開題報告張羅霞32022

1、西南林業(yè)大學(xué)學(xué)術(shù)型碩士生學(xué)位論文開題報告基于兩種分子標(biāo)記分析不同干擾硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性AnalysisofgeneticdiversHyofPaphiopedilummicranthumindisturbedpopulationsbasedontwomolecularmarkers學(xué)號：20221104045姓名：張羅霞學(xué)科專業(yè)：園林植物與欣賞園藝研究方向：種質(zhì)資源導(dǎo)師姓名：李宗艷職稱：副教授報.口主持人報告日期：填表日期：2022年10月13日題目:填表說明1、開題報告是碩士生培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié),研究生需在導(dǎo)師的指導(dǎo)下認(rèn)真完成,具體要求參見?西南林業(yè)大學(xué)關(guān)于學(xué)術(shù)型研究生開題報告的規(guī)定202

2、2年修訂02、開題報告文獻(xiàn)綜述局部的根本要求：1國內(nèi)外本研究課題的開展現(xiàn)狀、趨勢及問題等,字?jǐn)?shù)3000字左右.2參考文獻(xiàn)量不少于20篇其中人文社科類不少于30篇,對于個別新興研究領(lǐng)域其文獻(xiàn)量可酌情減少.3文獻(xiàn)引用格式需符合?西南林業(yè)大學(xué)研究生學(xué)位論文格式的統(tǒng)一要求?的相關(guān)規(guī)定.3、完成時間：研究生開題工作應(yīng)于入學(xué)后第三學(xué)期內(nèi)完成,具體時間各學(xué)院可根據(jù)本學(xué)院的學(xué)科特點(diǎn)和實(shí)際情況進(jìn)行安排.4、碩士生開題報告書應(yīng)首先獲導(dǎo)師認(rèn)可和考核小組成員審閱前方可參加開題.5、打印要求：此表用A4紙雙面打印,各欄空格不夠時,請自行加頁.6、開題報告通過、修改、簽字完畢后,交各學(xué)院存檔一份.選題根本情況,本研究題目

3、為：1.導(dǎo)師課題的一局部M；2,委培單位的課題；3.其它須具體說明選題分類M1.根底研究M2,應(yīng)用研究3.綜合研究4.其他選題來源,2.國家社科規(guī)劃、基金工程4.國家自然科學(xué)基金工程6,省自治區(qū)、直轄市工程8,與港、澳、臺合作研究工程10.外資工程11.學(xué)校自選工程M12.國防工程13.非立項(xiàng)14.其他1.973、863工程3.教育部人文、社會科學(xué)研究工程5,中央、國家各部門工程7.國際合作研究工程9.企、事業(yè)單位委托工程一、立題依據(jù)1 .選題的理論和實(shí)踐意義兜蘭,又稱“女士拖鞋蘭、 “仙履蘭,是蘭科兜蘭屬(Paphiopedilum)植物的統(tǒng)稱.在拉丁語中,兜蘭的屬名Paphiopedilu

4、m由愛神Paphos和鞋子Pedilon組合而成,即愛神之鞋,以其唇瓣的形狀而得名.兜蘭是蘭科植物中最具特色的一個類群,也是最奇特的欣賞蘭花1,2.本屬植物的花形十分奇特,唇瓣呈兜狀,酷似舊時歐洲淑女的拖鞋；背萼特別興旺,具有艷麗的花紋.兜蘭以其獨(dú)特的花型而備受世界花卉愛好者的鐘愛3o近年來花卉產(chǎn)業(yè)開展迅速,而兜蘭做為蘭科欣賞價值最高的屬,深受廣闊消費(fèi)者喜愛,人們對其需求量不斷增加,導(dǎo)致野生種質(zhì)資源的大量采挖,造成野生種群數(shù)量的急劇減少,急需采取有效的保護(hù)舉措.我國產(chǎn)兜蘭屬植物18種,主要分布于西南地區(qū),大多數(shù)的兜蘭種產(chǎn)于石灰?guī)r地區(qū)的生境脆弱帶,盡管兜蘭屬植物具有克隆生長特性,但其生長緩慢,人

5、為過度利用產(chǎn)生野外小種群,導(dǎo)致種群地理隔離距離加大,種群基因流水平下降,種群空間遺傳多樣性變化.硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)和杏黃兜蘭(Paphiopedilumarmeniacum)是兜蘭屬植物采集壓力最大的種,對不同采集強(qiáng)度環(huán)境的種群的遺傳多樣性進(jìn)行研究,為其保護(hù)提供根底依據(jù).本研究以天然種群和人工干擾種群硬葉兜蘭種群的遺傳多樣性變異分析,通過對SSR和葉綠體間隔基因(psbA-trnH)技術(shù)比擬不同干擾程度種群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)差異和種群內(nèi)的遺傳分化水平,為今后干擾種群的保護(hù)舉措的采用提供分子依據(jù).2 .文獻(xiàn)綜述國內(nèi)外本研究領(lǐng)域的開展現(xiàn)狀、趨勢及問題等,并附參

6、考文獻(xiàn)2.1我國兜蘭屬植物的概況全世界約有兜蘭屬植物66種,近年來發(fā)表了10余個新種,總數(shù)增加到80余種4,主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),其中1/3以上分布于中國.其中云南、 廣西和貴州分布最多,全部種因其獨(dú)特的造型,繽紛的色彩讓研究者嘆為觀止,讓欣賞者賞心悅目.其中杏黃兜蘭和白花兜蘭2種為我國特產(chǎn)種.杏黃兜蘭和硬葉兜蘭被并稱為“金童玉女,是蘭花中的珍品,備受世人的關(guān)注.針對野生兜蘭受到掠奪性采挖和貿(mào)易而導(dǎo)致該類群植物迅速減少甚至滅絕的狀況,?華盛頓公約?即?瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約?,ConventiononInternationalTradeinEndangeredSpeciesofWi

