免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)：免疫原和抗血清的制備

1、免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)：免疫原和抗血清的制備    抗原和抗體是免疫學(xué)檢驗(yàn)的兩大重要因素，也是整個(gè)免疫反應(yīng)的基本條件。抗原的純化是制備特異性抗的先決條件，制得的抗體可用于純化抗原和檢測(cè)抗原?？贵w有單克隆和多克隆兩類。     抗原和抗體是免疫學(xué)檢驗(yàn)的兩大重要因素，也是整個(gè)免疫反應(yīng)的基本條件?？乖募兓侵苽涮禺愋钥沟南葲Q條件，制得的抗體可用于純化抗原和檢測(cè)抗原?？贵w有單克隆和多克隆兩類。 單克隆抗體用雜交瘤技術(shù)制備（詳見第十一章），多克隆抗體存在于免疫動(dòng)物抗血清中。近年來又出現(xiàn)了基因工程抗體（單鏈抗體）。本章僅敘述抗原

2、純化和多克隆抗血清制備技術(shù)。 第一節(jié)免疫原的制備 免疫原是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體、并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。能否制得合格的抗體由許多因素決定，而能否制備合格的免疫原則是其前提條件。而且作為診斷試劑的抗原也必須是單一特異性的，即純化的抗原。自然眾多的物質(zhì)皆可成為免疫原，但絕少是單一成分（除非是合成的基因工程制備的），所以必須將某個(gè)抗原從復(fù)雜的組分中提取出單一的成分。下面介紹有代表性的免疫原制備方法。 一、顆粒性抗原的制備 顆粒性抗原主要是指細(xì)胞抗原或細(xì)菌抗原。最常用的細(xì)胞抗原為制備溶血素用的綿羊紅細(xì)胞。這種抗原制備比較簡(jiǎn)單，采集新鮮綿羊紅細(xì)胞，以無(wú)菌鹽水洗滌3次（每次離心2000r/min10min）

3、，最后配成106/ml濃度的細(xì)胞懸液，即可應(yīng)用。細(xì)菌抗原多用液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。H抗原用有動(dòng)力的菌株，菌液用0.30.5甲醛處理，而O抗原則需要100加溫22.5h后應(yīng)用。Vi抗原則應(yīng)在殺菌后再加0.51氯化鈣溶液。有時(shí)蟲卵也可做成抗原，如日本血吸蟲卵抗原可制成懸液供免疫用。有些細(xì)胞膜成分，如組織細(xì)胞膜、血細(xì)胞膜經(jīng)打碎后亦可制成顆?？乖?。顆粒抗原懸液呈乳濁狀，多采用靜脈內(nèi)免疫法，較少使用佐劑作皮內(nèi)注射。 二、可溶性抗原的制備和純化 蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、細(xì)菌毒素、酶、補(bǔ)體等皆為良好的可溶抗原。但因這些蛋白質(zhì)多為復(fù)雜的蛋白組分，免疫前需進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)純化方法在生物化學(xué)技術(shù)中已有詳述

4、，本章主要介紹免疫化學(xué)純化方法。 （一）組織和細(xì)胞粗抗原的制備 免疫原多來源于只類及動(dòng)物的組織或細(xì)胞，這些材料在取得可溶性蛋白質(zhì)之前，必須先進(jìn)行處理，以適合于進(jìn)一步純化。 1組織細(xì)胞抗原的制備所用組織必須是新鮮的或低溫(40）保存的。器官或組織得到后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及一些大血管。如有條件，臟器應(yīng)進(jìn)行灌注，除去血管內(nèi)殘留的血液。處理好的組織用0.05/NaN3生理鹽水洗去血跡及污染物。將洗凈的組織剪成小塊，進(jìn)行粉碎。粉碎的方法有兩類：高速組搗碎機(jī)法。操作時(shí)，將組織加鹽水（約1/2）裝入搗碎機(jī)筒內(nèi)，用高速（約1000r/min）間斷進(jìn)行，每次3060s，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)熱。研磨法?？捎貌?/p>

