動物病毒滅活驗證報告

1、-病毒滅活驗證報告文件編號： 編 制： 審 核： 批 準： 日 期： 目 錄1、 目的：確認病毒滅活參數的有效性。2、 范圍：-原料。3、 驗證依據：血液制品去除滅活病毒技術方法及驗證指導原則4、 驗證項目：在工藝過程中病毒滴定 驗證結果：病毒檢驗5、 驗證結論：病毒滅活參數有效。 1. 目的：所有用于醫(yī)療器械生產的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，為驗證“-”的生物原材料-種豬細小病毒、偽狂犬病毒病毒的感染情況，特進行下述實驗。驗證確保生物原材料的安全性。驗證依據：血液制品去除滅活病毒技術方法及驗證指導原則2、范圍： 適用于本公司-產品。3.職責：3.1技術部負責對病毒滅活驗證的組織與

2、實施。3.2檢測中心負責產品的驗收及計量、檢驗器具的檢定。3.3生產部負責協助驗證工作的實施。3.4質量部負責驗證檔案的存檔。3. 5驗證小組成員：3.5.1人員姓名部門職責管理者代表批準方案、批準報告；技術部長負責制定驗證方案和形成報告；生產部長負責試驗樣品的準備；質量部長負責計量器具的確認；負責對產品性能進行評價，并提供檢測報告；3.5.2時間安排 2014年9月10日開始4程序：4.1“-”生物原材料-的病毒污染驗證文獻綜述根據現有的研究結果，豬的病毒包括豬細小病毒、偽狂犬病毒、豬瘟、圓環(huán)病毒、口蹄疫、水泡、乙腦等病毒，其中豬細小病毒、偽狂犬病毒可感染人類。以下按豬源性病毒的來源、種類及

3、分布；理化特性；檢測方法的次序對各病分述如下：附表1 豬源性病毒的特征病毒名稱病毒的分類核酸類型囊膜病毒顆粒大?。╪m）豬細小病毒B19DNA無20偽狂犬病毒HBVDNA有45附表2 豬源性病毒的理化性質病毒名稱溫度耐受性化學物質敏感性豬細小病毒可耐70能抵抗脂溶劑、酸、甲醛蒸汽和紫外線，對漂白粉或氫氧化鈉敏感，具有良好的血凝活性。偽狂犬病毒在37下的半衰期為7h，8可存活46天，而在25干草、樹枝、食物上可存活1030天。病毒在pH49之間保持穩(wěn)定。5石炭酸經2min滅活，但0.5石炭酸處理32天后仍具有感染性。對乙醚、氯仿等脂溶劑以及福爾馬林和紫外線照射敏感。附表3 豬源性病毒的檢測方法病

4、毒名稱血清抗體檢測方法病毒抗原檢測組織樣品方法豬細小病毒血凝抑制新鮮臟器間接免疫熒光技術偽狂犬病毒中和試驗患病動物的病料如腦或扁桃體的壓片或冰凍切片直接免疫熒光技術參考文獻1、豬細小病毒病及其防制丁壯 畜禽流行病防治叢書 金盾出版社2、冼瓊珍;黃良宗;彭啟明;王淑敏;顧萬軍;豬偽狂犬病毒和豬細小病毒二聯PCR診斷方法的建立A;中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（上）C;2003年3、周泰沖;豬偽狂犬病毒對人的感染性問題(綜述)J;獸醫(yī)藥品通訊;1986年03期4.2試驗材料試驗指示病毒為水皰性口炎病毒、 偽狂犬病毒、 脊髓灰質炎病毒和豬細小病毒。培養(yǎng)病毒用

5、細胞株為 V e r o 和 p k - 15細胞 ( 由中國藥品生物制品檢定所引入 ) , 培養(yǎng)液為含 10% 胎牛血清的 M E M 。實驗用膠原貼敷料樣品共 3 批次 , 為有效期內產品 ; 抗熒光抗體購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 。4.3試驗方法：4.3.1細胞毒性測定，用 2 m o l / L 氫氧化鈉溶液把酸性液態(tài)膠原 p H 調至中性 , 將 p H 3 . 0 的酸性溶液和中性溶液進行倍比稀釋后加入到細胞中 , 用M T T 染色法測定其對細胞的毒性作用 。4.3.2酸性酶解溶液滅活病毒工藝 取定量的酸性液態(tài)膠原 , 按 9 1 的比例分別加入 P R V 、 V S V 、P V

