蛋白質(zhì)測定實驗報告

1、蛋白質(zhì)測定方法化學(xué)報告蛋白質(zhì)的檢測附表蛋白質(zhì)測定方法的比較方法靈敏度時間原理干tt物hfi說明凱氏定氮法靈敏度低,適用于費時強將蛋白氮轉(zhuǎn)化為麻，非蛋白氮（可用三用于標(biāo)準(zhǔn)最白質(zhì)含(hgedaN 法)0. 2 7呢氮.in h.用戰(zhàn)吸收后滴定鶴做乙戰(zhàn)沉淀蛋白質(zhì)最的準(zhǔn)確測定；干誤差再±2%.而分離幾擾少;費時太長.収縮獗法靈敏度低中速,20賽肽犍+堿性硫酸K;Tris 沖用于快速測定但I(xiàn)Biuiut i±)20mg30mine一紫色絡(luò)合物口液；某些風(fēng)皐阱不太靈敏；不同審白質(zhì)顯色相似。紫外吸收法較為靈敏.50-快速,5 蛋白盛中的酪氨酸各種嚓吟和喻噪;用于層析桂流出液lOOug0m

2、inP柯色氨酸歿電在各種孩晉酸"的檢測；核酸的吸280an處的光吸收"收可以校正?？捡R斯亮藍(lán)法靈墩度最高.1快速*5 考號斯亮藍(lán)染料與強堿性緩沖液;吊最好的方法:干擾(Bradford 法)5也15皿叭蛋白質(zhì)結(jié)合時,其tonX* IOO;SDSs物質(zhì)少;鍥色穩(wěn)定；J由牝5nm變?yōu)轭伾顪\隨蛋白質(zhì)595 nm n不同而變化。酚類、檸檬 酸、硫酸銨、 tris緩沖液、甘 氨酸、糖類、 甘油等均有干 擾作用酚試劑法靈敏度較高 費時 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與20250mgCu2+ 螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合 物，此復(fù)合物使 酚試劑的磷鉬酸 還原，產(chǎn)生藍(lán)色 化合物由上表可大致了解五種

3、檢測蛋白質(zhì)的方法，下面 以實驗的形式進(jìn)行詳細(xì)闡述：1 材料與方法1.1 儀器材料(1) 儀器:凱氏定氮儀、紫外分光光度計、可見光分光光度計、工作離心機、布氏漏斗、 抽濾泵。(2) 試劑及原材料 :牛奶、酸奶、豆?jié){、 0.12mol/LpH=4. 7 醋酸- 醋酸鈉緩沖液、乙醇 -乙 醚等體積混合液、濃 H2SO4 、 40%氫氧化鈉、 30%過氧化氫、 2%硼酸溶液、 0. 050molPL 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液、硫酸鉀 - 硫酸銅接觸劑、混合指示劑、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、雙縮 脲試劑、考馬斯亮藍(lán) G- 250 試劑。1.2 實驗方法(1) 凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量將待測樣品與濃硫酸共熱 ,含氮有機物即分解產(chǎn)

4、生氨 (消化) ,氨又與硫酸作用 ,變成硫酸 銨。為了加速消化 ,可以加入 CuSO4 作催化劑和加入 K2SO4 以提高溶液的沸點 ,而加入 30%過氧化氫有利于消化溶液的澄清。消化好的樣品在凱氏定氮儀內(nèi)經(jīng)強堿堿化使之分 解放出氨 ,借蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中 ,然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定 ,記錄 ,計算出 樣品含氮量。每個樣品做三次重復(fù)測定 ,取平均值。(2) 紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中 ,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì) ,吸收峰在 280nm 處 ,其吸光度 (即光密度值 )與蛋白質(zhì)含量成正比。此外 ,蛋 白質(zhì)溶液在 238nm

5、的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系 ,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速 ,不消耗樣品 ,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽 ,例如 , 生化制備中常用的 (NH4)2SO4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定 ,特別適用于柱層析洗脫液 的快速連續(xù)檢測 ,因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化 ,而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多 ,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時 ,對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶

6、 及核酸等吸收紫外光的物質(zhì) ,會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表 ,再進(jìn)行 計算的方法加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的 ,雖 然經(jīng)過校正 ,測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測定時 ,由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 pH 的改變而有變化 ,因此要注意 溶液的 pH 值 ,測定樣品時的 pH 要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 pH 相一致。取待測樣品制成蛋白 濃度大約在0. 11. OmgPmL的蛋白質(zhì)溶液，用紫外分光光度計進(jìn)行比色，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線 得出樣品含氮量。每個樣品做 3 次重復(fù)測定 ,取平均值。(3) 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲(NH3CONHCONH