5、璃勻漿器或乳缽研磨。玻璃勻漿器是由一內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為圓柱狀（表面亦經(jīng)磨砂）的磨桿組成，主要經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、壓擠將組織粉粹。研磨法可用于韌性較大聽組織，如皮膚、空腔器官等。為了更有效地磨碎組織，有時(shí)在研磨時(shí)加入淘洗過的海砂。組織勻漿通過20003000r/min離心10min后分成兩個(gè)部分：沉淀物含有大量的組織細(xì)胞和碎片；上清液作為提取可溶性抗原的材料，提取前還要通過10002000r/min2030min的高速離心，以除去微小的細(xì)胞碎片，此時(shí)上清液應(yīng)澄清。 2組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原的制備制備抗原用的細(xì)胞包括正常細(xì)胞、病理細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）或傳代細(xì)胞。組織細(xì)胞的制備一般通過上述機(jī)

6、械破碎后取得。或通過酶消化，所用的酶大多為胃蛋白酶或胰酶。通過酶解將細(xì)胞間質(zhì)蛋白消化，獲得游離的單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞抗原一般分為三個(gè)組分：膜蛋白抗原、細(xì)胞漿抗原（主要為細(xì)胞器）和細(xì)胞核及核膜抗原。三種抗原的制備皆需將細(xì)胞破碎，方法有如下幾種。 （1）反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞（有時(shí)為整塊組織）置20冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后緩慢地融化。如此反復(fù)2次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可被融破。 （2）冷熱交替法：在細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)及核酸時(shí)可用此法。操作時(shí)，將材料投入沸水浴中，90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。 （3）超聲破碎法：對(duì)微生物和組織細(xì)胞多用此法。處理效果與樣品濃度和

7、使用頻率有關(guān)。一般組織細(xì)胞皆易破碎，而細(xì)菌，尤其是真菌的厚膜孢子則較難打破。超聲波所使用的頻率從120kHz不等。同樣要間歇進(jìn)行，因長(zhǎng)時(shí)間超聲也會(huì)產(chǎn)熱，易導(dǎo)致抗原破壞。一次超聲12min，總時(shí)間為1015min。 （4）自溶法：利用組織和微生物的自身酶系，在一定的pH和溫度下，使其細(xì)胞裂解。自溶的溫度，對(duì)動(dòng)物組織細(xì)胞常選04，而對(duì)微生物常選室溫。自溶時(shí)常需加入少量防腐劑，如甲苯或氯仿等，NaN3不宜使用，因其能抑制酶的活力。 （5）溶菌酶處理法：在堿性條件下（pH8.0），溶菌酶可專一破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，適用于多種微生物。除溶菌酶外，蝸牛酶、纖維素酶等也可用于消化細(xì)菌和組織細(xì)胞。 （6）表面活性劑

8、處理法：常用的有十二烷基吡啶、支氧膽酸鈉等。因效果較差，已少應(yīng)用。 （二）超速離心和梯度密度離心法 超速離心是分離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進(jìn)一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。差速離心系指低速與高速離心交替進(jìn)行，用于分離大小差別較大的顆粒。梯度密度離心是一種區(qū)帶分離法，通過梯度密度來維持重力的穩(wěn)定性。通過離心，沉淀的顆粒比液體的比重大，漂浮的顆粒比液體的比重小。通常待分離的懸液中的顆粒比液體重，假如要使之上浮，必須加入第三種成分，使其密度連續(xù)或不連續(xù)地升高，形成所謂梯度。第三種成分多用甘油、蔗糖、氯化銫或氯化銣等。假如梯度柱的范圍所表現(xiàn)的密度同待分離顆粒的密度大

9、致相等時(shí)，則經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間離心可得到分離。這種方法稱為密度離心或梯度離心。 用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)抗原的比重特點(diǎn)分離的方法，除個(gè)別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質(zhì)如載脂蛋白A、B等。對(duì)于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。 （三）選擇性沉淀法 選擇性沉淀是采用各種沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。 1核酸去除法從微生物或細(xì)胞提取蛋白質(zhì)抗原時(shí)，其中常含有大量核酸成分。除去核酸可用提取沉淀劑，如氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。核糖