7、ldFaunaandFlora,CITES把所有兜蘭屬植物列入其附錄一名錄,等同于大熊貓的保護(hù)等級,受到國際社會的嚴(yán)格保護(hù).兜蘭屬植物大多分布于熱帶地區(qū),不少種類喜生石灰?guī)r山地,見于疏灌從中或林緣,性喜濕潤而溫暖的環(huán)境,但要預(yù)防陽光灼射和排水不暢.夏季要預(yù)防高溫,冬季不應(yīng)低于12-15C.5.2.2分類學(xué)分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于蘭科植物的分類鑒定和品種鑒別,為蘭花的分類提供了分子水平的證據(jù),也為蘭花保護(hù)策略和舉措的制定提供了理論根底.但至今為止,國內(nèi)外用此技術(shù)研究兜蘭屬遺傳多樣性的報道并不多見.AntonyVCox等6應(yīng)用核rDNA的ITS核甘酸序列數(shù)據(jù),研究杓蘭屬、兜蘭屬、美洲兜蘭屬、碗蘭屬、墨西

8、哥蘭屬的150170個種之間的親緣關(guān)系,其中兜蘭屬的研究包括了中國兜蘭屬的15個原生種.研究認(rèn)為sectionParvisepalum應(yīng)從短瓣亞屬subgenusBrachypetalum中戈U出另立一亞屬subgenParvisepalum;而sectionCoryopedilum和sectionPardalopetalum應(yīng) 歸 為 一 個 組sectionPardalopetalum.ITS樹狀圖明確了5個屬和各屬內(nèi)種間的親緣關(guān)系,兜蘭屬的劃分與Cribb的傳統(tǒng)分類根本一致.國內(nèi)也有應(yīng)用分子標(biāo)記的報道,孫彩云口曾利用RAPD口同工酶分子標(biāo)記技術(shù)來分析中國兜蘭種間親緣關(guān)系.研究結(jié)果顯示,R

9、APD和同工酶兩種手段對種間親緣關(guān)系的劃分與傳統(tǒng)分類大致吻合,同工酶比RAPD的結(jié)果更接近傳統(tǒng)分類.兜蘭亞屬需進(jìn)一步分組,彩云兜蘭、卷萼兜蘭、紫紋兜蘭及其變種云南虎皮應(yīng)自成一個組,白花兜蘭和同色兜蘭的真正的分類學(xué)位置應(yīng)如何確定尚需進(jìn)一步研究.陳業(yè)網(wǎng)等通過對兜蘭屬植物ISSR-PCR反響體系的優(yōu)化和對23種中國兜蘭屬植物親緣關(guān)系的ISSR分析,得出了比擬適合兜蘭屬植物ISSR反響體系.而23種中國兜蘭屬植物親緣關(guān)系的ISSR分析中得出：ISSR標(biāo)記能夠準(zhǔn)確的將23種中國兜蘭屬植物劃分為小萼亞屬、寬瓣亞屬和兜蘭亞屬3個亞屬,與劉仲健等的觀點(diǎn)一致,說明分子證據(jù)與形態(tài)特征是吻合的.朱亞艷等的利用SRA

10、小子標(biāo)記對貴州南部地區(qū)8個野生兜蘭的遺傳多樣性進(jìn)行分析,將不同來源野生兜蘭分為3組,研究顯示兜蘭基于SRAP分子標(biāo)記的聚類分析與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致.K.F.Rodrigues等11,實(shí)驗(yàn)說明三個亞種群之間有有限的遷移和相當(dāng)程度的種群之間的遺傳分化fit=0.5098暗示基因流動已經(jīng)由于棲息地的分裂中斷.曾宋君12以3個群體30個同色兜蘭個體為材料對兜蘭引種繁殖雜交育種和SSR引物開發(fā),研究說明,同色兜蘭同巨瓣兜蘭的遺傳距離較遠(yuǎn),文山兜蘭同巨瓣兜蘭的親緣關(guān)系較近.盧家仕等13通過對20份蘭科植物的ISSR遺傳多樣性分析,最后得出蘭屬與毛蘭屬親緣關(guān)系最近,兜蘭屬與蘭屬、毛蘭屬一起聚為一組,石斛屬與

11、其它3個屬的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn).2.3根底生物學(xué)2.3.1形態(tài)與細(xì)胞生物學(xué)唐漢耕司14對幾十種兜蘭進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的觀察和核型分析,并在此根底上進(jìn)行了分類上的討論,將兜蘭屬劃分成六個亞屬.BraemGJ15對兜蘭屬的分類與唐漢耕司的基本一致.任玲等對兜蘭P.godefroyaeStein有性生殖全過程曾有過詳細(xì)的研究.結(jié)果說明兜蘭胚珠具一層珠被,胚囊發(fā)育為蔥型,胚乳具二核.種子成熟時胚柄及胚乳核都消失.成熟種子只具單層細(xì)胞的種皮和一個未分化的球形胚.單粒分散的花粉包裹于黃色粘性物質(zhì)中.推測此粘液可能是花粉鞘類物質(zhì),它使得傳粉效率更高,但這種花粉團(tuán)塊的結(jié)構(gòu)在兜蘭屬中是否普遍,在蘭科植物系統(tǒng)發(fā)育上有何意

