針刺對抑郁大鼠海馬神經(jīng)因子表達的影響

1、針刺對抑郁大鼠海馬神經(jīng)因子表達的影響 作者：徐世芬，莊禮興，唐純志【摘要】 【目的】觀察針刺對抑郁模型大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)表達的影響，探討針刺的抗抑郁機制?！痉椒ā窟x用SD大鼠隨機分為正常組、模型組、針刺組、西藥組，應(yīng)用孤養(yǎng)和長期不可預(yù)見的慢性應(yīng)激刺激復(fù)制抑郁大鼠模型，同時西藥組按2 mg·kg-1·d-1劑量給予氟西汀灌胃，針刺組予以針刺百會、心俞、肝俞穴，每天1次，共21 d。采用免疫組化方法檢測各組大鼠海馬BDNF和NGF蛋白表達的情況?！窘Y(jié)果】與正常組比較，模型組BDNF和NGF陽性細胞數(shù)量顯著減少(P<001

2、)，而針刺組、西藥組BDNF和NGF陽性細胞數(shù)顯著增加(與模型組比較，P<005)。【結(jié)論】針刺可以增加抑郁大鼠海馬BDNF 與NGF 表達，這可能是針刺抗抑郁的分子機制之一。 【關(guān)鍵詞】 抑郁癥/針灸療法;海馬/病理學(xué);神經(jīng)營養(yǎng)因子;神經(jīng)生長因子;疾病模型，動物;大鼠研究表明，抑郁癥的發(fā)病機制及治療可能涉及神經(jīng)元可塑性的假說，神經(jīng)元可塑性失調(diào)可導(dǎo)致抑郁癥1。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)因子家族的兩個成員，在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育中有重要作用，對神

3、經(jīng)元的可塑性及其形成和生存起著重要的調(diào)節(jié)作用2。本研究采用孤養(yǎng)和長期不可預(yù)見的慢性應(yīng)激刺激復(fù)制抑郁大鼠模型，觀察針刺對模型大鼠海馬神經(jīng)元BDNF和NGF表達的影響，現(xiàn)報道如下。1材料與方法11實驗動物和分組SPF級成年SD大鼠，體質(zhì)量220290 g，雌雄各半。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，實驗動物合格證編號：2007A017。首先采用Openfield法3作行為學(xué)評分，選擇得分相近的32只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組、模型組、氟西汀組(西藥組)、針刺組，每組8只。正常組每籠飼養(yǎng)4只，雌雄分開。用普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，室溫控制在2025，濕度60%80%。實驗在廣州中醫(yī)藥大

4、學(xué)動物實驗中心進行(合格證編號：0007047)。12試劑與儀器BDNF、NGF免疫組化試劑盒購自中山生物試劑有限公司廣州分公司。33二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色劑，兔抗NGF和BDNF多克隆抗體：一抗(工作濃度為1100)、二抗、三抗，40 g/L多聚甲醛，磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自武漢博士德生物有限公司。CX21BIMSET生物顯微鏡(OLYMPUS公司生產(chǎn))，圖像分析儀(北京航空航天大學(xué)24版本)。13動物模型的復(fù)制按照參考文獻方法3進行抑郁癥模型大鼠的復(fù)制。模型組、針刺組、西藥組每籠飼養(yǎng)1只，各組分別接受21 d各種不同的應(yīng)激刺激，包括斷水24 h;斷食24 h;夾尾1 min

5、;4冰水游泳5 min;搖晃：1次/s，5 min;晝夜顛倒;電擊足底，電壓50 mV，每5 s刺激1次，間歇5 s，共刺激10次。每天隨機選擇1種刺激，每種刺激平均使用3次，共21 d。14治療方法給予大鼠各種不可預(yù)知的應(yīng)激刺激同時，西藥組按照2 mg·kg-1·d-1劑量給予鹽酸氟西汀(美國禮來公司)，將藥物溶于生理鹽水中灌胃，每天1次。針刺組每天應(yīng)激刺激前1 h進行治療，根據(jù)實驗針灸學(xué)4大鼠穴位定位方法取穴，選取百會、心俞、肝俞。穴位常規(guī)消毒，選用華佗牌025 mm×13 mm針灸針進行針刺。百會向尾部斜刺，進針深度約為2 mm，心俞、肝俞(左右兩側(cè)穴位交替

