普伐他汀對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷后神經(jīng)發(fā)生的影響

1、普伐他汀對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷后神經(jīng)發(fā)生的影響    【摘要】 目的： 研究普伐他汀對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷后神經(jīng)發(fā)生的作用. 方法： 采用線栓法造成大鼠大腦中動(dòng)脈的暫時(shí)性缺血，并在傷后以下時(shí)間點(diǎn)給予普伐他?。簜? h，以及傷后每天至傷后14 d. 并通過(guò)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)傷后神經(jīng)學(xué)恢復(fù)情況. 此外還通過(guò)三染色法(BrdU, DCX, NeuN)研究了他汀類(lèi)藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)發(fā)生的作用. 結(jié)果： 相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物術(shù)后旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)評(píng)分顯著性增加；普伐他汀顯著增加了齒狀回和腦室下區(qū)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并增加了齒狀回、腦室下區(qū)和紋狀體中的BrdU/D

2、CX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù). 結(jié)論： 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期重復(fù)使用低劑量的普伐他汀是相對(duì)安全的，并能夠顯著改善傷后的神經(jīng)功能恢復(fù). 普伐他汀能夠誘導(dǎo)大鼠齒狀回及腦室下區(qū)的神經(jīng)發(fā)生并增加紋狀體中遷移神經(jīng)元的數(shù)量.    【關(guān)鍵詞】 缺血 普伐他丁 神經(jīng)發(fā)生    0引言    普伐他汀具有一定的神經(jīng)保護(hù)功能，并可促進(jìn)新生血管的生成. 但其對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞的再生和遷移作用鮮有報(bào)道. 本試驗(yàn)我們主要觀察了普伐他汀在大鼠中樞神經(jīng)缺血損傷后的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)發(fā)生作用.   

3、; 1材料和方法    1.1材料成年Wister大鼠45只，體質(zhì)量270330 g，飼養(yǎng)于晝夜時(shí)間為12： 12 h的恒溫飼養(yǎng)室內(nèi)，水和食物自由攝取. 應(yīng)用由10 mL/L的氟烷、700 mL/L的二氧化氮和300 mL/L的氧氣組成的混合氣體麻醉試驗(yàn)動(dòng)物，采用線拴方法誘導(dǎo)60 min大鼠的大腦中動(dòng)脈栓塞1，隨后進(jìn)行再灌注. 整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的體溫被控制在(37±0.5)，并監(jiān)測(cè) 血壓、心率、血?dú)夥治龅?    1.2方法    1.2.1試驗(yàn)分組除試

4、驗(yàn)過(guò)程中死亡5只外，剩余40只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分成4組，每組10只：大鼠接受大腦中動(dòng)脈栓塞或者假手術(shù)，每組動(dòng)物接受1 mg/kg的普伐他汀或者等量的生理鹽水腹腔注射. 藥物注射時(shí)間點(diǎn)為： 術(shù)后6 h、以及隨后14 d的每一天. 此外，每只大鼠術(shù)后每天腹腔注射100 mg/kg的溴脫氧尿核苷（BrdU）.    1.2.2行為學(xué)測(cè)試旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)被用來(lái)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試. 大鼠被置于一個(gè)加速的旋轉(zhuǎn)軸裝置上，旋轉(zhuǎn)速度在5 min內(nèi)從4 r/min加速到40 r/min. 當(dāng)大鼠從裝置上墜落或者僅抓附于旋轉(zhuǎn)軸2轉(zhuǎn)以上并且未嘗試行走則被判斷為試驗(yàn)結(jié)束. 最長(zhǎng)行走時(shí)間限定于5

5、00 s. 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次測(cè)試并取其平均值作為該時(shí)間點(diǎn)的持續(xù)時(shí)間2.    1.2.3免疫熒光組織化學(xué)于術(shù)后14 d，取大鼠腦組織進(jìn)行普通石蠟包埋并切片，厚度為1 m. 經(jīng)二甲苯進(jìn)行脫蠟，乙醇脫水后，用3 mL/L過(guò)氧化氫?甲醇溶液消除內(nèi)生過(guò)氧化物酶活性. 加入第一抗體：大鼠抗?BrdU (1100,Oxford Biotechnology Ltd, UK), 小鼠抗?NeuN (1200, Chemicon, Temecula, CA), 羊抗?Doublecortin(DCX) (150, Santa Cruz, USA)，4反應(yīng)48 h，TBS

