不同成脂條件下人骨髓間充質干細胞的早期成脂特性

1、www.CRTER.org田健健，等. 不同成脂條件下人骨髓間充質干細胞的早期成脂特性不同成脂條件下人骨髓間充質干細胞的早期成脂特性田健健1，池 穎1，宋寶全1，杜文靜1，韓之波1，韓忠朝1，2(1中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所血液病醫(yī)院，實驗血液學國家重點實驗室，天津市 300020；2細胞產(chǎn)品國家工程研究中心，天津市 300457)引用本文：田健健，池穎，宋寶全，杜文靜，韓之波，韓忠朝. 不同成脂條件下人骨髓間充質干細胞的早期成脂特性J.中國組織工程研究，2016，20(23):3366-3373.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.00

2、3 ORCID: 0000-0003-2660-0402(田健健)文章快速閱讀：3種不同成脂誘導體系對骨髓間充質干細胞的誘導差異田健健，女，1986年生，河北省張家口市人，漢族，2016年北京協(xié)和醫(yī)學院畢業(yè)，碩士，主要從事間充質干細胞及骨髓微環(huán)境相關的研究。通訊作者：韓忠朝，博士，研究員，博士生導師，中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，天津市 300020；細胞產(chǎn)品國家工程研究中心，天津市 300457中圖分類號:R394.2文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)23-03366-08稿件接受：2016-04-25DIMRDIM油紅O

3、染色PPAR，C/EBP蛋白表達脂肪相關基因DIMIpS273PPAR/PPAR 文題釋義：共同前體細胞：骨髓中獲得的間充質干細胞，在體外具有增殖和多向分化的能力，被認為是成骨和成脂分化的共同前體細胞。成脂和成骨過程被認為存在著一種平衡，即向成骨分化的同時抑制了成脂分化。該過程受到多種信號通路的共同作用，但最終都表現(xiàn)在對主要轉錄因子的調控上，包括PPAR和Runx2。它們分別被認為是成脂和成骨的管家基因。脂肪因子：脂肪組織在體內(nèi)不僅起到貯存能量的作用，而且可以作為內(nèi)分泌器官分泌多種生物活性成分。這些由脂肪細胞產(chǎn)生的生物活性分子稱為脂肪因子，包括PPAR，F(xiàn)ABP-4，adiponectin，l

4、eptin等。它們不僅通過自分泌和旁分泌作用影響脂肪細胞的功能，而且可以分泌到血液中對能量代謝、免疫防御、成血管和脂肪代謝產(chǎn)生作用，以此維持機體平衡。摘要背景：目前骨髓間充質干細胞的成脂誘導方法眾多，其主要誘導成分包含吲哚美辛或羅格列酮。各種方法均能誘導骨髓間充質干細胞成脂分化，但其成脂誘導效率和機制尚缺少相互對比。目的：比較不同成脂誘導方法對人骨髓間充質干細胞的早期成脂效果，并探討其成脂誘導差異的可能機制。方法：分離培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞，通過油紅O染色和成脂相關基因檢測，比較3種不同誘導方法對人骨髓間充質干細胞的成脂效果。在誘導早期不同時間點(0，1，3，7 d)檢測成脂相關基因PPAR，

5、C/EBP，Adiponectin，Leptin mRNA表達。Western blot檢測成脂誘導第7天時PPAR、C/EBP蛋白表達，并比較DIMI，DIMR對PPAR-Ser273位點磷酸化作用。結果與結論：油紅O染色和成脂相關基因檢測結果顯示，在骨髓間充質干細胞成脂誘導分化第7天，DIMR組成脂效果明顯強于DIM組和DIMI組；Western blot檢測結果顯示在成脂第7天，DIMI組PPAR、C/EBP蛋白表達量高于其他組，差異有顯著性意義；DIMR組PPAR-Ser273位點磷酸化比例低于DIMI組；結果表明，含羅格列酮的成脂培養(yǎng)基DIMR對人骨髓間充質干細胞的早期成脂誘導作用最

6、強，且該作用可能與減少PPAR-Ser273位點磷酸化有關。關鍵詞：干細胞；骨髓干細胞；羅格列酮；人骨髓間充質干細胞；成脂誘導分化；吲哚美辛； PPAR；國家自然科學基金 主題詞：骨髓；間質干細胞；成脂分化；吲哚美辛；PPAR；組織工程3367 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083基金資助：國家自然科學基金面上項目(31470951)；國家自然科學基金重點項目(81330015)Properties of human bone marrow mesenchymal stem cells in the early phase of adipogenic