6、使用，每次取單側(cè))斜刺5 mm，每穴均勻捻轉(zhuǎn)刺激30 s，留針15 min。每天1次，共21次。15檢測指標(biāo)和方法151取材方法各組大鼠在治療21 d結(jié)束后，全部斷頭取腦，剝離全腦，于冰浴下迅速分離出海馬，40 g/L多聚甲醛固定6 h，再依次浸入200、300 g/L的蔗糖PBS(pH 72)中，直至組織塊下降到底部，恒冷冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，取海馬與齒狀回互包平面，片厚40 m，直接置于01 mmol/L PBS液中，4冰箱保存。152BDNF、NGF免疫組織化學(xué)染色載玻片經(jīng)防脫片劑PolyLysine處理，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫作用10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。熱修復(fù)抗原

7、：將切片浸入001mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 60), 微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔510 min，反復(fù)12次。冷卻后PBS(pH 7276)洗滌2次，加50 mg/L的牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗，滴加1100稀釋的一抗(抗BDNF、NGF)，37放置1 h。PBS洗滌2 min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37、20 min。PBS洗滌2min×3次，滴加鏈霉親和素生物素過氧化物酶連結(jié)法(SABC)試劑，37、20 min。PBS洗滌5 min×4次，使用DAB顯色試劑顯色。取1 mL蒸餾水，加入試劑盒中ABC

8、試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在530 min之間。蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。每組各取1張切片貼在載玻片上，通過比較吸光度(D)半定量分析BDNF和NGF的表達量。每張隨機取2個視野，在10×40光鏡下用圖像分析儀進行分析。16統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 120軟件分析數(shù)據(jù)，用單因素方差分析：方差齊時采用LSD法(最小顯著差異法);方差不齊時采用Dunnett T3法。2結(jié)果正常組大鼠海馬結(jié)構(gòu)中，BDNF陽性細胞表達很強，廣泛分布于海馬的錐體細胞和齒狀回的顆粒細胞層，細胞排列密集，著色深，有的有較長的突起。與正常組比較，模型組

9、BDNF陽性細胞數(shù)量明顯減少，且多數(shù)細胞呈空泡狀，胞漿著色較淺。針刺組、西藥組BDNF陽性細胞數(shù)顯著增加(與模型組比較，P<005)，但兩組間比較，差異無顯著性意義(P>005)。結(jié)果見表1、圖1(見彩圖頁第615頁)。正常組大鼠海馬神經(jīng)元中可見較多的NGF免疫反應(yīng)陽性顆粒，呈淺棕色。與正常組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元NGF 陽性細胞數(shù)顯著減少(P<001)，著色淺淡。針刺組、西藥組與模型組比較，NGF 陽性細胞數(shù)顯著增加(P<005)，但兩組間比較，差異無顯著性意義(P>005)。結(jié)果見表1、圖2(見彩圖頁第615頁)。表

10、1各組大鼠海馬BDNF和NGF陽性神經(jīng)元的吸光度比較x【摘要】 【目的】觀察針刺對抑郁模型大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)表達的影響，探討針刺的抗抑郁機制?！痉椒ā窟x用SD大鼠隨機分為正常組、模型組、針刺組、西藥組，應(yīng)用孤養(yǎng)和長期不可預(yù)見的慢性應(yīng)激刺激復(fù)制抑郁大鼠模型，同時西藥組按2 mg·kg-1·d-1劑量給予氟西汀灌胃，針刺組予以針刺百會、心俞、肝俞穴，每天1次，共21 d。采用免疫組化方法檢測各組大鼠海馬BDNF和NGF蛋白表達的情況。【結(jié)果】與正常組比較，模型組BDNF和NGF陽性細胞數(shù)量顯著減少(P<001)，而針刺組

11、、西藥組BDNF和NGF陽性細胞數(shù)顯著增加(與模型組比較，P<005)?！窘Y(jié)論】針刺可以增加抑郁大鼠海馬BDNF 與NGF 表達，這可能是針刺抗抑郁的分子機制之一。 【關(guān)鍵詞】 抑郁癥/針灸療法;海馬/病理學(xué);神經(jīng)營養(yǎng)因子;神經(jīng)生長因子;疾病模型，動物;大鼠研究表明，抑郁癥的發(fā)病機制及治療可能涉及神經(jīng)元可塑性的假說，神經(jīng)元可塑性失調(diào)可導(dǎo)致抑郁癥1。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)因子家族的兩個成員，在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育中有重要作用，對神經(jīng)元的可塑性