6、沖洗3次；加入第二抗體：交聯(lián)Cy2的抗大鼠抗體 (1200, Jackson Immunoresearch Laboratories, USA), 交聯(lián)ROX的抗小鼠抗體 (1200, Jackson), 交聯(lián)Cy5的抗羊抗體 (1200, Jackson)，37反應(yīng)2 h, TBS沖洗3次后蓋玻片封片.    1.2.4細(xì)胞計(jì)數(shù)組織切片采用配有Dage MTI數(shù)碼相機(jī)的熒光顯微鏡(×40物鏡，Leica, DMR, Germany)進(jìn)行掃描. 全部圖像采用MCID計(jì)算機(jī)成像分析系統(tǒng)(MCID ELITE 7.0, Imaging Resear

7、ch, St. Catharines, Ontario, Canada)收集. 分別對(duì)大腦患側(cè)齒狀回（DG）、室下區(qū)（SVZ）和紋狀體進(jìn)行BrdU陽(yáng)性細(xì)胞和DCX陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù). 每個(gè)大腦共計(jì)兩個(gè)層面，每個(gè)層面計(jì)4個(gè)視野. 分別獲取每個(gè)層面的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù).    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)分析采用StatView(SAS Institute Inc., USA, 1998)統(tǒng)計(jì)軟件，行方差分析和獨(dú)立t檢驗(yàn)，并應(yīng)用F檢驗(yàn)進(jìn)一步確定組間的顯著性差異. 顯著性水平為0.05，所有數(shù)據(jù)表示為x±s.  

8、60; 2結(jié)果    共使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45只，5只在14 d內(nèi)死亡，40只動(dòng)物存活至實(shí)驗(yàn)完成，每組10只. 1只大鼠在24 h內(nèi)死亡，4只大鼠在14 d內(nèi)死亡，死亡原因?yàn)槟X出血. 死亡率分布如下：普伐他汀手術(shù)組3只，對(duì)照手術(shù)組2只. 組間死亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 亦未發(fā)現(xiàn)組間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理指標(biāo)pH, PaCO2, PaO2, BP等的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.    行為學(xué)測(cè)試顯示，術(shù)后第5日和第7日普伐他汀手術(shù)組和對(duì)照手術(shù)組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；至術(shù)后第14日，普伐他汀手術(shù)組動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)得分則高于對(duì)照手術(shù)組(422±

9、21) s vs (336±17) s, P=0.0216.    相對(duì)于對(duì)照組，普伐他汀手術(shù)組腦組織中的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞在患側(cè)的齒狀回(圖1，表1，P=0.0029)和室下區(qū)(圖2， 表1，P=0.0280)中都有顯著性增加，但在紋狀體中(圖3，表1， P=0.3929)未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（表1）. 通過(guò)三重染色，我們發(fā)現(xiàn)普伐他汀手術(shù)組動(dòng)物的BrdU標(biāo)記的DCX陽(yáng)性細(xì)胞(BrdU /DCX )在患側(cè)的齒狀回(圖1，表1，P=0.0031)、室下區(qū)(圖2，表1，P=0.0316)和紋狀體(圖3，表1，P=0.0073)中有顯著性增加. 所有切片中

10、未發(fā)現(xiàn)BrdU /NeuN 細(xì)胞，只在普伐他汀手術(shù)組動(dòng)物大腦齒狀回中發(fā)現(xiàn)非常少量的BrdU /NeuN /DCX 細(xì)胞(圖1箭頭所示). 值得注意的是，在1只普伐他汀手術(shù)組大鼠的腦組織切片中發(fā)現(xiàn)了一條從室下區(qū)到紋狀體的DCX陽(yáng)性細(xì)胞帶. 這一發(fā)現(xiàn)提示了一條可能的未成熟神經(jīng)元的遷移路徑. 表1齒狀回、室下區(qū)、紋狀體細(xì)胞計(jì)數(shù)    3討論 在本研究中，我們證明了在大腦缺血性損傷后急性期內(nèi)重復(fù)使用普伐他汀可以誘導(dǎo)大腦患側(cè)齒狀回和室下區(qū)的細(xì)胞增殖，并顯著性的增加紋狀體內(nèi)遷移細(xì)胞數(shù)量. 同時(shí)普伐他汀可以改善大腦缺血性損傷后的功能恢復(fù).  

