膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)-2

1、器材準(zhǔn)備器材準(zhǔn)備濃汁標(biāo)本濃汁標(biāo)本1 1支，糞便標(biāo)本支，糞便標(biāo)本1 1支；碘酒棉球支；碘酒棉球1 1瓶，酒精棉球瓶，酒精棉球1 1瓶，眼科鑷子瓶，眼科鑷子2 2把；伊紅美蘭平板把；伊紅美蘭平板2 2個(gè)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板個(gè)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板5 5個(gè)。個(gè)。自然界中的微生物v已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的微生物超過13萬5千種，被認(rèn)為非常危險(xiǎn)的有600種，在人間傳染的病原微生物380種。它們存在于地球的各個(gè)角落，從寒冷的極地到炎熱的赤道，從4.2千米地層深處到85千米高空（芽孢）,均有它們的蹤跡 。v空氣、水、土壤、人體的體表以及與外界相通的腔道，均有不同種類和數(shù)量的微生物存在。v存在于人體消化道的細(xì)菌細(xì)菌超過800種，數(shù)量可達(dá)

2、100萬億（1014），菌體重量11.5公斤。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)三 P38 Comprehensive Experiment 3 v空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查空氣的細(xì)菌學(xué)檢查P38手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查P41空氣的細(xì)菌學(xué)檢查 空氣空氣是人類賴以生存的環(huán)境之一，也是重要的疾病傳播媒介。空氣中的病原菌主要來自病人的排泄物和分泌物。這些污物，因風(fēng)吹，以及人類日?；顒?dòng)，以氣溶膠氣溶膠的形式懸浮于空中，使空氣受到污染。v環(huán)境：不利于微生物生長(zhǎng)。v種類：主要是病毒、真菌和細(xì)菌。在醫(yī)院，公共場(chǎng)所致病菌的數(shù)量比較多。v作用：可迅速全球傳播。v危害：引起培養(yǎng)基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道傳染病。v實(shí)驗(yàn)

3、方法(自然沉降法):根據(jù)空氣中細(xì)菌氣溶膠粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)以后，計(jì)數(shù)菌落形成單位（ colony forming unit ，CFU），了解空氣的污染情況。v實(shí)驗(yàn)步驟：每組1個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，選擇采樣地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生間或任選地點(diǎn)），將平板蓋打開，蓋朝下放將平板蓋打開，蓋朝下放置在平板旁邊，平板暴露于空氣中置在平板旁邊，平板暴露于空氣中1515分鐘，分鐘，然后蓋上蓋子，作標(biāo)記。37溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。 CFU/m3 50000NAT86N(直徑7cm平板）。 N：平板上的菌落數(shù)。 A：平板面積(平方厘米)。 T：采樣時(shí)間(分鐘)。平 板 蓋打

4、 開 ，蓋 朝 下放 在 平板 旁 ，瓊 脂 平板 暴 露15分鐘?？諝獾募?xì)菌學(xué)檢查空氣的細(xì)菌學(xué)檢查 暴露法（暴露法（Exposure Method)Exposure Method)組號(hào)采樣地點(diǎn)采樣時(shí)間(min)菌落形成單位(CFU)1實(shí)驗(yàn)室152衛(wèi)生間153門診大廳154呼吸科走廊155呼吸科病房156呼吸科ICU157外科走廊158外科病房159外科ICU1510外科治療室15手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查P41v在日常生活中，手的接觸范圍廣，使用頻率高，受到污染的機(jī)會(huì)也最多。一只外觀比較“干凈 ”的手，可攜帶10萬個(gè)細(xì)菌、200多種病毒。因此，經(jīng)手傳播的疾病很多，范圍很廣，包括腸道傳染病、部分呼吸

5、道傳染病、皮膚傳染病，以及一切可經(jīng)手傳播的疾病。v常住菌：常住菌：存在于皮膚表面、毛囊和皮脂腺。種類和數(shù)量比較恒定。附著在皮膚上比較牢固，用一般洗手方法，常不易去除。v暫住菌：暫住菌：存在于皮膚表面經(jīng)常暴露的部位。暫住菌是外來的非正常菌群，種類和數(shù)量不定。引起人類致病的通常是暫住菌。v醫(yī)務(wù)人員，經(jīng)常與病人接觸，可傳播病菌。雖然病菌的直接來源是患者, 但是造成病菌擴(kuò)散的主要途徑則是氣溶膠和醫(yī)務(wù)人員的手。v經(jīng)常洗手和消毒是控制醫(yī)院內(nèi)交叉感染的主要方法。v預(yù)防感染措施中，最簡(jiǎn)單又十分有效的方法就是洗手。據(jù)測(cè)定，只用自來水洗手可使暫住菌暫住菌總數(shù)減少40%，用肥皂洗手可減少80%以上。v洗手？常規(guī)的洗

