免疫細胞化學(xué)

1、(一) 免疫熒光法 【原理】 ¨ 用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原； ¨ 熒光素經(jīng)某種特定波長的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長更長而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤； ¨ 借助于熒光顯微鏡進行觀察。 1、常用的熒光素 ¨ (1) 異硫氰酸熒光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC) ¨ (2) 四甲基異硫氰酸羅丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC) ¨ (3) 四乙基羅丹明 (RB200) ¨ (

2、4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI) (1) 異硫氰酸熒光素(FITC) ¨ 易溶于水和乙醇。 ¨ 最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為 520530nm呈翠綠色熒光，分子量 389.4。 ¨ 在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與Ig的自由氨基形成共價鍵，成為標(biāo)記的熒光抗體。一個lgG分子上最多能標(biāo)記1520個FITC分子。 (2) 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC) ¨ 最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈紅色熒光，分子量為444。 ¨ 與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式同F(xiàn)ITC。 (3) 四乙基羅

3、丹明(RB200) ¨ 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。 ¨ 最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595600nm，呈橙紅色熒光，分子量為580。 ¨ RB200在五氯化磷(PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯(SO2Cl)，在堿性條件下，易與蛋白質(zhì)的賴氨酸e-氨基反應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。 (4) 碘化丙啶(PI) ¨ 是常用的DNA熒光標(biāo)記探針，可作為FITC的胞核對比染色。 ¨ PI可嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對中并與之結(jié)合，但對堿基無特異性選擇。 ¨ 最大吸收光譜是493nm，最大發(fā)射光譜是630nm，呈紅色熒光。 2、熒光抗體的保存

4、 ¨ 一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發(fā)猝滅。 一般認(rèn)為04°C可保存12年，-20°C可保存34年。 要小量分裝，防止反復(fù)凍融。 保存前需加防腐劑 (濃度為1:500010000的硫柳汞或1:10005000疊氮化鈉) 。 3、免疫熒光的染色方法 ¨ 免疫熒光染色法常用的有 直接法 間接法 j原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng) (用來檢測未知抗原)。 k直接免疫熒光法的操作步驟 ¨ 標(biāo)本的處理： 細胞涂片、細胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-

5、100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次； 石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進行抗原修復(fù)，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ¨ 2%BSA或10%BSA37濕盒內(nèi)封閉30min ¨ 抗體染色： 在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體(1:8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37孵育30min； k直接免疫熒光法的操作步驟(續(xù)) ¨ 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不時震蕩(洗去多余游離的熒光素標(biāo)記的抗體)。 ¨ 緩沖甘油封片 分析純無熒光的甘油9份+ pH 9.2，

6、0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。 ¨ 鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察。 ¨ 優(yōu)點：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。 ¨ 缺點：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體。 m直接免疫熒光法的注意事項 ¨ 對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度； ¨ 一般稀釋度不應(yīng)超過1:20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。 m直接免疫熒光法的注意事項 (續(xù)) ¨ 染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化； 染色時間：從10 min到數(shù)小時，一般30 mi

7、n； 染色溫度：多采用室溫(25)，高于37可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2的低溫，延長染色時間。 低溫染色過夜較37 30 min效果好的多。 m直接免疫熒光法的注意事項 (續(xù)) ¨ 試驗時需設(shè)置下列對照： 自發(fā)熒光對照(空白對照)：標(biāo)本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 陽性對照：用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 特異性對照(抑制試驗)：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 ¨ 若標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。 m直接免疫熒光法的注

8、意事項 (續(xù)) ¨ 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象； ¨ 經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。 (2) 間接法又稱為熒光抗-抗體法 j 需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標(biāo)記)。一抗對標(biāo)本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標(biāo)記的二抗來說又起著抗原作用。 可用來檢測標(biāo)本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。 k間接免疫熒光法操作步驟 ¨ 標(biāo)本的處理及非特異染色的封閉同直接法； ¨ 一抗染色： 加未標(biāo)記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用0.01MpH7.4的PBS稀釋)，37作用30min或4過夜。

9、 ¨ 0.01M PBST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)； k間接免疫熒光法操作步驟(續(xù)) ¨ 加熒光標(biāo)記的二抗抗體，37濕盒避光作用30min。 ¨ 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)； ¨ 甘油緩沖液封片 ¨ 鏡檢 ¨ 優(yōu)點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標(biāo)記抗體，可應(yīng)用于多種一抗； ¨ 缺點：是參加反應(yīng)的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機會增多。 m間接免疫熒光法的注意事項 ¨ 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時間過長 ，會