7、differentiation in different culture systemsTian Jian-jian1, Chi Ying1, Song Bao-quan1, Du Wen-jing1, Han Zhi-bo1, Han Zhong-chao1, 2 (1Hematonosis Hospital, Institute of Hematology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, State Key Laboratory of Experimental Hematolo

8、gy, Tianjin 300020, China; 2National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300457, China)AbstractBACKGROUND: There are various methods to induce adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and the main component for adipogenic induction is indomethacin or rosigl

9、itazone. However, there is a lack of comparative study on the induction efficiency and mechanism among these methods.OBJECTIVE: To compare the adipogenic responses of human bone marrow mesenchymal stem cells to different induction methods, and to analyze the mechanism underlying different induction

10、efficiency.METHODS: After isolation and purification, the adipogenic abilities of human bone marrow mesenchymal stem cells in three different culture systems were compared by oil red O staining and lipogenic gene assay. At 0, 1, 3 and 7 days of adipogenensis, mRNA expressions of PPAR, C/EBP, Adipone

11、ctin and Leptin were detected. At 7 days of adipogenensis, protein expressions of PPAR and C/EBP were detected by western blot assay, and effects of DIMI versus DIMR on phosphorylation of PPAR at Ser273 were compared.RESULTS AND CONCLUSION: Findings from oil red O staining and re

12、al-time PCR showed that DIMR significantly induced adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells compared with DIM and DIMI at 7 days of induction. Western blot showed that the protein expressions of PPAR and C/EBP in the DIMI group were significantly higher than those in the DIMR

13、 and DIM at 7days of induction. In addition, the ratio of PPAR phosphorylation at Ser273 was lower in the DIMR group than the DIMI group. To conclude, DIMR has the most potential to induce early adipogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells by weakening the phosphorylation of PPAR-Ser273.

14、 Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Adipogenesis; Indomethacin; PPAR gamma; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31470951, 81330015Cite this article: Tian JJ, Chi Y, Song BQ, Du WJ, Han ZB, Han ZC. Properties of human bone marrow mesenc

15、hymal stem cells in the early phase of adipogenic differentiation in different culture systems. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(23):3366-3373.Tian Jian-jian, Master, Hematonosis Hospital, Institute of Hematology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, State

16、Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, ChinaCorresponding author: Han Zhong-chao, M.D., Investigator, Doctoral supervisor, Hematonosis Hospital, Institute of Hematology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, State Key Laboratory of Experimental H

17、ematology, Tianjin 300020, China; National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300457, China3371ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction間充質干細胞是一類來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，最早由Friedenstein及其同事從骨髓細胞中培養(yǎng)出該細胞，Prockop和Pittenger等分別證實其具有分化為多種間質組織(如骨、軟骨、脂肪和平滑肌)的能力1-2。間

18、充質干細胞向成脂細胞方向分化的研究可應用于多個方面，如肥胖、脂質代謝、干細胞分化、組織工程學領域和骨代謝生理等3-4。由于研究領域廣泛，各個領域研究人員采用的誘導成脂方法各不相同，從而產(chǎn)生多種誘導表型和不同分化水平。目前有研究證實含有羅格列酮的成脂培養(yǎng)基(DIMR)在第6-8天即可誘導骨髓間充質干細胞成脂分化，顯著縮短了成脂誘導時間5，然而對各種成脂誘導培養(yǎng)基的誘導效率缺乏相應對比，因此有必要研究不同誘導培養(yǎng)條件下骨髓間充質干細胞的早期成脂特性。實驗比較不同成脂體系DIM，DIMI，DIMR對骨髓間充質干細胞的成脂誘導效果，并探索導致其不同成脂效率的可能機制。1 材料和方法 Materials

19、 and methods 1.1 設計 細胞學體外對比觀察。1.2 時間及地點 于2015年1至11月在中國醫(yī)學科學院血液學國家重點實驗室完成。1.3 材料 骨髓間充質干細胞來源于中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院正常獻髓者(均簽署知情同意書)，男女比例 32，中位年齡33歲(23-47歲)。人骨髓間充質干細胞在不同成脂條件下早期成脂特性檢測所用主要試劑與儀器：試劑及儀器來源DMEM/F12、IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清GIBCO公司羅格列酮、吲哚美辛、地塞米松、IBMX美國Sigma公司人胰島素Peprotech公司兔抗GAPDH、兔抗PPAR、兔抗C/EBPCell Signaling Technolo