12、義,還需要進(jìn)一步的比擬和觀察16.孫安慈17對蘭科植物的蘭屬、 兜蘭屬及石斛屬16個種的葉片及其橫斷面進(jìn)行了掃描電鏡的觀察.觀察發(fā)現(xiàn)兜蘭屬的各個種上下表皮細(xì)胞均為多邊形,花葉類上表皮細(xì)胞外表明顯呈乳突狀,葉肉有分化；綠葉類呈龜背狀隆起,葉肉不分化.葉表皮細(xì)胞形狀、外表的突起和紋飾、葉肉分化與否等反映了各屬的特征.葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)特征也反映了各個種的生長習(xí)性,對生長環(huán)境的適應(yīng).因此,認(rèn)為葉片的形態(tài)特征可以作為種、屬分類的參考.王英強(qiáng)8通過分析國產(chǎn)兜蘭屬植物的生態(tài)地理分布特點(diǎn)和開展趨勢,以及兜蘭屬植物系統(tǒng)演化趨勢與生態(tài)地理環(huán)境的關(guān)系,說明國產(chǎn)兜蘭主要分布于熱帶過渡地區(qū)南亞熱帶,主產(chǎn)于西南各省區(qū)；大多數(shù)

13、種類生長于石灰?guī)r山地,多為半附生蘭,呈叢生生長.2.3.2繁殖生物學(xué)利用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行大規(guī)?？寺》敝?無疑可以減輕對野生兜蘭植物的采集壓力.由于兜蘭原生種的組織培養(yǎng)較難,雜交種的組織培養(yǎng)相對較易,因此利用雜交種進(jìn)行組織培養(yǎng)是國外兜蘭商品化種苗生產(chǎn)的主要方式.兜蘭與大多數(shù)洋蘭一樣,由于種子的胚發(fā)育不完全,在自然狀況下需與真菌共生才有極少數(shù)的萌發(fā).國內(nèi)外對兜蘭菌根的研究開展緩慢.李明19曾采用根組織切片法從杏黃兜蘭根內(nèi)別離到13株真菌,其中以鐮刀菌和組絲核菌為優(yōu)勢菌.將組絲核菌JF74,JF75,JF80制成菌劑,施入杏黃兜蘭根部,對杏黃兜蘭產(chǎn)生了一定的促進(jìn)生長的效果.但是鐮刀菌對杏黃兜蘭是有

14、益還是有害及其作用機(jī)理還待進(jìn)一步研究.目前的組織培養(yǎng)研究著重于優(yōu)化培養(yǎng)條件,如外植體的取材、培養(yǎng)基成分和激素的選擇試驗(yàn).研究發(fā)現(xiàn)用雜交種兜蘭的外植體誘導(dǎo)類原球莖較易獲得成功20-27,然而采用無菌種子萌發(fā)技術(shù),已成功地獲得多種兜蘭的無性克隆個體28-31.武榮花陽等綜述了兜蘭屬植物擴(kuò)繁研究主要集中于分株繁殖、組織培養(yǎng)、有菌播種以及無菌播種4個方面.目前,這些方面都取得了一些成果,特別是組織培養(yǎng)和無菌播種.現(xiàn)在人工栽培的兜蘭主要依靠分株進(jìn)行繁殖,但是繁殖系數(shù)很低.隨著人口增長、環(huán)境變化、濫伐森林和耕地沙漠化,一些珍稀的物種以及具有抗蟲、病、毒、不良環(huán)境潛能的地方栽培品種已經(jīng)滅絕或?yàn)l于絕種.此外,

15、因植物育種技術(shù)的開展,高產(chǎn)品種單一化趨勢日益明顯,植物遺傳根底越來越窄.因此,利用植物組織和細(xì)胞保存種質(zhì),所占空間小,基因型穩(wěn)定,受外界影響小,同時也便于種質(zhì)交換和轉(zhuǎn)移,防止有害病蟲的人為傳播.然而,在兜蘭屬植物的種質(zhì)資源保存技術(shù)方面國內(nèi)外仍然是空白.2.3.3傳粉生物學(xué)HansB?nziger從1990到1994年共花了224小時持續(xù)在泰國常綠林里觀察紫毛兜蘭,發(fā)現(xiàn)其周圍大約有100種雙翅目食財蠅,在15個實(shí)驗(yàn)對象中有效花粉傳播者主要為雌性的Episyrphusalternans,Syrphusfulvifacies,Betasyrphusserarius.紫毛兜蘭靠花色和散發(fā)出類似尿素的味

16、道來吸引遠(yuǎn)距離的昆蟲,退化雄蕊可能是模擬一滴蜜汁或露水)引誘近距離昆蟲.當(dāng)昆蟲被吸引時,便著陸于中央一突疣(偽裝成棲木),因限制不住而滑入兜內(nèi).為了預(yù)防昆蟲飛出,唇瓣形成囊狀,所以昆蟲只能擦過柱頭,粘上花藥逃出去.粘稠的花藥至少可以持續(xù)8周的生活力,但只有8%勺植株可以產(chǎn)生痂果33.劉可為34等對杏黃兜蘭的傳粉生物學(xué)進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)杏黃兜蘭的繁育系統(tǒng)是兼具異交和自交的混合交配系統(tǒng).杏黃兜蘭是一種食源性欺騙的植物,它模仿食源性植物黃花香.止匕外,通過檢測還發(fā)現(xiàn)杏黃兜蘭的花粉為脂質(zhì)；花粉活力和柱頭可授性在花朵開放期內(nèi)具有同步性,而花粉在柱頭凋落后仍具活力,去除了雄蕊可明顯延長花朵開放時問.2.4