10、使熒光減弱。 ¨ 每次試驗時 ，需設(shè)置以下三種對照： 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物 熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物 m間接免疫熒光法的注意事項(續(xù)) ¨ 標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。 ¨ 一抗和二抗應(yīng)始終保持在標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。 (二) 免疫酶酶標(biāo)法 【原理】 ¨ 以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位； ¨ 酶降解底物的量與色澤濃度成正比。可反映被測定的抗原或抗體的量。 1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 &#

11、168; 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物 ¨ 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物 (1) 辣根過氧化物酶(HRP)及底物 ¨ HRP是應(yīng)用最廣的一種酶，來源于植物辣根，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結(jié)合而成，分子量約40kDa，穩(wěn)定性好； ¨ 底物為過氧化物和供氫體(DH2) 過氧化物：常用過氧化氫和過氧化氫尿素。 供氫體：多用無色的還原型染料，通過反應(yīng)生成有色的氧化 型染料，最常用的供氫體是DAB。 DAB (二氨基聯(lián)苯胺) ¨ DAB本身無色，反應(yīng)后呈棕色，不溶于水，不

12、易褪色，電子密度高，最為常用。 ¨ 目前已經(jīng)有商品化的試劑盒，使用起來非常方便。 (2) 堿性磷酸酶(AP)及底物 ¨ AP為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應(yīng)顯色： 偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，底物為a-萘酚磷酸鹽，經(jīng)水解后得a-萘酚，與重氮化合物如堅牢藍(fast blue)或堅牢紅(fast red)形成不溶性沉淀，分別呈蘭色或紅色。 靛藍-四唑反應(yīng)：底物為溴氯羥吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，經(jīng)酶水解并氧化形成靛藍，而氮藍四唑(NBT)在此氧化過程中被還原成不溶性紫蘭色沉淀。 2、常用的免疫酶染色方法 ¨ 又

13、分為以下兩種方法： 酶標(biāo)抗體法 直接法 間接法 非標(biāo)記抗體酶法 酶橋法 PAP法 (1) 酶標(biāo)抗體法 ¨ 通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，與標(biāo)本進行反應(yīng)后，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。 優(yōu)點：切片能長期保存、反復(fù)觀察，適于鏡下半定量分析。 缺點：酶與抗體形成的共價鍵，可損害抗體和酶的活性；易產(chǎn)生非特異染色。 (1) 酶標(biāo)抗體法直接法 ¨ 將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。 (1) 酶標(biāo)抗體法間接法 ¨ 將酶標(biāo)記在二抗上，先將一

14、抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟 ¨ 標(biāo)本準(zhǔn)備： 石蠟脫蠟至水； 冰凍切片浸入4°C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3； 細胞爬片先用PBS洗，然后4°C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3； ¨ 石蠟切片需要進行抗原修復(fù)，其它標(biāo)本則不用； (2) 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù)) ¨ 封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3H2O2-甲醇溶液室溫孵育510min

15、 (濕盒內(nèi)) ； ¨ 0.01M PBST漂洗，5min×3； ¨ 510%正常山羊血清(0.01M PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min (濕盒內(nèi)) ； ¨ 傾去血清勿洗，加1BSA(PBST配制)稀釋的一抗， 37°C孵育60min 或4°C過夜(濕盒內(nèi))； (2) 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù)) ¨ 0.01M PBST漂洗，5min×3； ¨ 加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或3730min ； ¨ 加0.01H2O20.05DAB顯色 (顯色液應(yīng)新鮮配置)； ¨ 經(jīng)PBS漂洗3

16、次后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，明膠甘油封片，顯微鏡觀察。 (2) 非標(biāo)記抗體酶法酶橋法 ¨ 首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體； ¨ 以二抗作橋，將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上； ¨ 再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)顯色顯示抗原的分布 優(yōu)點：任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。避免了共價連接對抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏感性，而且節(jié)省一抗的用量。但抗酶抗體不易純化。 幾點說明 ¨ 一抗(假設(shè)來自種屬A)的稀釋度可大些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結(jié)合。 ¨ 二抗橋抗體(抗種屬A的IgG抗體)應(yīng)過量，使其Fab段一