6、手方法常規(guī)的洗手方法（甲和丙操作）v將手充分浸濕，涂抹肥皂或洗滌液。v反復(fù)搓揉雙手，搓揉時(shí)間不應(yīng)少于 30秒。v用流水沖洗干凈，整個(gè)洗手過程不少于1分鐘。能有效地去除大多數(shù)手上的暫住菌。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)洗手方法標(biāo)準(zhǔn)洗手方法（乙和丁操作）v用流動(dòng)的水沖洗，將手充分浸濕，涂抹肥皂、洗滌液。用流動(dòng)的水沖洗，將手充分浸濕，涂抹肥皂、洗滌液。v分別搓擦分別搓擦10101515次。次。v保持雙手低于肘部，保持雙手低于肘部，流水沖洗一分鐘以上。流水沖洗一分鐘以上。1.1.掌心對(duì)掌心搓擦掌心對(duì)掌心搓擦 2.2.手指交錯(cuò)掌心對(duì)手背搓擦手指交錯(cuò)掌心對(duì)手背搓擦 3.3.手指交錯(cuò)掌心對(duì)掌心搓擦手指交錯(cuò)掌心對(duì)

7、掌心搓擦4.4.兩手互握互搓指背兩手互握互搓指背 5.5.拇指在掌中轉(zhuǎn)動(dòng)搓擦拇指在掌中轉(zhuǎn)動(dòng)搓擦 6.6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦1.掌心對(duì)掌心搓擦掌心對(duì)掌心搓擦 2.手指交錯(cuò)掌心對(duì)手背搓擦手指交錯(cuò)掌心對(duì)手背搓擦 3.手指交錯(cuò)掌心對(duì)掌心搓擦手指交錯(cuò)掌心對(duì)掌心搓擦4.兩手互握互搓指背兩手互握互搓指背 5.拇指在掌中轉(zhuǎn)動(dòng)搓擦拇指在掌中轉(zhuǎn)動(dòng)搓擦 6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查甲和乙、丙和丁共用1個(gè)平板上:甲、丙常規(guī)洗手下:乙、丁標(biāo)準(zhǔn)洗手甲（丙）乙（?。┍〉?格為洗手前，第2格為洗手后，第3格為消毒后，第4格空白對(duì)照。 在培養(yǎng)基表面觸摸

8、觸摸23厘米醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)一(P2)v膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)(二） 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)P7目的要求：掌握分離、純化微生物的基本操作技術(shù)。平板劃線分離法平板劃線分離法 Streak Plate MethodStreak Plate Methodv借助于劃線，將混雜的多種多種細(xì)菌，在平板表面分散成單個(gè)細(xì)菌，并固定在某一點(diǎn)上。培養(yǎng)以后細(xì)菌各自分裂繁殖，形成肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)（單菌落）。Colony：在固體培養(yǎng)基表面或基內(nèi)，由單個(gè)單個(gè)細(xì)菌在局部位置不斷增值，形成肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為單菌落。Colony Forming Units:由單個(gè)或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體，在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，

9、形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集落，稱為菌落形成單位。Lawn:在固體培養(yǎng)基表面，由許多菌落融合在一起形成一片密集的的細(xì)菌群落,稱為菌苔。平板分區(qū)劃線分離方法步驟（平板分區(qū)劃線分離方法步驟（5 5區(qū)）區(qū)）v接種環(huán)燒灼滅菌，以免污染標(biāo)本。v取標(biāo)本在平板表面上方密集涂布510mm2。v燒掉接種環(huán)上多余的標(biāo)本（火焰背面烤干燒灼）。v晃動(dòng)平板，當(dāng)看到平板表面象鏡面有反光的時(shí)候，保持這個(gè)角度，劃線時(shí)就能看清劃線痕跡，以便控制劃線。v接種環(huán)與平板呈3040度角，通過密集涂布部分3次，使接種環(huán)重新沾上少量標(biāo)本(細(xì)菌)，然后在平板表面，以曲線的形式，作大幅度來回連續(xù)劃線，邊劃邊退，線段要?jiǎng)澋瞄L(zhǎng)而密集，每區(qū)劃線不少于3

