結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

1、結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌,結(jié)核；Rv2389；基因表達(dá)Construction and expression of eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2389【Abstract】AIM: To construct the eukaryotic expression vector encoding Mycobacterium tuberculosis Rv2389 and express it in CHO cells. METHODS: The gene en

2、coding Rv2389 protein were amplified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. After sequenced, Rv2389 gene segments were subcloned into eukaryotic expression vector pCDNA3.1(-). The recombinant plasmid pCDNARv2389 were transfected into CHO cells with l

3、iposome. The expressions of mRNA and protein encoded by this gene were detected respectively with RTPCR and indirect immunofluoresent technology. RESULTS: Rv2389 was cloned into pCDNA3.1(-) correctly, and its expression at mRNA and protein levels was detected in CHO cells. CONCLUSION: Recombinant eu

4、karyotic plasmid encoding Rv2389 was constructed successfully. The experiment established the basis for further study on the function of Rv2389. 【Keywords】 mycobacterium tuberculosis; Rv2389; gene expression【摘要】目的：構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因真核表達(dá)載體. 方法：PCR擴(kuò)增Rv2389基因，測序正確后克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(-)，重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后以陽離子聚合物轉(zhuǎn)

5、染CHO細(xì)胞后, 分別以RTPCR方法檢測mRNA表達(dá)和間接免疫熒光技術(shù)檢測目的蛋白的表達(dá). 結(jié)果：構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCDNA Rv2389， RTPCR結(jié)果證明Rv2389可在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光檢測證明，表達(dá)有Rv2389蛋白的細(xì)胞著染. 結(jié)論：成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Rv2389基因的真核表達(dá)載體pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO細(xì)胞中表達(dá).【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌，結(jié)核；Rv2389；基因表達(dá)0引言結(jié)核病是目前危害全球人類健康的重要傳染病. 這主要是因?yàn)?卡介苗（BCG）對成年人結(jié)核病的預(yù)防效果不穩(wěn)定，保護(hù)力為0%70%； 沒有特異性的診斷試劑； 艾滋病等免疫缺陷個

6、體的出現(xiàn)加快了本病的嚴(yán)重后果； 耐藥菌株的大量出現(xiàn)1. 因而尋找更有效的替代卡介苗的疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急. Rv2389蛋白是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB) 復(fù)活促進(jìn)因子（resuscitationpromoting factor, Rpf）樣蛋白家族的一員，序列分析發(fā)現(xiàn)，它不僅與細(xì)菌的增殖有關(guān)，還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識別的一個靶抗原2. 為此，我們在Rv2389原核表達(dá)和純化的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了真核表達(dá)載體并在CHO( 中國倉鼠卵巢)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，同時從其表達(dá)水平和基因轉(zhuǎn)錄兩方面進(jìn)行鑒定，為其功能研究奠定基礎(chǔ). 1材料和方法1.1材料MTB H37

7、Rv菌株,P815細(xì)胞由本室保存；真核表達(dá)載體pCDNA3.1(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重組質(zhì)粒pPro EX HTRv2389由本室構(gòu)建保存；Rv2389蛋白多抗由本實(shí)驗(yàn)室制備；AMV，RNA 酶抑制劑和TRIzol（Promega公司）；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（寶泰克公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）；梭華soft陽離子聚合物（廈門太陽馬公司）；羊抗鼠熒光抗體（寶信公司）.1.2方法1.2.1Rv2389基因片段的擴(kuò)增與測序結(jié)核分枝桿菌Rv2389全基因序列的特異性引物序列為：P1：5gga tcc gcc acc atg acc ccg

8、ggt ttg ctt ac3，含BamH酶切位點(diǎn)，起始碼和cozak序列；P2：5ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3，含Hind酶切位點(diǎn)和終止碼. PCR反應(yīng)條件：94 40 s，56 30 s，72 1 min，共30個循環(huán)，72延伸10 min. 回收PCR產(chǎn)物，用T4連接酶將PCR產(chǎn)物與pGEMTeasy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5，隨機(jī)挑取5個克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，取2個鑒定正確的克隆進(jìn)行測序3.1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將測序正確的Rv2389基因克隆至真核表達(dá)載體pCDNA3.1(-)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNARv238

9、9. 連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取均按文獻(xiàn)進(jìn)行3. 以BamH和Hind酶切pCDNARv2389，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒.1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將5×105 個CHO細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)量達(dá)孔底約2/3時進(jìn)行轉(zhuǎn)染. 轉(zhuǎn)染前用不含抗生素的1640培養(yǎng)液洗2次，以0.5 mL 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞. pCDNARv2389重組質(zhì)粒10 L和陽離子聚合物5 L各用80 L無血清的1640培養(yǎng)液稀釋，兩者混勻后室溫作用20 min，緩慢加入到細(xì)胞中. 培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，同時設(shè)正常細(xì)胞對照.1.2.4RTPCR檢測mRNA表達(dá)收集重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，2000 r/min離

10、心10 min. 參照Gibco的TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞mRNA. 在上述10 L mRNA 溶液中，加入1 L Oligo(dT)12-18引物，70水浴5 min后立即置于冰上，加10×buffer 4 L， MgSO4 4 L， 10 mmol/L dNTPs 2 L，RNA inhibitor 0.6 L，AMV 0.8 L，H2O 10.4 L. 混勻，42作用1 h，70 15 min終止反應(yīng). PCR反應(yīng)時加入cDNA第1鏈2 L，反應(yīng)條件為94預(yù)變性5 min，94變性30 s，55復(fù)性30 s，72延伸40 s，共進(jìn)行30個循環(huán)，末次循環(huán)72延伸2 min