17、兜蘭屬植物的保護(hù)珍稀瀕危植物的保護(hù)主要有三種方法,第一種是就地保護(hù),即保護(hù)珍稀瀕危植物的生境,讓其自然繁殖；第二種是遷地保護(hù),即利用植物園等保育基地,創(chuàng)造人為環(huán)境進(jìn)行保護(hù)；第三種是自然回歸,即通過人工繁育種苗再回歸種植到自然中去,使瀕危植物的種群迅速擴(kuò)大,在目前來說,遷地保護(hù)仍是珍稀瀕危植物最實(shí)用的最有效的物種保護(hù)手段：35-360國外對兜蘭屬植物的引種栽培已有較為系統(tǒng)的研究所381邱園更是遷地保護(hù)了世界上60多種兜蘭屬植物.我國對兜蘭屬植物的引種馴化和遷地保護(hù)的研究起步較晚,目前僅有少數(shù)報道,如貴州省亞熱帶植物研究所和黔西南州綠緣動植物科技開發(fā)在對所引種的24種兜蘭的成活率、繁殖率、開花率和

18、長勢進(jìn)行綜合分析的根底上,認(rèn)為杏黃兜蘭、硬葉兜蘭在貴州地區(qū)具有較強(qiáng)的適應(yīng)性、彩云兜蘭的適應(yīng)性較差：39：;中國科學(xué)院華南植物園曾宋君1肛等科研人員對我國國產(chǎn)的所有27種兜蘭進(jìn)行了引種栽培并獲得成功,但一些種類在華南地區(qū)引種栽培時與在貴州地區(qū)栽培時的適應(yīng)性表現(xiàn)出巨大的差異性,如杏黃兜蘭、硬葉兜蘭葉片變小、開花率低,表現(xiàn)出較差的環(huán)境適應(yīng)性,而彩云兜蘭盡管產(chǎn)于云南,卻表現(xiàn)出很好的適應(yīng)性；曾宋君也等在此根底上又對我國國產(chǎn)的兜蘭屬植物欣賞價值進(jìn)行了評價對對其在華南地區(qū)的應(yīng)用前景進(jìn)行了分析.其它有關(guān)兜蘭屬植物的引種馴化研究主要集中在杏黃兜蘭上,如劉仲健等對杏黃兜蘭的保育生態(tài)學(xué)研究中,將杏黃兜蘭引種到深圳人

19、工疏林下栽培時,生長良好并繁殖出許多無性的克隆分株,將繁殖的克隆分株重返原產(chǎn)地能正常開花；皮秋霞：43：等在對杏黃兜蘭的花發(fā)育過程研究及引種栽培時發(fā)現(xiàn),不同時間引種到昆明栽培等研究了不同的遮蔭和施肥處理對杏黃蘭的葉綠素含量和葉片的長、寬和厚度的影響.劉曉燕研究不同的栽培基質(zhì)對瘤瓣兜蘭(P.callosum)的生長和凈光合作用率的影響：44102022年至2022年,我們已引種到44種國外兜蘭屬植物并在種華南植物園保育溫室中栽培,所有種類均成活,36種已開花,但引種成活率、生長狀態(tài)和開花率均表現(xiàn)出較大的差異45.羅毅波46等在了解了國際蘭科植物研究和保育的最新進(jìn)展和開展趨勢的根底上,提出國內(nèi)關(guān)于

20、蘭科植物保育的研究與國際同類工作相比存在不小的差距.他們認(rèn)為蘭科植物由于其單個果實(shí)內(nèi)具有成千上萬顆種子,因而利用種子進(jìn)行大規(guī)模繁殖就成為蘭科植物遷地保護(hù)的重要手段.李昂47采用空間自相關(guān)分析方法對硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)和獨(dú)花蘭(Changnieniaamoena)4個天然群體的小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,以探討兩種蘭科植物群體內(nèi)遺傳變異的分布特征及其形成機(jī)制.結(jié)果說明,適時的遷地保護(hù)對硬葉兜蘭是必要的.上述研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解物種的進(jìn)化歷程和瀕危機(jī)制,并且能為制定有效的保護(hù)策略和舉措提供科學(xué)依據(jù).李宗艷照基于ISSR的硬葉兜蘭居群遺傳多樣性研究結(jié)論與S

21、RAP(據(jù)和李昂的初步檢測結(jié)論是一致的,即硬葉兜蘭種水平遺傳多樣性遠(yuǎn)高于居群水平,但與黃家林等報道的較高水平的居群遺傳多樣性(PP氏80.28%,H0.2847,I=0.4236)結(jié)果有較大出入49.李宗艷等通過利用SRAFW記對167個滇東南硬葉兜蘭個體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究50,結(jié)果說明居群間遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性.居群當(dāng)前較高的遺傳分化與其交配系統(tǒng)有關(guān).高麗霞等通過采自廣西木論自然保護(hù)區(qū)的天然居群的40份帶葉兜蘭,進(jìn)行遺傳多樣性的SRA叫析51,結(jié)果說明40份帶葉兜蘭種質(zhì)的遺傳變異處于較低水平,遺傳多樣性不夠豐富.這些工作都為今后對兜蘭的保護(hù)提供了根本的依據(jù).2.5兜蘭屬植物