10、0條。v轉(zhuǎn)動(dòng)平板，接種環(huán)通過第一區(qū)1次，同樣的 方法劃第二區(qū)。如此依次劃完35區(qū)。v接種環(huán)燒灼滅菌，以免污染環(huán)境。v將平板倒置37培養(yǎng)1824h,觀察結(jié)果 。充分利用平板面積，不能劃破瓊脂。充分利用平板面積，不能劃破瓊脂。第四區(qū)第一區(qū)正確正確correctcorrect錯(cuò)誤錯(cuò)誤incorrectincorrect每區(qū)劃線不少于30條，整個(gè)平板劃線不少于150條線。37培養(yǎng)24小時(shí) 37培養(yǎng)24小時(shí) 小組分工v甲膿汁標(biāo)本營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(nutrient agar plate)v乙膿汁標(biāo)本營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(nutrient agar plate）v丙糞便標(biāo)本伊紅美藍(lán)平板(eosin methylene

11、blue plate）v丁糞便標(biāo)本伊紅美藍(lán)平板(EMB plate）甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 講 臺(tái)左右桿1214cm環(huán)直徑24mm柄10cm接種環(huán)接種環(huán) inoculatinginoculating looploop桿1214cm柄10cm針長(zhǎng)46cm接種針接種針 straight wirestraight wire inoculating inoculating wirewire ,inoculating needleinoculating needle

12、接種環(huán)燒灼滅菌 Flame Loopv使用前，直接在酒精燈上燒灼滅菌，把環(huán)和金屬絲燒紅即可燒紅即可，接種環(huán)35秒鐘冷卻 。v使用后，先在火焰背面將把環(huán)上標(biāo)本烤干，再燒灼滅菌，以免標(biāo)本汽化，爆烈四濺，污染環(huán)境。v金屬桿快速通過火焰23次，殺滅表面微生物。酒精燈無菌操作區(qū)外焰外焰:又稱氧化焰又稱氧化焰,火焰火焰呈淡紫色呈淡紫色,溫度較高。溫度較高。無菌操作區(qū)無菌操作區(qū): :火焰周火焰周圍圍101020cm20cm范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。環(huán)面水平水平離開液面：快速6ul,慢速2ul。環(huán)面垂直垂直離開液面：快速3ul,慢速1ul。接種環(huán)取液體標(biāo)本的方法接種環(huán)取液體標(biāo)本的方法環(huán)直徑環(huán)直徑3mm3mm無菌取材基本

13、步驟無菌取材基本步驟 在火焰旁邊，左手斜持標(biāo)本管下端，右手小指夾住試管棉塞上端，緩慢拔出棉塞并夾持之夾持之（棉塞下端不得接觸到管口外任何物體）管口迅速通過火焰3次取標(biāo)本取標(biāo)本管口通過火焰三次，塞棉塞。接種環(huán)、平板的握持方法接種環(huán)、平板的握持方法生物安全警告v接種環(huán)接種平板一次，可產(chǎn)生幾十個(gè)微生物氣溶膠顆粒。v氣溶膠粒徑100um沉降很快，50um在0.4s內(nèi)擴(kuò)散開，5um通過呼吸道直接到達(dá)肺泡。vPike博士對(duì)實(shí)驗(yàn)室感染統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達(dá)82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴(kuò)散引起的。v實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)坐著，在火焰周圍1020厘米內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話、少走動(dòng)，以免感染病原菌。

14、三級(jí)生物安全防護(hù)思考題v為何取鏈球菌作為空氣的衛(wèi)生指標(biāo)之一?v為什么金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的重要病原菌?v為什么接種環(huán)使用前后必須燒灼滅菌？忽略了有什么危害?v做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，平板為什么要倒置?v培養(yǎng)細(xì)菌的常用方法有哪些?v從臨床標(biāo)本中分離病原菌，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)? 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容v空氣的細(xì)菌學(xué)檢查P38營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(黃色,1組1個(gè)）v手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查P41營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(黃色,2人1個(gè) 劃分8格）v平板劃線分離法P8 甲膿汁標(biāo)本營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(黃色）乙膿汁標(biāo)本營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(黃色）丙糞便標(biāo)本伊紅美藍(lán)平板(紫色）丁糞便標(biāo)本伊紅美藍(lán)平板(紫色）常用器材擺放順序：電源插座常用器材擺放順序：電源插座試管架試管架酒精燈酒精燈污物盤。污物盤。試管架上器材：靠近插座一側(cè)第試管架上器材：靠近插座一側(cè)第