10、核酸降解法較為簡(jiǎn)便，用DNA或RNA酶與提取液共同作用3060min（4），即可有效地除去核酸成分。 2鹽析沉淀法這是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離動(dòng)技術(shù)。由于方法簡(jiǎn)便、有效、不損害抗原活性等優(yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用。 （1）抗原的粗篩：用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉可將一個(gè)復(fù)雜的組織液吩成若干組分，也可收集某一飽和度的鹽析沉淀物作為進(jìn)一步純化的粗篩物。最常用的鹽析劑是3350飽和度的硫酸銨。 （2）提取丙種球蛋白：丙種球蛋白主要為IgG（95以上）。將3540飽和度的硫酸銨沉淀物經(jīng)去鹽后可直接用于某些試驗(yàn)作為抗體試劑。此法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、固收率高，已成為免疫化學(xué)試驗(yàn)的常規(guī)方法。 （3）抗原的濃縮：在

11、液體中含量較少的抗原，如尿中的游離輕鏈及離子交換層析洗脫液中的抗原，可通過加入硫酸銨，將其沉淀下來，以利進(jìn)一步純化。 3有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑以降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低。另外，有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中被沉淀析出。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度的有機(jī)溶劑易引起蛋白質(zhì)變性、失活、操作必須在低溫下進(jìn)行。Cohn（1942）低溫酒精沉淀法可將血漿蛋白分為5個(gè)組分，IgG屬于Cohn-3組分。 4水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物為聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)制尚不清楚，大

12、致有如下解釋：聚合物與蛋白質(zhì)形成共沉物；聚合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生水的重分配；聚合物與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。此法受許多因素影響，主要是pH、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度和PEG的分子量等。分子量為20006000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。如若使用得當(dāng)，效果甚為滿意。一般認(rèn)為，PEG濃度在34時(shí)沉淀免疫復(fù)合物，67可沉淀IgM，812可沉淀IgG，1215可沉淀其他球蛋白，25可沉淀白蛋白。最突出的應(yīng)用是用34的PEG沉淀免疫復(fù)合物，未結(jié)合的抗原和抗體留在溶液中。按此原理設(shè)計(jì)了快速測(cè)定法和循環(huán)免疫復(fù)合物測(cè)定法。 （四）凝膠過濾和離子交換層析 凝膠過濾又名分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。離子

13、交換層析是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原，將蛋白質(zhì)抗原按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆可將某一蛋白質(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來。 （五）親和層析 上面介紹的各種純方法主要是依賴抗原的物理和化學(xué)特性，如分子量、攜帶電荷等，經(jīng)過純化后只能取得相同性質(zhì)的物質(zhì)，在免疫特性上是否為同種物質(zhì)還不能肯定。親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如

14、果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的。 1親和層析支持物的選擇作為親和層析支持物須符合以下要求：非特異性吸附低；液體通過時(shí)流速要快；在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上5個(gè)條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。 2配體的選擇所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體

15、。良好的配體必須具備以下3個(gè)條件。 （1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。 （2）抗原與抗體之間必須有強(qiáng)的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對(duì)抗體來說還決定于抗體來源動(dòng)物的種類和免疫時(shí)間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時(shí)間短的親和力低。但是，親和力太強(qiáng)也不利，因?yàn)榻怆x抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強(qiáng)烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH（1.52.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。 （3）配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應(yīng)

16、當(dāng)影響配體與大分子結(jié)合的親和性。 3抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。 結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團(tuán)，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團(tuán)上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。 最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時(shí)進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時(shí)溴化氰與支持物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時(shí)首先

17、要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的2030倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)時(shí)的pH也應(yīng)注意，pH9.510時(shí)，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會(huì)減少。 親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的無(wú)效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時(shí)要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)。基于這兩個(gè)原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長(zhǎng)度的“手臂”。必要時(shí)這些“手臂

18、”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。 4親和層析條件的選擇 （1）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，為了封閉這些殘基團(tuán)，必須用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團(tuán)。 （2）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫23個(gè)柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。 （3）解脫劑有多種。常用的有0.2mol/