20、gy公司兔抗pPPAR-Ser273 NOVUS biologicals公司Rhodamine PhalloidinThermoFisher公司垂直板電泳儀北京六一儀器廠-80 冰箱Thermo Forma恒溫CO2孵箱美國IR公司倒置光學顯微鏡日本Nikon公司1.4 實驗方法1.4.1 骨髓間充質干細胞的分離及培養(yǎng) 無菌抽取正常獻髓者(經(jīng)知情同意后提供)骨髓約5 mL，按Ficoll (1.077 g/mL)密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞。用DF12完全培養(yǎng)液(DMEM/F12、體積分數(shù)為10%胎牛血清、2 µmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/鏈霉素)重懸分離的骨髓單

21、個核細胞，按1×105密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，收集第3-5代細胞待用。1.4.2 骨髓間充質干細胞流式鑒定 將80%融合的人骨髓間充質干細胞用0.25%胰酶消化，細胞懸液以 1 200 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗3次，再加入PBS重懸細胞，計數(shù)，每管細胞濃度為1×109 L-1，1 200 r/min離心5 min，棄上清，每管剩余100 L PBS，打散細胞，分別加入CD14，CD19，CD34，CD45，CD44，CD73，CD90，CD105單克隆抗體，設空白對照管，4 孵育30 min后，向各管加入1 mL PBS離心，重復

22、洗細胞2次去除未標記抗體，加入400 L PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。1.4.3 骨髓間充質干細胞成骨分化及染色 骨髓間充質干細胞加入成骨誘導體系(IMDM培養(yǎng)基、體積分數(shù)為10%胎牛血清、0.1 mol/L地塞米松、0.2 mmol/L 2-磷酸抗壞血酸、10 mmol/L -磷酸甘油、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素/鏈霉素)繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，共誘導14-21 d，進行Von Kossa染色。步驟如下：用平衡至室溫的PBS洗滌細胞2次，40 g/L多聚甲醛固定5 min，雙蒸水沖洗3次，加入適量5%硝酸銀溶液，將培養(yǎng)板開蓋在紫外燈下照射一兩個小時，吸出殘

23、留硝酸銀溶液，雙蒸水沖洗3次，加入適量5%硫代硫酸鈉溶液以中和殘留的硝酸銀，最后吸出殘液，室溫干燥，該方法可將細胞內(nèi)的鈣鹽染成黑色。1.4.4 三種成脂培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)方法 骨髓間充質干細胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基中至80%融合時，更換為成脂誘導培養(yǎng)基，每3 d換液1次。DIM成脂誘導培養(yǎng)基成分：IMDM，體積分數(shù)為10%胎牛血清，10 mg/L胰島素，1 mol/L地塞米松，500 mol/L IBMX。DIMI成脂誘導培養(yǎng)基成分：IMDM，體積分數(shù)為10%胎牛血清，1 mol/L地塞米松，500 mol/L IBMX，10 mg/L胰島素，60 mol/L吲哚美辛。DIMR成脂誘導成分

24、：IMDM，體積分數(shù)為10%胎牛血清，250 nmol/L地塞米松，500 µmol/L IBMX，5 mg/L胰島素，1 µmol/L羅格列酮。1.4.5 油紅O染色和免疫熒光 采用DIM，DIMI，DIMR方法誘導分化的骨髓間充質干細胞(n=3)在30 g/L多聚甲醛中固定15 min，0.1%Triton X-100破膜5 min，PBS洗3遍，5%BSA(PBS配)室溫封閉30 min，Oil-Red O(60%異丙醇配制)染色45 min，PBS沖洗3遍。肌動蛋白微絲(actin filaments)使用Rhodamine Phalloidin染色。細胞核使用DA