22、的利用兜蘭屬(Paphiopedilum)的雜交育種已有150多年的歷史,目前已有20262個雜交種在英國皇家園藝協(xié)會(RHS)登錄回.由于對兜蘭野生種質(zhì)資源的保護(hù)更加嚴(yán)格,兜蘭雜交種已越來越受到蘭花愛好者的青睞,所以利用優(yōu)良的兜蘭雜交種為親本進(jìn)行新品種選育,能大大縮短新品種培育的時間530充分利用我國豐富的兜蘭種質(zhì)資源進(jìn)行新品種的培育； 兜蘭與杓蘭屬、美洲兜蘭屬來自同一個祖先,關(guān)系極為密切,可以充分利用我國豐富的杓蘭屬資源進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交54.著重進(jìn)行多花長瓣型和大花型兜蘭的育種.盡管目前多花長瓣型兜蘭在我國花卉市場很少見,但其獨(dú)特的欣賞價值十分符合我國大眾的審美.國產(chǎn)兜蘭主要分布于熱帶過渡地區(qū)

23、(南亞熱帶),主產(chǎn)于西南各省區(qū)； 國產(chǎn)兜蘭屬中最原始的短瓣亞屬絕大局部種類僅分布在滇東南地區(qū)與貴州、廣西連成一片的巖溶地貌的石灰?guī)r地區(qū),而兜蘭屬中較進(jìn)化的兜蘭亞屬大局部種類在本區(qū)皆有分布.這說明滇東南的石灰?guī)r地區(qū)可能是兜蘭屬的起源中央55.我國滇東南地區(qū)具有重大的科研價值、景觀價值、文化價值和產(chǎn)業(yè)提升價值.我國原種兜蘭資源在20世紀(jì)80、90年代已遭受了較為強(qiáng)烈的人為破壞,很多原種被大量采挖,到達(dá)了瀕危的地步.自20世紀(jì)80年代以來,中國科學(xué)院植物園一直從事兜蘭屬植物的引種、馴化工作,現(xiàn)已引種栽培寬瓣亞屬及兜蘭亞屬的野生兜蘭13種,目前均表現(xiàn)良好.昆明園林科研所已成功引種野生兜蘭13種,存苗2

24、萬余株,栽培于昆明植物園的蘭圃560鄒秉左57曾從云南、貴州、廣西、廣東、海南等省引種了許多我國野生兜蘭.另外,深圳梧桐山苗圃總場收集了大量的野生兜蘭,并發(fā)現(xiàn)了一些新的種和變種；北京中山公園栽培蘭花的時間較長,并且積累了兜蘭栽培的一些成功經(jīng)驗(yàn).北京中山公園栽培蘭花的時間較長,并且積累了兜蘭栽培的一些成功經(jīng)驗(yàn).但與蝴蝶蘭、大花蕙蘭、石解等其他的欣賞性蘭花相比,還有很大的空間.綜上所述兜蘭屬的研究在分子上有很大的進(jìn)展,都為制定有效的保護(hù)策略和舉措提供了科學(xué)依據(jù)；在西南各省區(qū)是兜蘭分布較多的區(qū)域,各有關(guān)門應(yīng)增強(qiáng)宣傳,嚴(yán)格執(zhí)法,增強(qiáng)人們的環(huán)保意識.2.6基于保護(hù)研究存在問題兜蘭由于其具有極高的欣賞價值

25、和較高的經(jīng)濟(jì)價值,在國內(nèi)外受到了廣泛深入的研究,主要集中在原生種質(zhì)資源、雜交育種、栽培、繁殖、花期調(diào)控等方面的研究,現(xiàn)已培育了數(shù)以千計的雜交種,但是相比其他蘭科植物而言還存在差距主要有以下幾點(diǎn)：(1)兜蘭屬遺傳多樣性的研究較少.(2)缺乏對兜蘭屬植物更為準(zhǔn)確和詳盡的分子資料(3)兜蘭屬植物的就地保護(hù)率極低.(4)兜蘭屬植物保護(hù)的關(guān)注度與保護(hù)等級極低.(5)以兜蘭屬植物為主要保護(hù)對象的自然保護(hù)區(qū)數(shù)量很少(6)很多自然保護(hù)區(qū)綜合科考資料較為粗糙,疏漏較多.參考文獻(xiàn)：1BRAEMG,CHIRONG.PaphiopedilumM.Paris:Tropicalia,1988.2CRIBBPJ.TheGe

26、nusPaphiopedilum(Ed.2)M.KotaKinabalu:NaturalHistoryPublications(Borneo),1998.3劉仲健,張建勇,茹正忠,等.蘭科紫紋兜蘭的保育生物學(xué)研究J.生物多樣性,2022,12(5):509-516.2沐建華.文山兜蘭屬植物多樣性研究J.文山學(xué)院學(xué)報,2022,(3):124-1314羅毅波,賈建生,王春玲.初論中國兜蘭屬植物的保護(hù)策略及其潛在資源優(yōu)勢J.瀕危物種科學(xué)通訊,2022,4(2):11-20.5劉仲健,張建勇,茹正忠,等.蘭科紫紋兜蘭的保育生物學(xué)研究J.生物多樣性,2022,12(5):509-516.6COXAV,