19、LpH2.8甘氨酸HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。 （六）免疫球蛋白片段的制備 免疫球蛋白具有抗原性，可用以免疫動(dòng)物制備相應(yīng)的抗體，而這種抗體常用于免疫球蛋白的檢測(cè)。五類免疫球蛋白皆可用前面介紹的純化方法提取出來。如將這些免疫球蛋白分解成片段，如Fc段、Fab段、輕鏈等作為免疫原制備抗血清，則可制得分辨能力更高的特異性抗體。制備方法如下： 1溫和

20、條件析離亞單位亞單位之間以非共價(jià)鍵、如氫鍵、靜電引力等連接起來，這些鍵結(jié)合力較弱，可經(jīng)2種方法將其斷開制備片段。第一種方法是改變pH，一般將pH調(diào)至34（羧基滴定范圍）和910（賴氨酸酪氨酸滴定范圍），當(dāng)?shù)陀?或高于10時(shí)，亞單位會(huì)離解。這個(gè)方法是利用強(qiáng)變性劑，如8mol/L鹽酸胍等。用此可以將亞單位分開。這個(gè)方法也用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取。 2二硫鍵的解離二硫鍵是連接Ig肽鏈的共價(jià)鍵，解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。解離的方法多采用氧化法和還原法。氧化法的優(yōu)點(diǎn)是切開后，肽鏈不能重新形成二硫鍵，便于肽鏈純化；缺點(diǎn)是甲硫氨酸被氧化成亞砜，色氨酸側(cè)鏈被破壞。還原法是將二硫鍵還原成巰基。但

21、這個(gè)疏基極不穩(wěn)定，易再重新結(jié)合成二硫鍵，必須及時(shí)用碘乙酸或碘代乙酰胺進(jìn)行羧甲基化。 3溴化氰裂解法溴化氰與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯。此產(chǎn)物與水反應(yīng)，將肽鏈斷裂。 4酶裂解法因?yàn)槊附庥袠O好的專一性，不同的片段可用不同的酶裂解。如木瓜酶可將IgG裂解成Fc和Fab（×2）3個(gè)片段，胃蛋白酶可將IgG解成F(ab)2和幾個(gè)小肽段，胰蛋白酶則將其切成不規(guī)則的肽鏈。作為抗原制備常用木瓜酶切斷，取得Fc段，以制備抗鏈血清。作為抗體試劑應(yīng)用，常用胃蛋白酶切斷取得F(ab)2。 （七）純化抗原的鑒定 純化抗原的鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、結(jié)晶法、免疫電泳

22、法、免疫雙擴(kuò)散法等。事實(shí)上，僅用一種方法還無(wú)法作純度鑒定，只有幾種方法聯(lián)合應(yīng)用才較可靠。結(jié)晶法不是純度的標(biāo)準(zhǔn)，因結(jié)晶中往往含有其它成分。電泳譜中呈現(xiàn)單一區(qū)帶也不能排除在這條帶中含有其他成分。有時(shí)雖出現(xiàn)幾條帶，也可能是同一物質(zhì)的聚合體或降解物。 蛋白抗原的定量可用生化分析中的常用方法。根據(jù)測(cè)試抗原量的多少可用雙縮脲法或酚試劑法。如果抗原極為寶貴，可用紫外光吸收法。 三、半抗原免疫原的制備 多肽、甾族激素、藥物、脂肪胺、核苷等小分子物質(zhì)僅能與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，而它們自己并不是免疫原，不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。只有將這種半抗原與蛋白質(zhì)或其他高聚物結(jié)合后才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。結(jié)合的方法有物理法和化

23、學(xué)法。物理吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纖維素等，是通過電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W(xué)法是利用功能團(tuán)把半抗原以載體上。 （一）載體選擇 1蛋白質(zhì)類蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子膠體物質(zhì)，是一種良好的載體。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍(lán)蛋白等。其中以牛血清蛋白最為常用，因其溶解度大，免疫活性強(qiáng)，又容易獲得。蛋白質(zhì)和半抗原結(jié)合是通過游離氧基、游離羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基團(tuán)的縮合。 2多肽類聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚賴氨酸（polylysine）。這種多聚合物與半抗原結(jié)合后，可誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生高滴度、高親和力的抗體。多