25、PI染色。所有熒光染料使用Leica激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。Image J半定量每40×視野中油紅O染色面積。1.4.6 Real-time PCR方法檢測基因的表達 采用DIM，DIMI，DIMR方法誘導分化骨髓間充質干細胞，于成脂誘導第1，3，7天收集細胞，并以未刺激組做對照，用E.Z.N.A.TotalRNA kit(Omega)提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，使用Real-time PCR檢測基因改變。反應擴增條件為：94 30 s預變性；94 5 s，60 34 s 40個循環(huán)。引物序列見表1。結果以2-Ct法計算各樣本相對表達量。1.4.7 Western blot

26、檢測 在誘導分化第0，1，3，7天收集細胞，RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，按30 g上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入GAPDH、PPAR、C/EBP、pPPAR-Ser273抗體4 孵育過夜，TBST洗膜3次，加入對應二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，顯影、曝光。采用Image J軟件對蛋白顯影條帶進行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。表1 實時定量PCR的引物序列 Table 1 Primer sequences by real-time PCR基因Forward primerReverse p

27、rimerGAPDH5- CGG ATT TGG TCG TAT TGG GC -35- CTT CCC GTT CTC AGC CTT G -3PPAR5-AGC CTC ATG AAG AGC CTT CCA-35-ACC CTT GCA TCC TTC ACA AGC-3adiponectin5-AGG CCG TGA TGG CAG AGA T-35-TCC AAT CCC ACA CTG AAT GCT-3LPL5-CTC TTG GGA TAC AGC CTT GG-35-GGG GCT TCT GCA TAC TCA AA-3C/EBPleptin5-GAA GTT GGT GG

28、A GCT GTC GG-35-TTC TTG TGG CTT TGG CCC TA-35-TGA GGT ATG GGT CGT TGC TGA-35-GGA GAC TGA CTG CGT GTG TGT GAA-3FABP45- AAC CTT AGA TGG GGG TGT CC-35- GTG GAA GTG ACG CCT TTC AT-31.5 主要觀察指標 油紅O染色檢測骨髓間充質干細胞的成脂能力。Real-time PCR檢測分化早期階段各成脂相關基因mRNA的表達。Western blot檢測分化早期階段PPAR、C/EBP、pPPAR-Ser273蛋白表達。1.6 統(tǒng)計學

29、分析 采用SPSS 19.0軟件進行分析，結果數(shù)值以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，3組比較采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結果 Results 2.1 骨髓間充質干細胞的鑒定 經(jīng)密度梯度離心法分離的人骨髓間充質干細胞貼壁培養(yǎng)14-20 d可達70%-80%融合，呈平行排列或漩渦樣生長(圖1A)；成脂誘導14 d后，經(jīng)油紅O染色可見被染成的紅色脂滴(圖1B)；成骨分化21 d后，經(jīng)Von Kossa染色可見明顯的黑色鈣鹽沉積(圖1C)；采用流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞表面標志物顯示CD44、CD73、CD90和CD105呈陽性表達，CD14、

30、CD19、CD34、CD45呈陰性表達(圖1D)。2.2 DIMR對骨髓間充質干細胞的成脂誘導作用明顯 采用DIM，DIMI與DIMR成脂誘導方法對骨髓間充質干細胞誘導6-8 d，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)，DIMR組細胞內(nèi)較大脂肪滴形成，成脂程度明顯高于DIM和DIMI組(圖2)。Real-time PCR檢測不同時間點成脂相關基因PPAR，adiponectin，LPL，C/EBP，leptin及FABP4 mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)在成脂誘導早期，adiponectin，LPL mRNA表達不斷增加，PPAR、C/EBP、leptin、FABP4 mRNA在DIMR組中3 d時表達最高(圖3)。在成

31、脂誘導第7天時，adiponectin表達在DIM組中基本不變，DIMI組和DIMR組表達明顯增加，且DIMR組高于DIMI組。PPAR和LPL mRNA在DIM、DIMI和DIMR組均明顯升高，但在DIMR組增高程度高于其他兩組。C/EBP和FABP4 mRNA在誘導第7天時，DIM組基本無變化，DIMI組和DIMR組均明顯增加，但兩組差異不明顯。Leptin mRNA在DIM、DIMI和DIMR組中均顯著增高。DIMR組在成脂誘導第1天和第3天時高于其余兩組，但在第7天時呈明顯下降趨勢。2.3 不同方法成脂誘導后骨髓間充質干細胞成脂相關蛋白的表達 Western blot檢測骨髓間充質干細