7、3)是兩個分子脲經(jīng)180 C左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn) 物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuS04形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個 酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙 縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點是測定較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少；主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測取待測樣品制成蛋白濃度大約在 110mgPmL的蛋白質(zhì)溶液，加雙縮脲試劑染色30min, 用可見光分光光度計進(jìn)行比色

8、，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個樣品做 3次重 復(fù)測定，取平均值。(4) 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量由于雙縮脲法(Biuret法)存在明顯的缺點和許多限制，因此1976年由Bradford建立的考 馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，這是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測 定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?！綛radford法的突出優(yōu)點是：a. 靈敏度高。據(jù)估計，比Lowry法約高4倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá) 1mg。這是因為蛋 白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收

9、值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。b. 測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定 ，只需要5min左右。由于染 料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2min即可完成，其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在520min之間，顏色的穩(wěn)定性最好，因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時 間。c. 干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry法的K、N且小獨離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘 油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是a. 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用丫 -球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋

10、白質(zhì)，以減少這 方面的偏差。b. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有去污劑、TritonX- 100、十二烷基 硫酸鈉(SDS)和0. 1N的NaOH。(如同0. 1N的酸干擾Lowry法一樣)。c. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定 未知蛋白質(zhì)的濃度?！咳〈郎y樣品加入考馬斯亮藍(lán)G- 250試劑放置5min后，用可見光分光光度計比色，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個樣品做3次重復(fù)測定，取平均值。2結(jié)果與分析2.1實驗結(jié)果表1樣品蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果牛奶酸奶豆?jié){凱氏定氮法3.092.130.81紫外吸收法一2.88雙縮詠法3. 162

11、. 160.91考馬斯亮藍(lán)法3,112. 180.862.2實驗結(jié)果分析(1) 凱氏定氮法可測出全部 3種樣品的蛋白含量，測試結(jié)果準(zhǔn)確，只是蒸餾與吸收裝置 復(fù)雜，不便于操作，實驗過程所需時間較長，操作復(fù)雜。(2) 紫外吸收法無法測出牛奶、酸奶的蛋白含量，測出的豆?jié){蛋白含量也與實際值相差較大，不具實際使用價值。此方法實驗過程簡單，適用于測試無色樣品，對于有色樣品需進(jìn)行預(yù)處理，排除顏色干擾后才適用于此方法。(3) 雙縮脲法適用于被測的3種樣品，實驗操作簡便迅速，但其缺點是靈敏度較低，蛋白質(zhì)量須在120mgPmL時測定結(jié)果較準(zhǔn)確。因此實驗前要估測被測樣品的蛋白含量把樣品稀釋至蛋白濃度為120mgPm

12、L。(4) 考馬斯亮藍(lán)染色法可以測出被測的全部 3種樣品，此方法快速、靈敏，但只有作微量蛋 白測定時的結(jié)果才準(zhǔn)確，因此在實驗前應(yīng)將樣品稀釋至蛋白濃度為 0. 11mgPmL,而且 實驗必須在1h內(nèi)完成，不然測試結(jié)果不準(zhǔn)確。(5 )酚試劑法原理：蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與 Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合 物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條 件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣 品中蛋白質(zhì)的濃度。優(yōu)點：操作簡便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含 量高于5即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之 一。缺點：費時間較長，要精確控制操作時

13、間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直 線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry 反應(yīng)。而 且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、 tris 緩沖液、 甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（ 0.5%）， 硫酸納（ 1%），硝酸納（ 1%），三氯乙酸（ 0.5%），乙醇（ 5%）， 乙醚（5%），丙酮（ 0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度 高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧 化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必 須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度 12倍。適用范圍：適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì) 量達(dá) 5mg 。通常測定范圍是 20250mg個人想法蛋白質(zhì)是我們生活中不可或缺的東西，無論是各種乳制品還是 一些保健產(chǎn)品，蛋白質(zhì)的含量無疑是一個受人矚目的指標(biāo)。然而，縱觀我們現(xiàn)在使用的這些蛋白質(zhì)檢測方法，很明顯 的都有一個“不適合大規(guī)模檢測”的特點，這對于現(xiàn)在的大規(guī)模 生產(chǎn)模式顯然不適用。而且，更為嚴(yán)重的是，所有的檢測方法 都會受到許多其它物質(zhì)的干擾作用，之前鬧得沸沸揚揚的三鹿 奶粉事件就是利用了凱式定氮法中的檢測漏洞（檢測時檢測的 是氮元素的含量，那么，