11、，擴(kuò)增產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測.1.2.5間接免疫熒光檢測目的基因表達(dá)將轉(zhuǎn)染pCDNARv2389質(zhì)粒的CHO細(xì)胞爬片，用純化的Rv2389融合蛋白制備的免疫血清作為一抗，間接免疫熒光法檢測CHO細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)4.2結(jié)果2.1目的基因的擴(kuò)增、克隆及酶切鑒定用PCR方法從H37Rv中擴(kuò)增出Rv2389的DNA片段，被順利克隆入pGEMTeasy載體，測序證實(shí)所克隆的基因完全正確. 序列分析與GenBank報道的一致（圖1）.M：DL2000 marker；1：PCR產(chǎn)物.圖1Rv2389基因的PCR結(jié)果（略）2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定重組質(zhì)粒pCDNARv2389被BamH和Hi

12、ndIII 雙酶切后可得到約475 bp的片段，與預(yù)期的大小相一致（圖2）.M：DL2000 marker; 13： pCDNARv2389被BamH和Hind雙酶切. 圖2重組質(zhì)粒的酶切鑒定（略）2.3RTPCR檢測mRNA表達(dá)在約475 bp處擴(kuò)增出特異性基因（圖3），表明pCDNARv2389重組質(zhì)粒可以在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄.M：DL2000 marker；1： RTPCR產(chǎn)物.圖3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的RTPCR結(jié)果（略）2.4間接免疫熒光檢測目的基因表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在經(jīng)過間接免疫熒光染色后，陽性細(xì)胞有較強(qiáng)的熒光著染，表達(dá)蛋白定位于細(xì)胞膜上，而對照組細(xì)胞沒有著染（圖4）.A：Rv2389融

13、合蛋白在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；B：對照.圖4間接免疫熒光測定融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)×400（略）3討論Mukamolova GV等5研究發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌（Micrococcus luteus, M. luteus)可分泌一種Rpf，該因子可刺激該菌休眠體復(fù)活和生長，也可促進(jìn)繁殖體生長，研究證實(shí)Rpf作用與真核細(xì)胞的細(xì)胞因子相似，具有自我刺激作用又稱細(xì)菌因子. 同時進(jìn)一步研究證實(shí)該因子也可以刺激其他種類的高（G+C）%的革蘭陽性菌，包括結(jié)核分枝桿菌. 結(jié)核分枝桿菌全基因序列分析表明，其中Rv1884c；Rv2450c，Rv0867c，Rv1009，Rv2389c和基因與Mluteus菌

14、Rpf基因同源，其中4個基因編碼的蛋白是分泌蛋白，推測結(jié)核桿菌這些基因編碼的蛋白可能也具有Rpf作用，但尚無直接證據(jù)5-6. Sassetti等7采用大規(guī)模插入突變分析發(fā)現(xiàn)Rpf樣蛋白并不是H37Rv株生長所必需，而且這5種Rpf樣蛋白在功能上有一定的重疊. 因?yàn)橥蛔僐v1009基因可明顯減緩MTB的生長速度，提示其在MTB的生長中可能發(fā)揮著較為重要的作用. 以往研究8表明，MTB H37Rv株的幾種Rpf樣蛋白與Mluteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因而這些蛋白（或者這些蛋白中的某個或某幾個蛋白）有可能會被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分.近年來，國外在TB新

15、型疫苗或增強(qiáng)BCG免疫效果方面已作了大量的研究工作，并正在進(jìn)行大規(guī)模的候選疫苗篩選工作. 由于結(jié)核分枝桿菌Rpf家族蛋白不僅可以促進(jìn)結(jié)核休眠菌復(fù)活，而且還具有多種生物學(xué)活性如自溶素和/或青霉素結(jié)合蛋白的功能、細(xì)胞學(xué)方面的功能等9，此外這幾種Rpf樣蛋白與Mluteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因而這些蛋白（或者這些蛋白中的某個或某幾個蛋白）有可能會被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分. 在本實(shí)驗(yàn)中，我們在Rv2389原核表達(dá)和純化的工作基礎(chǔ)上構(gòu)建了真核表達(dá)載體并在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，同時從其表達(dá)水平和基因轉(zhuǎn)錄兩方面進(jìn)行鑒定，為其在新型疫苗的應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ).【參考

16、文獻(xiàn)】1 Kumar H, Malhotra D, Goswami S, et al. How far have we reached in tuberculosis vaccine development?J.Crit Rev Microbiol, 2003,29(4):297-312.2 Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young DI, et a. lA family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosisJ. Mol Microbiol, 2002,46(3):623-635.3

17、高雪，薛瑩，姜泓，等. 結(jié)核分枝桿菌furA基因片段的克隆、表達(dá)和分離純化J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004, 25（18）：1637-1640.4 師長宏，范雄林，徐志凱，等. 融合表達(dá)Ag85BESAT6的結(jié)核分枝桿菌真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫原性J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004,25（2）：121-124.5 Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young DI, et al. A bacterial cytokineJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(15):8916-8921.6 Martin CG, Nicholas

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