6、 1和 P P V 指 示 病 毒 , 混 勻 后 立 即 取 部 分 樣 品 用 2m o l / L 氫氧化鈉溶液進行中和 , 根據細胞毒性測定結果選擇樣品稀釋度作為病毒滅活的起始病毒滴度 。其余樣品分別于 0 . 5、 2、 6、 24、 48、 7 2 h 取樣測病毒殘留滴度 , 計算病毒滅活對數值 ( L g T C I D 50 / m l ) 。4.3.360C o - 射線輻照滅活病毒工藝 取定量的液態(tài)膠原蛋白 , 按 9: 1 的比例分別加入 P R V 、 V S V 、P V 1 和 P P V 指示病毒 , 混勻后先取出部分樣品作為液體對照 , 并測定起始病毒滴度 。

7、剩余樣品分裝成5 m l / 瓶進行冷凍干燥 , 取出 2 瓶凍干品作為對照 。將冷凍干燥的瓶裝膠原蛋白經 10-15 k G y 劑量 的電子束射線輻照滅活病毒處理 ( 紹興華能電子加速器有限公司) 。 輻照后的樣品溶解后測病毒殘留滴度 , 對照樣品則根據細胞毒性測定結果選擇樣品稀釋度作為病毒滅活的起始病毒滴度 , 計算病毒滅活對數值 。4.3.4 存活病毒滴度測定 采用微量細胞病變法 。試驗樣品經 1 0倍系列稀釋后加入已接種細胞的 96孔培養(yǎng)板中 , 每個稀釋度做 8 孔重復 。將培養(yǎng)板置37 二氧化碳孵箱內培養(yǎng) 72 h ( 接種 P P V 的 P K-15 培 養(yǎng) 1 20 h )

8、 , 在 光 鏡 下 觀 察 細 胞 病 變 效 應( C P E ) , 根據 K a r b e r 氏法計算病毒滴度。4.3.5 免疫熒光染色法檢測 P P V 將 P P V 接種于P K- 15 細胞中 , 培養(yǎng) 120 h 后 , 用抗 P P V 熒光抗體對細胞進行直接免疫熒光抗體試驗, 按照抗體說明書要求進行操作 。4.3.6 細胞盲傳 病毒滅活后的樣品均以高濃度加入細胞中做細胞盲傳 3 代培養(yǎng) , 觀察是否出現細胞病變 。 在細胞盲傳 3 代的全過程中 , 任何時段出現細胞病變均視為陽性 ( + ) , 說明病毒未被完全滅活 ; 未出現細胞病變視為陰性 ( - ) , 說明樣

9、品中病毒已被完全滅活 。4、4 效果的判定    判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來確定。在確定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評價每次驗證結果。4.4.1驗證試驗所選擇的病毒是否適宜，病毒驗證的設計是否合理。4.4.2病毒降低量（log10）4 logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測方法造成病毒降低量4 logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，可認定是有效的滅活病毒方法。 4.4.3病毒滅活動力學可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡單的一級反應。往往是起始反應速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時間明顯

10、降低，表示該方法可能無效，或者殘留的指示病毒對該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。 4.4.4病毒實際滴度為基礎病毒，指示病毒與樣品1:9的比例混勻后零點取樣的病毒滴度，通過與經去除/滅活病毒后的測定的實際病毒殘留量的比較，作為該病毒去除/滅活方法（步驟）實際的滅活病毒的量。5. 驗證要求5.1 達到病毒滅活的有效性。 5.2得出病毒滅活速率和滅活曲線。5.3確定預定去除/滅活病毒效果的參數及允許變化的幅度。5.4確定指示病毒滴度。5.5加入的病毒與待驗證樣品體積比不高于19。5.6驗證過程中每步取出的樣品直接進行病毒滴定。6.工藝參數的確定6.1對確定的參數進行試模。6.

11、2確認的工藝參數及相關文件由技術部匯總存檔。7.記錄7.1記錄歸檔質量管理部。 病毒滅活驗證最終報告1、目的：所有用于醫(yī)療器械生產的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，為驗證“-”的生物原材料-種豬細小病毒、偽狂犬病毒病毒的感染情況，特進行下述實驗。驗證確保生物原材料的安全性。驗證依據：血液制品去除滅活病毒技術方法及驗證指導原則2、范圍： 適用于本公司-產品。3、 試驗結果如下：3.1 酸性酶解溶液工藝滅活效果接種在膠原蛋白中病毒經酸性酶解溶液處理 2h 以上 , 連續(xù) 3 次重復試驗結果表明 , 對 V S V 、P R V 、P V I 和 P P V 的滅活對數值分別為 5. 54、 5. 7 1、 6 . 30和 5 . 13 ( 表 1 ) 。 處理后的樣品經細胞盲傳 3 代培養(yǎng) , 均未出現細胞病變 。 結果顯示 , 酸性酶解溶液對膠原蛋白中的病毒具有良好的滅活效果。3.2 6 0C o - 射線滅活效果經照射劑量為 12.3 k G y 的60C o - 射線輻照滅活工 藝處 理 結 果表 明 , 接 種在 膠 原 蛋白 海 綿 中的V S V 、 P R V