24、聚賴氨酸的分子量可達(dá)十幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)，是良好的載體。 3大分子聚合物和某些顆粒PVP、羧甲基纖維素和活性碳等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘發(fā)產(chǎn)生良好的抗體。 因半抗原種類、動(dòng)物類別、載體種類及結(jié)合方法的不同，制得的免疫原對(duì)動(dòng)物免疫所產(chǎn)生的效果也不同。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)多采用幾種載體或方法。 （二）連接方法 半抗原與載體連接要掌握3個(gè)基本條件：帶游離氨基或游離羧基以及二種基團(tuán)皆有的半抗原，如多肽激素類（腦啡肽、胃泌素、ACTH、前列腺素等），它們有游離的氨基或羧基。羧基可用混合酸酐法和碳化二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵。同樣，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。亦可用雙功能試劑如戊二醛、甲苯2

25、，4-二異酸鹽與載體氨基連接。脂肪胺可用碳化二亞胺縮合劑或?qū)ο趸锦Ｂ确磻?yīng)，把脂肪胺變?yōu)閷?duì)硝基苯酰胺，通過加氫還原為氨基苯酰衍生物，再用重氮化反應(yīng)。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，它們都不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法在半抗原上引起羧基后才能與載體連接。芳香族半抗原由于環(huán)上帶有羧基，它鄰位上的氫很活潑，極易取代。 半抗原和載體連接的方法在一般實(shí)驗(yàn)室皆可完成，但反應(yīng)條件應(yīng)嚴(yán)格要求，以防半抗原失活或載體嚴(yán)重變性（一般變性并不妨礙）。 1碳化二亞胺法碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷碾p功能試劑，常用的水溶性碳化二亞胺化學(xué)名為1-乙基-3-（3-二甲氨基）-碳化

26、二亞胺鹽酸鹽。它可與半抗原的羧基、也可與其氨基結(jié)合，反應(yīng)如下：+    此連接方法十分簡(jiǎn)便，只需將載體蛋白質(zhì)和抗原按一定比例混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐?，然后加入水溶性碳化二亞胺，攪?2h，置室溫24h，再經(jīng)透析即可。 2戊二醛法戊二醛也是常用的雙功能交聯(lián)劑，它借兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價(jià)鍵連接，其反應(yīng)如下： 蛋白質(zhì)-NH2+半抗原-NH2+COH-(CH2)3-COH蛋白質(zhì)-N=CH-(CH2)3-CH=N-半抗原 3氯甲酸異丁酯法該法又稱為混合酸酐法，是利用半抗原上的羧基和載體蛋白上的氨基以肽鏈相連接，方法簡(jiǎn)便，多用于類固醇抗原的制備，其反應(yīng)如下：

27、    （三）無(wú)羧基和氨基半抗原衍生物的制備 某些類固醇和藥物，需加以適當(dāng)?shù)母脑欤蛊滢D(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然虬被难苌?。依?jù)半抗原的性質(zhì)有如下4種方法。 1琥珀酸酐法琥珀酸酐是琥珀酸的脫水產(chǎn)物，遇水又可恢復(fù)。如果將帶有羥基的半抗原化合物和琥珀酸酐在無(wú)水的吡淀中反應(yīng)，就可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。再經(jīng)碳化二亞胺可氯甲酸異丁酯法，制備載體半抗原。制備衍生物的反應(yīng)如下：    2O-（羧甲基）羧胺法帶有酮基的半抗原與O-（羧甲基）羥反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌?。反?yīng)式如下： 半抗原-C=O+H2N-O-CH2

28、COOH半抗原-C=N=O=CH2-COOH 3一氯醋鈉法帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。其反應(yīng)式如下：    4重氮的對(duì)氨基苯甲酸法先將對(duì)氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生再作用于帶有酚基的半抗原，獲得帶有羧基的半抗原衍生物。反應(yīng)式如下：        四、佐劑 為了促進(jìn)抗體產(chǎn)生，可在注射抗原的同時(shí)，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為佐劑。佐劑本身可以有免疫原性，也可不具備免疫原性。常用的有免疫原性的佐劑有百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素和抗酸桿菌（包括結(jié)核分枝桿菌