17、個與一抗結(jié)合，另一個則游離。 ¨ 因抗酶抗體與一抗均系種屬A IgG，具有相同的抗原性，所以橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結(jié)合，起橋作用，將其連接在與組織抗原結(jié)合的一抗上。 (2) 非標(biāo)記抗體酶法PAP法 ¨ 與酶橋法相似，不同的是，PAP法將酶橋法的第3、4步并為1步，用PAP復(fù)合物代替; ¨ PAP是離體制備的復(fù)合物(HRP-抗HRP)。 ¨ 顯色與酶橋法相同，PAP復(fù)合物中的過氧化物酶催化底物水解，形成不溶性終產(chǎn)物。 PAP法評價 ¨ PAP法比直接法、間接法、酶橋法更敏感。特別適用于石蠟切片中微量抗原和抗原性減弱抗原的檢測。 缺點：步驟

18、較多，時間較長，不適用于臨床常規(guī)檢查。 ¨ 由于常做石蠟切片，故可用于回顧性研究。 (三) 親和組織化學(xué)法 ¨ 是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)。 ¨ 這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位。 生物素抗生物素染色法 【原理】 ¨ 生物素(biotin)又稱維生素H，是一種小分子維生素，分子量為244，是轉(zhuǎn)氨甲酰基化過程中的輔酶。 ¨ 抗生物素(avidin)，又稱卵白素或親和素，是一種分子量為67000的堿性蛋白，對生物素具有很強的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬倍。它由4個亞基組成，每個亞基

19、都有生物素的結(jié)合位點。 ¨ 兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種示蹤物所標(biāo)記，形成生物素-抗生物素系統(tǒng)。 該系統(tǒng)一端偶聯(lián)大分子生物反應(yīng)體系，另一端連結(jié)標(biāo)記物，后者加入酶的底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 (1)標(biāo)記抗生物素生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分為直接法和間接法。 ¨ 直接法 用生物素標(biāo)記第一抗體，與抗原結(jié)合；酶標(biāo)記抗生物素，與生物素結(jié)合，然后進行酶呈色反應(yīng)。 ¨ 間接法 用生物素標(biāo)記二抗，酶標(biāo)記抗生物素，先用第一抗體與組織抗原結(jié)合，再將第二抗體與第一抗體相連結(jié)，最后進行呈色反應(yīng)。 (2)橋抗生

20、物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB) 此法是用生物素分別標(biāo)記抗體和酶，以抗生物素為橋，把二者連接起來，進行呈色反應(yīng)。 (3) 抗生物素-生物素-過氧化物酶法 (ABC法) ¨ ABC法是在BRAB和LAB的基礎(chǔ)上改良的方法。 ¨ ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將其與過量的抗生物素反應(yīng)而制備的。 ¨ 分為直接法和間接法。 直接法是生物素標(biāo)記的一抗與ABC復(fù)合物結(jié)合； 間接法是生物素標(biāo)記的二抗與ABC復(fù)合物結(jié)合。 ABC法的評價 ¨ 敏感性強：ABC法比PAP法敏感性高2040倍。 ¨ 特

21、異性強，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀釋至可能的濃度，減少了非特異染色。 ¨ 方法簡便，節(jié)約時間。可由PAP法所需的2天縮短至幾個小時。 ¨ 由于生物素與抗生物素具有與多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫。免疫組織化學(xué)又稱免疫細胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。免疫組織化學(xué)的方法有多種，其實都大同小異，不同點只是在于顯色基團！ SP法1）脫蠟、水化；2）PBS洗23次各5分鐘；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗2

22、3次各5分鐘；5）抗原修復(fù)；6）PBS洗23次各5分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加抗50l，室溫靜置1小時或者4過夜或者371小時。9）4過夜后需在37復(fù)溫45分鐘。10）PBS洗3次各5分鐘；11）滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分鐘；14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15）PBS或自來水沖洗10分鐘；16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；17）自來水沖洗1015分鐘；18）脫水、透明、封片、鏡檢。SABC法1）脫蠟、水化。2）PBS洗兩次各5分鐘。3）用

23、蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉510分鐘，蒸餾水洗3次。4）抗原修復(fù)。5）PBS洗5分鐘。6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。7）滴加抗，室溫1小時或者4過夜或者371小時（4過夜后在37復(fù)溫45分鐘）。8）PBS洗三次每次2分鐘。9）滴加生物素化二抗，203720分鐘。10）PBC洗3次每次2分鐘。11）滴加試劑SABC，203720分鐘。12）PBS洗4次每次5分鐘。13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。15）脫水、透明、封片、鏡檢。二者區(qū)別：sp法是：一抗生物素化二抗HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素（HRP標(biāo)記的親和素）酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelled avidin-biotin technique，簡稱LAB法）