核因子-κB反義RNA對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖的作用

1、    核因子-B反義RNA對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖的作用作者：洪華山，胡榕，洪華山，許昌聲，吳可貴    作者單位：1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，福建 福州 350001；2.福建省高血壓研究所     【摘要】  目的：探討核因子（NF）-B反義RNA重組腺病毒預(yù)處理對凝血酶誘導(dǎo)培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖的影響。方法：分別用表達NF-B反義RNA的50多重感染（MOI）重組腺病毒和100mol/L吡咯烷二硫代氨基甲酸

2、（PDTC，NF-B特異性阻斷劑)預(yù)處理VSMCs 48h和1h，采用WST-1試劑和氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入率測定0.5U/ml凝血酶誘導(dǎo)的VSMCs細胞增殖率。 結(jié)果：與PDTC一樣，表達NF-B反義RNA的重組腺病毒預(yù)處理明顯抑制凝血酶誘導(dǎo)VSMCs的增殖（P<0.01），抑制率30。結(jié)論：NF-B反義RNA與NF-B特異性阻斷劑對VSMC的增殖具有相同的抑制作用，其抑制率超過30。    【關(guān)鍵詞】  NF-B；核糖核酸類，反義；肌細胞，平滑肌    Effect of antisense RNA o

3、f NF-B on proliferation of vascular smooth muscle cells  in spontaneously hypertensive rats/HU Rong，HONG Huashan，XU Changsheng，WU Kegui/Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009,18(2):116    Abstract：Objective:To investigate the effect of antisense RNA of NF-

4、B on proliferation of vascular smooth muscle cells（VSMCs） in spontaneously hypertensive rats（SHR） promoted by thrombin.Methods:After pretreated with the 50MOI recombinant adenovirus expressing antisense RNA of NF-B for 48h and 100mol/L PDTC （NF-B special inhibitor）for 1h， VSMCs proliferation induced

5、 by 0.5U/ml thrombin was investigated.The proliferation rate of VSMCs was determined with both WST-1 metabolic activity and 3H-TdR incorporation efficiency.Results:The pretreatment of recombinant adenovirus expressing NF- B antisense RNA  obviously inhibit VSMCs proliferation induced by thrombi

6、n (P<0.01) at the rate of >30%, which was similar to the inhibition of VSMCs proliferation by NF- B special inhibitor PDTC with no statistical difference  between two group(P>0.05).Conclusion:The recombinant adenovirus expressing NF- B antisense RNA may effectively inhibit VSMCs prolif

7、eration induced by thrombin,is similar to the  NF- B special inhibitor,may be applied to successive basic research and clinical interference treatment.    Authorsaddress：Department of Cardiology，Union Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，350001,China   

8、 Key words：NF-kappa B;Ribonueleases,antisense; Myocytes,smooth muscle    血管平滑肌細胞（VSMCs）的增殖、向內(nèi)膜下遷移、分泌細胞外基質(zhì)等在血管增殖性疾病的發(fā)病中起重要作用。體內(nèi)可以引起細胞增殖的因素很多，各種有絲分裂原可通過不同的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生細胞增殖反應(yīng)，單純抑制某種特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻斷調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移等最終共同通路的關(guān)鍵基因成為有效防止血管增殖性疾病的研究方向。核因子-B（NF-B）是調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，調(diào)控幾十種生長因子、細胞因子、粘附因

9、子、趨化因子等靶基因的表達1。因此，許多學(xué)者認為調(diào)控NF-B的活性是一個理想的治療靶點?；蛑委熓菑幕蛩礁淖兗毎牟±頎顟B(tài)而達到治愈疾病的目的，具有一次治療長期有效的優(yōu)點，克服現(xiàn)有藥物療法的缺點，實現(xiàn)“生理性治療”2。反義RNA是一類能與特異性mRNA互補的小分子質(zhì)量的、可擴散的DNA轉(zhuǎn)錄物，它能夠從翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平和核酸復(fù)制水平上高度特異性地抑制靶基因表達。反義核酸技術(shù)的意義在于僅干擾靶基因功能，對基因組其它基因的結(jié)構(gòu)無影響，而且方法簡便。本研究試圖在細胞水平探討以腺病毒為載體，NF-B反義核酸治療對VSMC增殖的影響，為其在整體動物的水平治療經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄和

10、動脈粥樣硬化（AS）奠定基礎(chǔ)。    1  資料與方法    1.1  一般資料    實驗所用的自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）購自北京維通利華有限公司二級動物合格證號：SCXK(京)2003-0003。表達NF-B反義RNA重組腺病毒載體pAd/CMV/269和空載體pAd/CMV系本實驗室構(gòu)建保存3；凝血酶、吡咯烷二硫氨基甲酸鹽（PDTC）（Sigma公司）1；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，中國原子能科學(xué)研究院）；測定細胞活性的WST-1試劑盒（德國Boehringer Mannhe