32、胞成脂誘導分化第1，3，7天時各組PPAR和C/EBP蛋白表達量。結果顯示在成脂誘導第1天時，DIMI和DIMR組PPAR表達量明顯增加，DIM組無明顯改變，在第3，7天時各組PPAR蛋白表達量顯著增加(圖4)，差異有顯著性意義(P < 0.05)。在各時間點，DIMI組均誘導表達更多的PPAR。DIM，DIMI，DIMR組在成脂誘導第7天時，PPAR表達量分別增加了2倍，2.8倍，2.2倍。在第7天，DIMI組與DIMR組PPAR蛋白表達差異有顯著性意義(P < 0.05)，這一結果與基因誘導表達情況不完全一致。C/EBP蛋白量在第3天時明顯增加，第3天與第7天表達量無明顯差異，

33、但DIMI組在第3，7天時的誘導表達量顯著高于其他兩組，差異有顯著性意義(P < 0.05)。2.4 DIMI，DIMR對PPAR-Ser273位點磷酸化的作用 雖然油紅O染色及成脂相關基因mRNA均顯示DIMR組較DIMI組有更強的誘導成脂效果，但PPAR及C/EBP蛋白水平檢測DIMI組對其誘導表達作用卻強于DIMR組，考慮到羅格列酮作為PPAR的強效激動劑，可直接激活PPAR發(fā)揮作用，因而實驗繼續(xù)檢測了DIMI、DIMR組PPAR-Ser273的磷酸化水平，結果顯示，誘導分化第7天時兩組中pPPAR-Ser273水平相似，但DIMR組pPPAR/PPAR比例明顯低于DIMI組(圖5

34、)。 C B A圖1 人骨髓間充質干細胞特性Figure 1 Characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells圖注：圖中A為人骨髓間充質干細胞生長形態(tài)(標尺為200 m)；B為成脂誘導14 d后油紅O染色(標尺為200 m)；C為成骨誘導14 d后Von Kossa染色(標尺為200 m)；D為流式細胞儀檢測骨髓間充干細胞表面標志物。 D圖2 油紅O染色檢測各組骨髓間充質干細胞成脂誘導后脂滴形成情況Figure 2 Lipid droplet formation after adipogenic induction of

35、bone marrow mesenchymal stem cells by oil red O staining圖注：圖中A為DIM，DIMI，DIMR法誘導骨髓間充質干細胞成脂分化第7天油紅O染色(紅)，肌動蛋白微絲采用Rhodamine Phalloidin染色(綠)，細胞核用DAPI染色(藍)，使用共聚焦顯微鏡拍照(標尺為40 m)；B為Image J軟件計算各組油紅O染色面積并除以細胞核數(shù)(P < 0.01)，n=5。P < 0.0186420P < 0.01油紅O染色面積(%)對照組 DIM組DIM組 DIMI組 DIMR組DIMI組 DIMR組 B ADIM DI

36、MIDIMRDIM DIMIDIMRDIM DIMIDIMR0 d 2 d 4 d 6 d 8 dC/EBP mRNA相對表達水平0 d 2 d 4 d 6 d 8 dleptin mRNA相對表達水平27262524232221202-1 C262524232221202-1PPAR mRNA相對表達水平292827262524232221202-1 E0 d 2 d 4 d 6 d 8 dFABP4 mRNA相對表達水平0 d 2 d 4 d 6 d 8 dLPL mRNA相對表達水平 B A2524232221202-1adiponectin mRNA相對表達水平0 d 2 d 4 d

37、6 d 8 d0 d 2 d 4 d 6 d 8 d F DDIM DIMIDIMRDIM DIMIDIMRDIM DIMIDIMR22522021521025202-52152102520圖3 骨髓間充質干細胞成脂進程不同時間點檢測成脂相關基因的表達水平Figure 3 Expressions of adipogenesis-related genes during the adipogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells 圖注：Real-time PCR檢測DIM，DIMI，DIMR誘導骨髓間充質干細胞在第1，3，7天時成脂相關基因PPA

38、R，adiponectin，LPL，C/EBP，leptin及FABP4 mRNA的表達水平，n=3。DIM DIMIDIMRDIM DIMIDIMR Baaa0 d 1 d 3 d 7 d C/EBP的相對蛋白表達水平1086420PPAR的相對蛋白表達水平0 d 1 d 3 d 7 d a1086420 A0 d 1 d 3 d 7 d aPPARC/EBPGAPDH圖4 PPAR、C/EBP在骨髓間充質干細胞成脂誘導早期的蛋白表達水平Figure 4 Protein expressions of PPAR and C/EBP in early phase of adipogenic di