12、及其形成和生存起著重要的調(diào)節(jié)作用2。本研究采用孤養(yǎng)和長期不可預(yù)見的慢性應(yīng)激刺激復(fù)制抑郁大鼠模型，觀察針刺對模型大鼠海馬神經(jīng)元BDNF和NGF表達的影響，現(xiàn)報道如下。1材料與方法11實驗動物和分組SPF級成年SD大鼠，體質(zhì)量220290 g，雌雄各半。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，實驗動物合格證編號：2007A017。首先采用Openfield法3作行為學(xué)評分，選擇得分相近的32只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組、模型組、氟西汀組(西藥組)、針刺組，每組8只。正常組每籠飼養(yǎng)4只，雌雄分開。用普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，室溫控制在2025，濕度60%80%。實驗在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中

13、心進行(合格證編號：0007047)。12試劑與儀器BDNF、NGF免疫組化試劑盒購自中山生物試劑有限公司廣州分公司。33二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色劑，兔抗NGF和BDNF多克隆抗體：一抗(工作濃度為1100)、二抗、三抗，40 g/L多聚甲醛，磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自武漢博士德生物有限公司。CX21BIMSET生物顯微鏡(OLYMPUS公司生產(chǎn))，圖像分析儀(北京航空航天大學(xué)24版本)。13動物模型的復(fù)制按照參考文獻方法3進行抑郁癥模型大鼠的復(fù)制。模型組、針刺組、西藥組每籠飼養(yǎng)1只，各組分別接受21 d各種不同的應(yīng)激刺激，包括斷水24 h;斷食24 h;夾尾1 min;4冰水游泳

14、5 min;搖晃：1次/s，5 min;晝夜顛倒;電擊足底，電壓50 mV，每5 s刺激1次，間歇5 s，共刺激10次。每天隨機選擇1種刺激，每種刺激平均使用3次，共21 d。14治療方法給予大鼠各種不可預(yù)知的應(yīng)激刺激同時，西藥組按照2 mg·kg-1·d-1劑量給予鹽酸氟西汀(美國禮來公司)，將藥物溶于生理鹽水中灌胃，每天1次。針刺組每天應(yīng)激刺激前1 h進行治療，根據(jù)實驗針灸學(xué)4大鼠穴位定位方法取穴，選取百會、心俞、肝俞。穴位常規(guī)消毒，選用華佗牌025 mm×13 mm針灸針進行針刺。百會向尾部斜刺，進針深度約為2 mm，心俞、肝俞(左右兩側(cè)穴位交替使用，每次取

15、單側(cè))斜刺5 mm，每穴均勻捻轉(zhuǎn)刺激30 s，留針15 min。每天1次，共21次。15檢測指標(biāo)和方法151取材方法各組大鼠在治療21 d結(jié)束后，全部斷頭取腦，剝離全腦，于冰浴下迅速分離出海馬，40 g/L多聚甲醛固定6 h，再依次浸入200、300 g/L的蔗糖PBS(pH 72)中，直至組織塊下降到底部，恒冷冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，取海馬與齒狀回互包平面，片厚40 m，直接置于01 mmol/L PBS液中，4冰箱保存。152BDNF、NGF免疫組織化學(xué)染色載玻片經(jīng)防脫片劑PolyLysine處理，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫作用10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。熱修復(fù)抗原：將切片浸入

16、001mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 60), 微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔510 min，反復(fù)12次。冷卻后PBS(pH 7276)洗滌2次，加50 mg/L的牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗，滴加1100稀釋的一抗(抗BDNF、NGF)，37放置1 h。PBS洗滌2 min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37、20 min。PBS洗滌2min×3次，滴加鏈霉親和素生物素過氧化物酶連結(jié)法(SABC)試劑，37、20 min。PBS洗滌5 min×4次，使用DAB顯色試劑顯色。取1 mL蒸餾水，加入試劑盒中ABC試劑各1滴，

17、混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在530 min之間。蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。每組各取1張切片貼在載玻片上，通過比較吸光度(D)半定量分析BDNF和NGF的表達量。每張隨機取2個視野，在10×40光鏡下用圖像分析儀進行分析。16統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 120軟件分析數(shù)據(jù)，用單因素方差分析：方差齊時采用LSD法(最小顯著差異法);方差不齊時采用Dunnett T3法。2結(jié)果正常組大鼠海馬結(jié)構(gòu)中，BDNF陽性細胞表達很強，廣泛分布于海馬的錐體細胞和齒狀回的顆粒細胞層，細胞排列密集，著色深，有的有較長的突起。與正常組比較，模型組BDNF陽性