11、im公司）；陽離子脂質(zhì)體（Lipofectamine）TM 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）。    1.2  實驗方法    1.2.1  VSMCs的培養(yǎng)與鑒定4:以組織貼塊法培養(yǎng)VSMCs。取清潔級三月齡雄性SHR大鼠，無菌操作分離其胸主動脈，剪碎后加入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液（含100 kU/L青霉素，100mg/L鏈霉素），5%CO2、37二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。實驗選用35代細胞。用光鏡和免疫細胞化學(xué)法鑒定。    1.2.2  重組

12、腺病毒的制備、滴度測定及鑒定3:PacI酶切使重組腺病毒質(zhì)粒pAd/CMV/269線性化，紫外分光光度計測定質(zhì)粒的純度及濃度。按LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，用脂質(zhì)法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的293單層細胞，進行細胞內(nèi)包裝，形成并釋放完整的腺病毒顆粒。包裝后的腺病毒用空斑法測定滴度，操作按ViraPowerTM Adenoviral Expression System 試劑盒說明書。重組腺病毒用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法進行驗證，按DNA提取試劑盒操作說明。    1.2.3  實驗分組:實驗選用3-5代的培養(yǎng)VSMCs，用0.125胰

13、酶消化后，以2×104個/孔或5×103個/孔，均勻接種于24孔或96孔培養(yǎng)板上，待細胞貼壁生長至70%80匯合時，吸棄原培養(yǎng)液，換用無血清或0.2血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使VSMCs處于G0/G1期，再進行后續(xù)干預(yù)實驗。將培養(yǎng)細胞分為5組：空白對照組：加入無血清DMEM液；空載體組：加入50多重感染（MOI） Ad/CMV感染VSMCs；凝血酶組：加入終濃度為0.5U/ml凝血酶；PDTC組：先加入終濃度為100mol/L的PDTC預(yù)處理1h，再加入終濃度為0.5U/ml凝血酶；反義RNA預(yù)處理組：先加入50MOI 重組Ad/CMV/269感染VSMCs后4

14、8h，再加入終濃度為0.5U/ml凝血酶。按實驗要求細胞繼續(xù)培養(yǎng)至加刺激因素凝血酶后24h，測定細胞增殖率。每組復(fù)3孔取均值。重復(fù)4次。    1.2.4  VSMCs增殖的測定方法:WST-1代謝活性測定4：取35代VSMCs以5×103個/孔均勻接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至70%80匯合時，換用0.2血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使VSMCs處于G0/G1期。在上述各干預(yù)因素刺激至規(guī)定時間后加入即用型WST-1溶液，10l/孔，繼續(xù)置37 5CO2培養(yǎng)箱孵育90 min。取出培養(yǎng)板，置振蕩器上充分振蕩（300 r/min）1min，

15、在酶標(biāo)儀450/630nm雙波長處檢測光密度（OD）值，即WST-1檢測值。每次實驗均設(shè)一個（復(fù)3孔）空白對照孔（以DMEM培養(yǎng)液代替細胞），對照孔吸光值應(yīng)<0.01。DNA合成率測定：35代VSMCs以2×104個/孔，均勻接種于24孔培養(yǎng)板上，在上述干預(yù)因素加入時，同時加入1微居里/ml的3H-TdR，共育至相應(yīng)時間后，吸棄培養(yǎng)液，0.125胰酶消化細胞，收集細胞于0.45m的微孔濾膜（預(yù)先用10三氯醋酸濕潤）上，負壓抽濾，用生理鹽水和10三氯醋酸沖洗濾膜，室溫涼干后置入液體閃爍杯中，加入3ml閃爍液二甲苯+0.5%二苯基噁唑（ppo）+0.04%對苯撐苯唑基（popop）

16、，靜置過夜后，在液體閃爍計數(shù)器上進行放射性強度的測定。    1.3  統(tǒng)計學(xué)處理    實驗結(jié)果用數(shù)據(jù)和圖表表示，測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包分析。組間比較采用多樣本均數(shù)的單因素方差分析檢驗。P<0.05為差異有顯著性。    2  結(jié)  果    2.1  NF-B反義RNA重組腺病毒感染VSMCs對VSMC WST-1代謝活性的影響    凝