27、PRIDGEONAM,etal.Phylogeneticsoftheslipperorchids(Cypripedioideae,Orchidaceae):nuclearrDNAITSsequencesJ.PlantSystematicsandEvolution,1997,208:197-223.7孫彩云,張明永,葉秀奔,等.利用RAP前同工酶研究中國兜蘭屬種間親緣關(guān)系J.園藝學(xué)報,2022,32(2):268-272.8陳業(yè),石建明,沈文華,江多I,關(guān)萍.23種中國兜蘭屬植物親緣關(guān)系的ISSR分析J.西南大學(xué)學(xué)報,2022,35(6):15-21.9劉仲健,張建勇,徐向明,等.同色兜蘭及其親

28、緣群的研究J.云南植物研究,2000,22(4):390-394.10朱亞艷,王港,侯娜,王蓮輝.貴州南部野生兜蘭SRAPfi傳多樣性分析J.西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2022(1):10-14.11K.F.Rodrigues;S.V.Kumar.Isolationandcharacterizationof24microsatellitelociinPaphiopedilumrothschildianum,anendangeredslipperorchidJ.ConservationGenetics,2022,10(1):127-130.12曾宋君.兜蘭引種繁殖雜交育種和SSR引物開發(fā)研究J.中國科學(xué)

29、院研究生院.2022.13盧家仕,卜朝陽,呂維莉,何荊洲,等.20份蘭科植物的ISSR遺傳多樣性分析J.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報.2022,25(6):2252-2257.14唐漢耕司.Z7彳才71/AM.U文堂新光社,1982.15BRAEMGJ.Paphiopedilum:EineMonographiealler,Frauenschun-orchideenderasiatischenTropoenundSubreopenM.Hildesheim:Schmersow,1998.16任玲,王伏雄.兜蘭胚胎學(xué)的研究J.植物學(xué)報,1987,29(1):14-21.17孫安慈.蘭屬、兜蘭屬、石斛屬植物葉片的掃描

30、電鏡觀察J.武漢植物學(xué)研究,1995,13(4):289-294.18王英強(qiáng).中國兜蘭屬植物生態(tài)地理分布J.廣西植物,2000,20(4):289-294.19李明,張灼.杏黃兜蘭菌根研究與應(yīng)用J.生物學(xué)雜志,2001,18(6):17-18.20張曉紅,徐濤,谷祝平.兜蘭類原球莖的誘導(dǎo)及植株再生J.生物多樣性研究進(jìn)展.21HUANGLC,LINCJ,KUOCI.PaphiopedilumcloninginvitroJ.ScientiaHorticulturae,2001,91:111-121.22CHENTY,CHENJT.Multipleshootformationandplantrege

31、nerationfromstemnodalexplantsofPaphiopedilumorchidsJ.InVitroCellularandDevelopmentBiology-Plant,2022,38:595-597.23CHENTY,CHENJT,CHANGWCH.PlantregenerationthroughdirectshootbutformationfromleafculturesofPaphiopedilumorchidsJ.PlantCell,TissueandOrganCulture,2022,76:11-15.24曹受金,田英翠,潘百紅,等.兜蘭組培快繁影響因素分析J.

32、北方園藝,2022,(3):79-80.25LINYH,CHANGCH,CHANGWC.PlantregenerationfromcalluscultureofaPaphiopedilumhybridJ.Plantcell.TissueandOrganCulture,2000,62:21-25.26STIMARTDP,ASCHERPD.InvitrogerminationofPaphiopedilumseedonacompletelydefinedmediumJ.ScientiaHorticulturae,1985,26:57-67.27PIERIKRLM.Seedgerminationand

33、furtherdevelopmentofplantletsofPaphiopedilumciliolarePfitz.invitroJ.ScientiaHorticulturae,1987,34:139-153.28陳之林,葉秀嶙,梁承鄴,等.杏黃兜蘭和硬葉兜蘭的種子試管培養(yǎng)J.園藝學(xué)報,2022,31(4):540-54229丁長春,虞泓,劉方媛.影響杏黃兜蘭種子萌發(fā)的因素J.云南植物研究,2022,26(6):673-677.30丁長春,虞泓,劉方媛,等.杏黃兜蘭胚培養(yǎng)與快速繁殖J.植物生理學(xué)通訊,2022,41(1):55.31NHUTDT,TRANGPTT,VUNH,etal.Awou

34、ndingmethodandliquidcultureinPaphiopedilumdelenatiipropagationJ.PropagationofOrnamentalPlants,2022,5(3):158-163.32武榮花,張曉.兜蘭屬植物繁殖生物學(xué)研究進(jìn)展J.河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2022,42(4):6-1033BNZIGERH.Themesmerizingwart:thepollinationstrategyofepiphyticladyslipperorchidPaphiopedilumvillosum(Lindl.)Stein(Orchidaceae)J.BotanicalJou

35、rnaloftheLinneanSociety,1996,121:59-90.34劉可為,劉仲健,雷嗣鵬,等.杏黃兜蘭傳粉生物學(xué)的研究J.深圳特區(qū)科技,2022,11:171-178.35CribbPJ,KellSP,DixonKW,etal.Orchidconservation:aglobalperspectiveM/DixonKWKellSP,BarrettRL,etal.OrchidConservationKotaKinabalu:NaturalHistoryPublications(Borneo),2022:1-24.36許再富.稀有瀕危植物遷地保護(hù)的原理與方法M.昆明：云南科技出版社

36、,1998.37CribbP.TheGenusPaphiopedilumML2nded.KotaKinabalu:NaturalHistoryPublications(Borneo),1998:22-30.38BirkLA.PaphiopedilumgrowersmanualM.2nded.California:PisangPress,2022:28-281.39羅曉青,王代谷,鄧克云,等.貴州省興義市兜蘭屬植物引種馴化研究J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2022,37(20):9459-9460.40曾宋君,陳之林,吳坤林,等.國產(chǎn)兜蘭屬植物的引種和栽培J.中國野生植物資源,2022,29(2):53-5