39、fferentiation of bone marrow mesenchymal stem cells圖注：圖中A 為成脂誘導第1，3，7天時PPAR和C/EBP蛋白表達量；B為灰度分析PPAR和C/EBP的表達量變化(aP < 0.05)，n=5。對照組 DIM組 DIMI組 DIMR組 DIM組 DIMI組 DIMR組 DIM組 DIMI組 DIMR組BApPPAR/PPAR0.20GAPDHPPARpPPARDIMI組 DIMR組DIMI組 DIMR組圖5 DIMI、DIMR成脂誘導第7天時PPAR-Ser273位點磷酸化情況Figure 5 Phosphoryl

40、ation level of PPAR-Ser273 at 7 days after adipogenic induction by DIMI and DIMR圖注：圖中A 為骨髓間充質干細胞成脂誘導第7天時PPAR- Ser273位點磷酸化量；B為DIMI，DIMIR組pPPAR與PPAR灰度值比值，差異無顯著性意義，n=3。3 討論 Discussion骨髓是分離培養(yǎng)間充質干細胞的最早來源1-2。骨髓間充質干細胞被認為是脂肪前體細胞和成骨細胞的共同前體細胞6-8。骨髓脂肪化研究在再生障礙性貧血和骨質疏松等疾病中具有重要意義9-11。不僅如此，骨髓間充質干細胞也可作為人體模型用于干細胞分化調

41、控和組織工程學等方面研究。例如，燒傷患者軟組織萎縮，通過組織工程方法重塑脂肪組織可使之獲益12。目前成脂誘導方法眾多，各方法成分組成及用量差別較大，不同誘導方法產(chǎn)生的脂肪細胞功能特性有可能不同，這使得不同研究方法的結果常常不存在可比性3。有研究提出含有羅格列酮的成脂培養(yǎng)基在第6-8天即可誘導骨髓間充質干細胞成脂分化，較目前通用的成脂誘導方法迅速有效，因此有必要研究不同誘導條件下骨髓間充質干細胞的早期成脂特性。吲哚美辛作為一種非類固醇抗炎藥廣泛應用于臨床，其促成脂特性也得到普遍認可13。目前認為吲哚美辛主要通過直接增加PPAR蛋白表達量，或者影響PPAR轉錄后調節(jié)機制，而非增加PPAR轉錄激活能

42、力來發(fā)揮促成脂特性14。C/EBP是一種參與早期成脂分化的轉錄因子，一些研究證實它可能是PPAR結合染色質的啟動因子15。目前認為，在成脂誘導分化開始時，cAMP首先升高，繼而cAMP應答元件結合蛋白(CREB)磷酸化。磷酸化的CREB誘導表達C/EBP家族成員C/EBP。C/EBP家族的另外2個成員(C/EBP，C/EBP)也參與骨髓間充質干細胞成脂分化。C/EBP和C/EBP在成脂誘導開始4 h內(nèi)即快速上調，但此時的C/EBP為非活性蛋白，不能和DNA結合。C/EBP的激活需要Thr188、Thr179或Ser184位點磷酸化。C/EBP可以和C/EBP、PPAR啟動子附近的調節(jié)元件結合，

43、激活它們的轉錄。一旦被激活，C/EBP可通過與C/EBP、PPAR相對應的C/EBP調節(jié)元件結合，來維持C/EBP和PPAR的持續(xù)表達。C/EBP和PPAR可共同作用來調節(jié)大量基因，包括脂肪細胞表型基因16-18。C/EBP可以協(xié)同促進PPAR、C/EBP的表達，且在早期表達。C/EBP的表達相對較晚，主要通過調節(jié)成脂特異性基因表達，促進脂肪細胞的終末分化。Western blot結果顯示DIMI對C/EBP的誘導表達量顯著高于其余2組，因此，DIMI有可能通過上調C/EBP表達量，促進PPAR蛋白表達而促進成脂。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類抗糖尿病藥，作為PPAR的強效激動劑，可直接激活PPAR