11、60; 齒狀回和室下區(qū)作為神經(jīng)發(fā)生區(qū)域已經(jīng)被廣泛接受. 我們使用了一種雞尾酒三染色方法研究大鼠大腦缺血損傷后的細(xì)胞增殖情況. BrdU為細(xì)胞分裂S期的標(biāo)記物，它被用于評(píng)估大腦缺血損傷后的新生細(xì)胞數(shù)； DCX被用于分析未成熟細(xì)胞和遷移細(xì)胞； NeuN被用于評(píng)估神經(jīng)元的成熟和分化. 本研究中，普伐他汀可以顯著增加腦損傷側(cè)齒狀回和室下區(qū)的BrdU 和BrdU /DCX 細(xì)胞數(shù). 而在假手術(shù)組中未觀察到類(lèi)似現(xiàn)象. 因此普伐他汀可以促進(jìn)大鼠中樞神經(jīng)缺血性損傷后的神經(jīng)發(fā)生. 我們同樣觀察到普伐他汀可以顯著增加紋狀體內(nèi)BrdU /DCX 細(xì)胞數(shù)而非BrdU 細(xì)胞數(shù). 這意味著普伐他汀可圖1齒狀回中

12、的細(xì)胞增殖. 圖A到D顯示了實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腦損傷半球的細(xì)胞增殖，箭頭所指為一個(gè)BrdU /DCX /NeuN 細(xì)胞. 圖E到H顯示了對(duì)照組的細(xì)胞增殖.    圖2室下區(qū)的新生神經(jīng)細(xì)胞. 普伐他汀組（A到D箭頭所示）的BrdU和DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（E到H箭頭所示）. 圖I中可見(jiàn)從室下區(qū)到紋狀體的DCX陽(yáng)性細(xì)胞帶.    圖3紋狀體中的新生神經(jīng)細(xì)胞. 實(shí)驗(yàn)組（A到D箭頭所示）腦損傷側(cè)的BrdU /DCX 細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（E到H箭頭所示）. 能促進(jìn)了非成熟神經(jīng)元的前體細(xì)胞從室下區(qū)到紋狀體的遷移，但沒(méi)有觀察到

13、促進(jìn)紋狀體內(nèi)細(xì)胞增殖的功能. 另外有少量的BrdU /NeuN /DCX 細(xì)胞可見(jiàn)于普伐他汀手術(shù)組的齒狀回中，意味著普伐他汀可能具有促進(jìn)新生神經(jīng)元的成熟和分化的作用. 從細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果中還可以看出作為細(xì)胞增殖區(qū)，腦損傷后室下區(qū)比齒狀回增殖更加活躍. 這種他汀類(lèi)藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生可能是因?yàn)樯窠?jīng)元前體細(xì)胞的增殖3. 部分實(shí)驗(yàn)顯示他汀類(lèi)藥物可以通過(guò)磷酸激酶途徑調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化并增加前體細(xì)胞的數(shù)量4. 研究表明長(zhǎng)期的他汀類(lèi)藥物預(yù)防性使用可以增加內(nèi)皮二氧化氮合酶（eNOS）在脈管系統(tǒng)和血小板中的表達(dá)，增加大腦血流量，減少腦損傷面積并改善傷后的功能恢復(fù)5. 除此之外，他汀類(lèi)藥物在腦損傷之后應(yīng)用的效果也相繼被

14、報(bào)道6：低濃度的普伐他汀可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化；低濃度的阿伐他?。? mg/kg）可以改善大鼠腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù). 我們的研究表明低濃度的普伐他?。? mg/kg）可以促進(jìn)成年大鼠大腦缺血性損傷后的神經(jīng)發(fā)生，這種神經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)大于自然條件下由腦缺血所誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生. 他汀類(lèi)藥物有一些非常嚴(yán)重的副作用. 本實(shí)驗(yàn)中，組間并未發(fā)現(xiàn)死亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)中，也未發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組中普伐他汀組和生理鹽水對(duì)照組之間有運(yùn)動(dòng)功能的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 這表明短期內(nèi)低劑量普伐他汀的重復(fù)使用是相對(duì)安全的，并未造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的損害. 【參考文獻(xiàn)】 1 Longa EZ, Weinstein PR, Ca

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