17、血酶反義RNA組和凝血酶PDTC組的WST-1的OD值均比凝血酶組明顯減少（P<0.01），反義RNA組與PDTC組之間不存在顯著差異（P>0.05）。50MOI NF-B反義RNA和100mol/L PDTC對0.5U/ml凝血酶誘導(dǎo)的VSMC WST-1代謝活性增加的抑制率分別為35.64和36.32，較之凝血酶組顯著減少（P<0.01），見表1，圖1。    2.2  NF-B反義RNA重組腺病毒感染VSMCs對VSMC 3H-TdR摻入率的影響    凝血酶反義RNA組和凝血酶PDTC組的3H-Td

18、R摻入率均比凝血酶組明顯減少（P<0.01），反義RNA組與DPTC組之間不存在顯著差異（P>0.05）。50MOI NF-B反義RNA和100mol/L PDTC對0.5U/ml凝血酶誘導(dǎo)VSMC 3H-TdR摻入率增加的抑制率分別為45.22和49.62，較之凝血酶組顯著減少（P<0.01），見表1，圖2。表1  不同組WST-1測定的代謝活性和氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入率(n=4)    3  討  論    許多能夠抑制VSMC增殖的藥物，無論是在基礎(chǔ)研究還是臨床實驗中，

19、均已被證明具有防治動脈硬化及PCI術(shù)后再狹窄的作用。但由于藥物治療的效果尚不十分理想，以及必須堅持長期用藥給病人心理上造成了巨大的困擾，尋找更加有效和方便可靠的治療方法便成為心血管病研究的熱點。盡管基因治療目前尚不十分成熟，但在這一領(lǐng)域中所取得的成就已引起眾多學(xué)者的關(guān)注。    凝血酶是一種重要的血管活性物質(zhì)，除凝血作用外，晚近也證明它還能促進VSMC的增殖和遷移；促進血管壁非細胞成分的累積和新生內(nèi)膜形成和釋放炎癥反應(yīng)因子等作用，其功能多由細胞表面的凝血酶受體基因介導(dǎo)5。NF-B是調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，新近研究發(fā)現(xiàn)VSMC中存在著NF-B通路，且是VSM

20、C增殖必經(jīng)的激活通路。本系列實驗的先前研究結(jié)果顯示凝血酶能夠激活VSMC的NF-B，使其從細胞漿轉(zhuǎn)位至細胞核，而且凝血酶引起的VSMC增殖與NF-B途徑相關(guān)聯(lián)6。NF-B可能是VSMC增殖的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路。國內(nèi)、外已有利用反義核酸技術(shù)抑制凝血酶受體表達來阻斷凝血酶作用，從而抑制VSMC增殖的報道79，但利用反義表達載體、反義核酸技術(shù)抑制NF-B的生成，從而達到抑制凝血酶誘導(dǎo)VSMC增殖的目的至今尚未見相關(guān)報道。    本研究利用前文3構(gòu)建的NF-B反義RNA腺病毒表達載體，轉(zhuǎn)染293細胞，獲得高滴度腺病毒上清，再感染VSMC，觀察NF-B反義RNA對凝血

21、酶引起的細胞增殖的作用。結(jié)果顯示，該載體能在VSMC內(nèi)表達出NF-B反義RNA，顯著抑制了凝血酶誘導(dǎo)的VSMC增殖，顯示出該反義表達載體在心血管細胞增殖性疾病的基因治療的研究中具有良好的適用性。    基因治療是從根本上針對發(fā)病環(huán)節(jié)的一種治療手段，靶向性更明顯，具有一次治療長期有效的優(yōu)點。本實驗結(jié)果證實，在同等條件下，NF-B反義RNA對VSMC增殖的抑制率30，即具有生物學(xué)效應(yīng)，且與NF-B特異性阻斷劑PDTC的抑制作用相仿，為今后進一步的基礎(chǔ)研究和臨床干預(yù)治療奠定了基礎(chǔ)。值得注意的是，NF-B在維持機體的防御功能和細胞生死平衡方面，起著極其重要的作用，完全地、

22、持續(xù)地阻斷NF-B激活有可能導(dǎo)致免疫缺陷和正常細胞的凋亡10,11。因此，如何進一步提高反義核酸技術(shù)的穩(wěn)定性、有效性、安全性，尚待進一步的研究。【參考文獻】1Collins T, Cybulsky MI.NF-kappaB：pivotal mediator or innocent bystander in atherogenesis? J. J Clin Invest, 2001,107(3)：255-264.2Mountain A. Gene therapy：the first decadeJ. Trends Biotechnol, 2000,18(3)：119-128.3胡 榕，吳可貴，許昌聲.大鼠核因子-B反義RNA腺病毒載體的構(gòu)建及其在血管平滑肌細胞中的表達J. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2005,10(4)：391-396.4洪華山，林