37、8.41曾宋君,夏念和,陳之林,等.國產(chǎn)兜蘭屬植物欣賞價值評價及其在華南地區(qū)的應(yīng)用前景分析JL中國野生植物資源,2022,30(2):9-13.42劉仲健,劉可為,陳利君,等.瀕危物種杏黃兜蘭的保育生態(tài)學(xué)J.生態(tài)學(xué)報,2022,26(9):2791-2800.1043皮 秋 霞 , 嚴(yán) 寧 , 胡 虹 , 等 . 杏 黃 兜 蘭 的 花 發(fā) 育 過 程 及 引 種 栽 培 J.云 南 植 物 研究,2022,31(4):293-302.44劉 曉 燕 . 不 同 栽 培 基 質(zhì) 對 兜 蘭 生 長 及 葉 片 凈 光 合 速 率 的 影 響 J.西 南 農(nóng) 業(yè) 學(xué)報,2022,19(1):44

38、-4945曾宋君,陳硯,吳坤林,等.國外兜蘭屬植物的引種和栽培初報J.中國野生植物支援,32(5):62-68.46羅毅波,賈建生,王春玲.中國蘭科植物保育的現(xiàn)狀和展望J.生物多樣性,2022,11(1):70-77.47李昂,羅毅波,葛頌.采用空間自相關(guān)分析研究兩種蘭科植物的群體遺傳結(jié)構(gòu)J.生物多樣性,2022,10(3):249-257.48李宗艷,管名媛,李靜,李名揚(yáng).基于ISSR的硬葉兜蘭居群遺傳多樣性研究J.西北植物學(xué)報,2022,36(7):13511352.49HUANGJia-Lin;LIShu-Yun;HUHong.ISSRandSRAPMarkersRevealGeneti

39、cDiversityandPopulationStructureofanEndangeredSlipperOrchid,Paphiopedilummicranthum(Orchidaceae)J.PlantDiversity,2022,36(2):209-218.50李宗艷,李靜,曾萬標(biāo),等.滇東南硬葉兜蘭核心種質(zhì)區(qū)群體遺傳結(jié)構(gòu)J.植物遺傳資源學(xué)報,2022,14(3):407-413.51高麗霞,覃國樂,易桂萍.帶葉兜蘭遺傳多樣性的SRAf析J.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2022,45(10):1734-1738.52MaiF.TheGenusPaphiopedilumM.Taibei:ShuqinPr

40、ess,1987:50-52.53曾宋君,田瑞雪,陳之林,等.兜蘭屬植物雜交育種研究進(jìn)展J.北方園藝2022(15):103-10654CoxAV,AlbertVA,ChaseMW.Phylogenetiesoftheslipperorchids(CypripedioideaeOrehidaceae):NuclearrDNAITSsequencesJ.PlantSystEvol,1997,208:197-223.55龍波,龍春林.兜蘭屬植物及其研究現(xiàn)狀J.自然雜志,2022,28(6):341-344.56李潔.2022.云南野生兜蘭的引種栽培.中國野生植物資源,21(2):61-63.57鄒

41、秉左.1998.兜蘭及其引種栽培.花木盆景,(5):10-11.11二、研究方案1 .研究內(nèi)容、研究目標(biāo)及擬解決的關(guān)鍵問題1.1研究內(nèi)容1不同干擾程度對種群遺傳多樣性指數(shù)的變化；2不同干擾程度對種群的遺傳分化程度和基因流的水平；遺傳多樣性指標(biāo)：觀測等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、Neis基因多度H、香儂指數(shù)I、多態(tài)位點(diǎn)比率PPB、遺傳分化系數(shù)Gst、種群的遺傳分化指數(shù)Gst、分子遺傳變異組成AMOVA等.1.2研究目標(biāo)采用葉綠體轉(zhuǎn)錄間隔基因psbA-trnH和SSR標(biāo)記對3個天然種群和3個人工干擾種群樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物測序和檢測,比擬天然種群和干擾小種群在種群內(nèi)和種群間的遺傳多

42、樣性指數(shù)、分子遺傳變異組成、遺傳分化程度的差異,評估人為過度采集對種群遺傳多樣性的影響.1.3擬解決的關(guān)鍵問題1干擾對種群不同遺傳多樣性指數(shù)的影響；2干擾對種群內(nèi)遺傳變異組成的影響；3干擾對種群的遺傳分化程度；122.擬采用的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析2.1擬采用的研究方法(1)樣品的米集：米集時各種選取時,每隔兩米米取生長健壯、無病蟲害的葉片混合；葉片采集后低溫保存,帶回實(shí)驗(yàn)室后放入-70C保存,用液氮研磨后保存于-70C.(2)基因組DNA的提?。翰捎酶倪M(jìn)CTAB方法從葉片中提取硬葉的DNA.(3)引物篩選和PCR擴(kuò)增反響體系的優(yōu)化：應(yīng)用已開發(fā)cp-SSR引物和psbA-tr

