01)，且隨病程進(jìn)展而升高，至DM12和DM16時(shí)顯著高于HC組(P<0.01)。見表2。 2.3 血肌酐、24 h尿蛋白及腎臟指數(shù) 大鼠在注射STZ后8周，血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白（24 h urine protein,24UP）及腎臟指數(shù)（kidney index,KI）均顯著高于NC組和HC組（P<0.01），且隨病程進(jìn)展逐漸升高。HC組與NC組相比血肌酐、24 h尿蛋白及腎臟指數(shù)差異均無顯著性，見表3。 2.4 腎組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色下見正常組腎小球形態(tài)完整、輪廓清晰；腎小管未

17、見異常。DM16組腎小球體積增大和表2 不同時(shí)點(diǎn)糖尿病組的血糖、胰島素、甘油三脂及膽固醇表3 各組大鼠血肌酐、24 h尿蛋白及腎臟指數(shù)的變化系膜基質(zhì)增生；腎小管管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞脫落，部分腎小管基底膜不完整，間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤。見圖1。 2.5 Western免疫印跡結(jié)果 NC組和HC組大鼠SnoN表達(dá)較多，SnoN與-actin的積分灰度值之比分別為0.81±0.06和0.94±0.16，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM8組為0.63±0.05，與NC組相比顯著減少，隨著DM的進(jìn)展SnoN的表達(dá)逐漸減弱，至DM16組時(shí)減少為正常組的64.20%（0.52±

18、0.11）。見圖2。 3 討論 2型糖尿病是由于胰島素抵抗和胰島素分泌障礙兩方面缺陷引起的。其中胰島素抵抗是2型糖尿病的主要始發(fā)因素，貫穿于2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展整個(gè)過程。胰島素抵抗發(fā)生后，只要胰腺能維持足夠的胰島素分泌量來克服胰島素抵抗，那么糖耐量將保持正?；蛑挥休p微受損。而一旦細(xì)胞功能開始下降，糖耐量將迅速降低，并發(fā)展成糖尿病。 目前，國內(nèi)外2型糖尿病模型的復(fù)制多數(shù)即根據(jù)此原理，先通過高脂、高糖飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗，再用小劑量STZ損傷胰島，使胰島素的分泌減少，進(jìn)而復(fù)制出與臨床2型糖尿病發(fā)病過程相似的動物模型。但有關(guān)高脂、高糖飼料的配方及飼喂時(shí)間尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，為此，本研究參考國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)

19、道的方法并通過調(diào)整高脂、高糖配方和延長飼喂時(shí)間復(fù)制2型糖尿病大鼠模型48。 本實(shí)驗(yàn)中，飼喂高脂、高糖飼料12周時(shí)大鼠體重顯著高于正常對照組，且血清胰島素水平顯著升高，但血糖與正常組相比無差異。也就是說，高脂、高糖飲食12周誘導(dǎo)出了高胰島素血癥和胰島素抵抗。高脂、高糖飲食誘發(fā)胰島素抵抗的機(jī)制可能是由于血清甘油三酯（TG）和游離脂肪酸（FFA）水平增高，F(xiàn)FA通過糖脂肪酸循環(huán)、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)不同途徑抑制糖儲存，降低胰島素敏感性，而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生9。大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗后，再通過注射小劑量STZ(30 mg/kg體重)損傷胰腺功能，導(dǎo)致胰腺代償性分泌胰島素的功能障礙，最后誘發(fā)高血糖。注射S

20、TZ后大鼠胰島素水平與同期高脂高糖組相比顯著降低，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明STZ引起胰島部分破壞，減少了胰島素的代償性分泌。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，成模組大鼠血糖持續(xù)在高水平，血清甘油三酯和膽固醇代謝水平亦在不斷升高，表明本實(shí)驗(yàn)的造模方法穩(wěn)定且與臨床2型糖尿病的慢性發(fā)病過程相似。 糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為腎臟肥大，持續(xù)性蛋白尿和進(jìn)行性腎功能衰竭等10。本實(shí)驗(yàn)高脂高糖組大鼠各項(xiàng)腎臟指標(biāo)與正常組相比差異均無顯著，糖尿病成模8周時(shí)即出現(xiàn)腎臟指數(shù)、24 h尿蛋白量和血肌酐顯著升高，且隨病程進(jìn)展持續(xù)增加，說明腎臟出現(xiàn)肥大且其濾過功能受損。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球體積增

21、大，腎小管管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤，說明DM大鼠發(fā)生了糖尿病腎病。因此，本實(shí)驗(yàn)動物模型可以作為糖尿病腎病模型進(jìn)行研究。 SnoN蛋白是TGF-1/Smads信號通路中重要的核轉(zhuǎn)錄抑制因子11,12。本課題組以往的研究顯示，該信號通路在單純STZ注射復(fù)制的1型糖尿病模型腎臟病變的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用，且SnoN蛋白的表達(dá)變化與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)3。本研究結(jié)果顯示，單純的高脂高糖組腎組織中SnoN蛋白的表達(dá)與正常組相比差異無顯著性。在高脂高糖飲食基礎(chǔ)上注射STZ復(fù)制成2型糖尿病時(shí)，隨病程進(jìn)展SnoN蛋白持續(xù)減少，成模16周時(shí)減少為正常組的64.20%。本課題組在對

22、1型糖尿病的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病8周時(shí)SnoN蛋白已減少為正常組的42%，這可能與2型糖尿病病變發(fā)展緩慢有關(guān)。而有關(guān)SnoN蛋白在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展中變化的意義及其與其它信號分子的相互作用關(guān)系，有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1高蘋,賈汝漢.2型糖尿病腎病大鼠模型的建立J.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2007(6)：316-319.2余臣祖,張朝寧,劉國安.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病動物模型研究進(jìn)展J.醫(yī)學(xué)綜述,2006(1)：41-42.3劉瑞霞,郭兵,崔龍,等.SnoN蛋白在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)及其意義J.中國病理生理雜志,2008(6):1188-1192.4趙保勝,董淑云.2型糖尿病動物模型的研究進(jìn)展J.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2005(5):62-66.5Luo J,Quan J,Tsai J,et a1Nongenetic mouse models of nonInsulin dependent diabetes mellitusJMetabolism,1998(6)：663-6686郭嘯華,劉志紅,李恒,等實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型的建立J.腎臟病與透析腎移植雜志,2000(4)：351-355.7Reed MJ,Meszaros K,Entes LJ,et a1A new