18、細胞數(shù)量明顯減少，且多數(shù)細胞呈空泡狀，胞漿著色較淺。針刺組、西藥組BDNF陽性細胞數(shù)顯著增加(與模型組比較，P<005)，但兩組間比較，差異無顯著性意義(P>005)。結(jié)果見表1、圖1(見彩圖頁第615頁)。正常組大鼠海馬神經(jīng)元中可見較多的NGF免疫反應(yīng)陽性顆粒，呈淺棕色。與正常組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元NGF 陽性細胞數(shù)顯著減少(P<001)，著色淺淡。針刺組、西藥組與模型組比較，NGF 陽性細胞數(shù)顯著增加(P<005)，但兩組間比較，差異無顯著性意義(P>005)。結(jié)果見表1、圖2(見彩圖頁第615頁)。表1各組大鼠海

19、馬BDNF和NGF陽性神經(jīng)元的吸光度比較3討論海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與情緒、學(xué)習(xí)、記憶、行為、免疫等調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起關(guān)鍵作用。應(yīng)激所致的海馬樹突結(jié)構(gòu)重建、神經(jīng)元形成的減少和細胞生存能力的下降為抑郁癥患者海馬損害提供了細胞學(xué)基礎(chǔ)5。NGF和BDNF是神經(jīng)生長因子家族的兩個成員，其作用比較廣泛，胚胎發(fā)育期對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化、成熟以及突觸的形成不可缺少，成年期對神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性具有重要作用6。成熟的神經(jīng)元對刺激具有調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)和功能的能力，稱為可塑性。BDNF可能是作為這種結(jié)構(gòu)可塑性的分子媒介。有人認(rèn)為，NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)，BDNF可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活

20、性，其機制可能是改變了膽堿能神經(jīng)元的功能，進而調(diào)節(jié)了海馬神經(jīng)元的可塑性7。研究表明，海馬是成年大鼠神經(jīng)生長因子含量最高的部位，各種應(yīng)激造成海馬神經(jīng)元損害時，NGF和BDNF也會發(fā)生變化。如束縛應(yīng)激可以使大鼠齒狀回的NGF降低到正常的36%，BDNF也會同時降低8。心理及物理應(yīng)激能下降海馬BDNF mRNA水平，提示與應(yīng)激相關(guān)的抑郁癥與海馬BDNF有密切關(guān)系。本實驗也發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠海馬結(jié)構(gòu)中，BDNF陽性細胞表達較強，廣泛分布于海馬的錐體細胞和齒狀回的顆粒細胞層，細胞排列密集，著色深，有的有較長的突起。而模型組BDNF陽性細胞數(shù)量顯著減少，且多數(shù)細胞呈空泡狀，胞漿著色較淺。正常組大鼠海馬神經(jīng)元

21、中可見較多的NGF免疫反應(yīng)陽性顆粒，呈淺棕色,而模型組NGF 陽性細胞數(shù)顯著減少(P<001)，著色淺淡，說明抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元的損傷與BDNF和NGF下調(diào)有密切關(guān)系。本實驗結(jié)果還顯示：在給予針刺及氟西汀干預(yù)后，BDNF和NGF 陽性細胞數(shù)均較模型組顯著增加。針刺可以促進BDNF和NGF 表達，從而對海馬神經(jīng)元的可塑性進行調(diào)節(jié)，這可能是針刺抗抑郁的分子機制之一。抑郁癥屬中醫(yī)的“郁病”, 主要病機為肝郁氣滯、心脾兩虛和肝腎陰虛。其病位在腦，涉及肝、心等，故選擇百會、肝俞、心俞穴。百會屬督脈，督脈是人體諸陽經(jīng)脈之總匯，對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用，其主干行于脊里，向上行至項后風(fēng)府進入

22、腦內(nèi)，上循巔頂，故督脈與腦、脊髓關(guān)系相當(dāng)密切，歷代醫(yī)家素有“病變在腦，首取督脈”之說。百會為手足三陽經(jīng)與督脈及足厥陰肝經(jīng)之會，位居頭之巔頂，猶天之極星居北，為百脈聚會之處，是調(diào)補中氣、疏通腦絡(luò)、健腦寧神之要穴。心俞、肝俞為背俞穴，屬足太陽膀胱經(jīng)，其主干從頭頂入里絡(luò)于腦，故和腦的關(guān)系極為密切，兩穴除了調(diào)理心脾、疏肝理氣之外，還可健腦安神，是治療神志病的要穴，三穴共奏解郁調(diào)神的功效。【參考文獻】 1Duman R S, Malberg J, Thome J. Neural plasticity to stress and antidepressant treatmentJ. Biol Psychiatry, 1999, 46(9):1181.2 Kata L C, Lo D C. Neurotrophins and synaptic plasticityJ. Annu Rev Neurosci, 1999, 22(2): 295.3Willner P, Towell A, Sampson D, et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress and its restoration by a tricycli