44、而誘導相關基因表達19-20。Benvenuti等21證實1 mol/L羅格列酮即可誘導人骨髓間充質干細胞成脂分化，形成脂滴。但David Contador，Ninomiya等研究表明單獨應用羅格列酮并不足以誘導骨髓間充質干細胞分化為成熟脂肪細胞，而與地塞米松聯(lián)合時可有效誘導成脂5，22，這提示羅格列酮還可能通過增加對胰島素的敏感性促進成脂，形成較成熟的脂肪細胞。此外，Choi等23研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可通過降低PPAR- Ser273磷酸化程度增加成脂相關基因表達。動物實驗證實高脂飲食可以通過激活Cdk5增加PPAR- Ser273位點磷酸化，從而降低一些對胰島素敏感蛋白的表達，如adipone

45、ctin。羅格列酮可抑制該位點磷酸化，促進下游基因表達。當然通過調節(jié)PPAR促進成脂的機制還有很多，比如增加活性PPAR比例，調節(jié)PPAR轉錄共刺激因子，增加PPAR核轉移等22，24，其他成脂相關因子如adiponectin，瘦素，脂蛋白脂酶等在成脂中的作用尚不完全清楚，但它們可通過自分泌和旁分泌作用影響脂肪細胞的功能，而且可以分泌到血液中對代謝產(chǎn)生作用25-26。實驗通過檢測早期誘導骨髓間充質干細胞表達成脂相關基因的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在誘導0-7 d內(nèi)，脂肪相關基因表達變化幅度大，均呈上升趨勢，且在誘導后第1天就可觀察到表達明顯上升。通過比較3組培養(yǎng)條件下的誘導效果，可發(fā)現(xiàn)3種培養(yǎng)方法對基

46、因的誘導表達程度并不相同，說明不同成脂誘導培養(yǎng)體系對人骨髓間充質干細胞產(chǎn)生的誘導特性并不相同，即在不同誘導條件下進行的實驗結果很可能存在較大差異。通過比較DIM，DIMI與DIMR 3種方法對人骨髓間充質干細胞的成脂誘導能力，發(fā)現(xiàn)3種方法均可誘導成脂，但DIMR誘導體系能夠更快速有效的促進骨髓間充質干細胞成脂分化。雖然不同樣本間的成脂效率有所差別，但同一樣本來源的骨髓間充質干細胞誘導結果均顯示DIMR組成脂效率更高。有趣的是，雖然油紅O染色與成脂相關基因檢測均顯示DIMR組具有更強的成脂誘導能力，但Western blot結果顯示，在成脂第3天與第7天時DIMI組PPAR、C/EBP蛋白表達量

47、顯著高于DIMR組。雖然調控骨髓間充質干細胞成脂分化的機制和分子眾多，但PPAR無疑是最重要的調控因子27-30。PPAR通常情況存在活化及非活化狀態(tài)，而目前研究認為活化PPAR在骨髓間充質干細胞成脂誘導中發(fā)揮著更重要的作用。相應研究顯示PPAR-Ser273位點磷酸化水平增高會減少PPAR下游基因的表達14。為探究DIMR快速有效成脂的機制，實驗檢測了PPAR- Ser273位點磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)DIMR組在成脂第7天時pPPAR/PPAR比值低于DIMI組，這提示DIMR有可能通過更強的翻譯后修飾功能提高具有活性的PPAR比例，使其高效轉錄激活下游基因。綜上所述，骨髓間充質干細胞在DIM

48、，DIMI與DIMR條件下均能誘導成脂分化，但DIMR相比DIM和DIMI能使骨髓間充質干細胞更快速地成脂誘導，因此作者推論DIMR可能在骨髓間充質干細胞成脂誘導分化早期發(fā)揮更重要的功能，而該作用可能涉及到PPAR蛋白活化?？傊?，通過比較不同成脂誘導條件，發(fā)現(xiàn)DIMR體系可以更快速有效的誘導骨髓間充質干細胞成脂，但其具體的機制有待進一步闡明。作者貢獻：設計、實施和數(shù)據(jù)收集為田健健，評估為池穎、宋寶全、杜文靜、韓之波，文章審校為韓忠朝。利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關利益沖突。倫理問題：骨髓捐獻者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院倫理委員會批準。文章查重：文章出版前

49、已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協(xié)議。4 參考文獻 References1 Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 1997; 276(5309): 71-74.2 Pitt

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