43、nH引物對硬葉兜蘭基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增反響并優(yōu)化反響體系.(4)凝膠電泳檢測：瓊脂糖凝膠電泳法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測.(5)葉綠體間隔基因擴(kuò)增數(shù)據(jù)處理：對psbA-trnH結(jié)果進(jìn)行測序,將獲得的基因序列進(jìn)行NCBI網(wǎng)上的blast比對,采用DNASTAR軟件對獲得的基因序列進(jìn)行比對.(6)cp-SSR程序反響產(chǎn)物的數(shù)據(jù)處理： 依據(jù)電泳圖譜中l(wèi)addermarker標(biāo)準(zhǔn)分子量對擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行分子量編碼,同一引物組合擴(kuò)增的分子量相同的條帶視為同一位點(diǎn).電泳圖譜中的每個樣品的擴(kuò)增帶按有或無記錄,有帶賦值為1,無帶賦值為0,得到原始數(shù)據(jù)矩陣,用PopGen32軟件計算各遺傳多樣性指標(biāo)；基于Neis遺傳距

44、離用NTSYS-pc2.1軟件采用UPGMA方法進(jìn)行居群親緣關(guān)系構(gòu)建；分子遺傳變異的方差分析(AMOVA)和Mantel檢測用GenALEX軟件計算.2.2技術(shù)路線硬葉兜蘭樣品的采集一基因組DNA的提取一引物篩選和PCR擴(kuò)增反響體系的優(yōu)化一凝膠電泳檢測一測序一數(shù)據(jù)處理2.3可行性分析1、已經(jīng)采得了天然種群和干擾種群樣品并保存.2、SSR具有豐富的多態(tài)性,SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于SSR產(chǎn)物進(jìn)行測序膠電泳別離具有單堿基的高分辨率,遺傳信息量大,一個SSR座位最多可以檢測到26個等位基因,能夠更好的分析硬葉兜蘭的遺傳多樣性.它在牡丹親緣關(guān)系中的應(yīng)用很廣泛.在基于SSR特點(diǎn)之上,利用葉綠體DNA(chlo

45、roplastDNA)的遺傳特點(diǎn),使cp-SSR在支取群體遺傳分析和系統(tǒng)發(fā)育研究中優(yōu)勢更大.3、psbA-trnH序列中的psbA-trnH片段是一段位于psbA和trnH基因之間的非編碼序列,進(jìn)初速率較快.trnH-psbA序列具有引物通用性較好、 擴(kuò)增成功率較高等特點(diǎn),并且平均長度較短,有利于對降解材料的擴(kuò)增；而硬葉兜蘭居群的psbA-trnH體系已經(jīng)得到初步建立.4、學(xué)院實(shí)驗(yàn)室相關(guān)儀器(如PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳儀)齊備.133、本研究的特色與創(chuàng)新之處(1) SSR標(biāo)記的種群研究優(yōu)勢；數(shù)量豐富,覆蓋整個基因組,揭示的多態(tài)性高；具有多等位基因的特性,提供的信息量高；以孟德爾方式遺傳,呈共顯性

46、；每個位點(diǎn)由設(shè)計的引物順序決定,便于不同的實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開發(fā)引物.(2)葉綠體基因組(chloroplastDNA,cpDNA)呈單親遺傳,由于葉綠體為母系遺傳(Maternalinheritance)是指兩個具有相對性狀的親本雜交,不管正交或反交,子一代總是表現(xiàn)為母本性狀的遺傳現(xiàn)象,可以用于檢測蘭科植物種子擴(kuò)散格局.在硬葉兜蘭上的研究報告較少.(3)種群遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行人干擾影響的分析,定量評價各個參數(shù)的變化,為種的保育提供理論依據(jù).4、研究方案及預(yù)期研究結(jié)果2022年3月一2022年7月：收集整理與論文相關(guān)的文獻(xiàn)資料,確定論文的題目,初步擬定本論文的研究方案,形成研究思路.2022年

47、8月2022年1月：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究以及數(shù)據(jù)收集,完成開題報告和中期考核.2022年2月2022年8月： 進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究工作,撰寫并發(fā)表一篇研究性論文,通過論文開題報告,完成論文初稿.2022年9月2022年1月：繼續(xù)研究分析,根據(jù)情況調(diào)整進(jìn)度,完成論文的撰寫.2022年3月一2022年6月：完成論文的最后修改,做好辯論前的工作.預(yù)期研究結(jié)果篩選出適合于硬葉兜蘭居群鑒定的cp-SSR,引物,并得到清楚、重復(fù)性好的條帶,用于多態(tài)性分析,揭示出各種及品種在遺傳上的差異性.測出葉綠體轉(zhuǎn)錄間隔基因(psbA-trnH)進(jìn)行psbA-trnH序列分析.根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)得出各遺傳多樣性指數(shù)結(jié)果；基于Neis遺傳距離構(gòu)建出聚類分析樹狀圖,分析得出各個硬葉兜蘭居群間分子遺傳變異的方差.三、研究根底141、已參加過的相關(guān)研究,作和已取得的研究,作進(jìn)展到目前為止,本人對滇東南6個野生居群展開研究,用改進(jìn)的CTAB方法成功的提取植物葉片DNA,并用此DNA篩選出葉綠體間隔基因(psbA-trnH)條帶明亮較好的條帶,對引物進(jìn)行確定最正確退火溫度,進(jìn)而對PCR體系進(jìn)行優(yōu)化,確定最正確反響體系.在課余時間查閱大量的國內(nèi)外文獻(xiàn),查閱此研究領(lǐng)域的概況和缺乏之處,同時在圖書館找出相關(guān)的書籍進(jìn)行仔細(xì)研究,為分子研究打下 f 的根底.在網(wǎng)上學(xué)習(xí)相關(guān)儀器的使用方法,并做筆記記錄.對植物分子標(biāo)記進(jìn)行了系統(tǒng)的學(xué)習(xí),保證能