綜設(shè)實(shí)驗(yàn)以α-胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機(jī)溶劑中合成N-保護(hù)的亮-腦啡肽三肽片段

1、北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：以-胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機(jī)溶劑中合成N-保護(hù)的亮-腦啡肽三肽片段實(shí)驗(yàn)時(shí)間：_ 2015.9.23 2015.10.28 _實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)： 基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室 專業(yè)年級(jí)：_ _2013級(jí)2班 學(xué)生姓名：_張鈺 _ 學(xué) 號(hào)：_201311151046 _ 指導(dǎo)老師： _邢國(guó)文_ _ 以-胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機(jī)溶劑中合成N-保護(hù)的亮-腦啡肽三肽片段張鈺北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院摘要：推薦一個(gè)面向理科高年級(jí)本科的化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)。以二氯甲烷為溶劑，使用-胰凝乳蛋白酶為催化劑合成N-保護(hù)的亮-腦啡肽三肽片段。關(guān)鍵詞：綜合實(shí)驗(yàn) 化學(xué)生物學(xué) 酶

2、促合成 亮-腦啡肽 -胰凝乳蛋白酶1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 在做實(shí)驗(yàn)的同時(shí)開闊視野，了解一些近年來(lái)學(xué)科交叉研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)；2、 熟悉一些化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本實(shí)驗(yàn)方法與技巧，為今后的進(jìn)一步科研深造奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；3、通過(guò)本課程的訓(xùn)練，有效的提高獨(dú)立科研能力和科研創(chuàng)新能力；4、通過(guò)四步反應(yīng)（獨(dú)立完成三步）合成 N-保護(hù)的亮-腦啡肽三肽片段；2、 實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以酪氨酸（Tyr）、雙甘肽（Gly-Gly）為起始原料，經(jīng)過(guò)四步反應(yīng)得到了N-保護(hù)的亮-腦啡肽前三肽Z-Tyr-Gly-Gly-OEt。1、酪氨酸在氯化亞砜的作用下酯化，得到酪氨酸乙酯鹽酸鹽（HCl·Tyr-OEt）；2、酪氨酸乙

3、酯與芐氧羰酰氯（Z-Cl）在堿性條件下反應(yīng)，得到芐氧羰酰酪氨酸乙酯（Z-Tyr-OEt）；3、Gly-Gly在氯化亞砜作用下酯化，得到甘胺酰甘氨酸乙酯鹽酸鹽（HCl·Gly-GLy-OEt）；4、Z-Tyr-OEt與Gly-GLy-OEt在二氯甲烷中以-胰乳蛋白酶催化得到亮-腦啡肽的前三肽，即N-保護(hù)的芐氧羰酰酪氨酰甘 胺酰甘氨酸乙酯（Z-Tyr-Gly-GLy-OEt）。3、 實(shí)驗(yàn)藥品藥品名形狀分子量nDdmp/°Cbp/°C溶解性水乙醇乙醚乙醇無(wú)色液體461.36140.79-117.378.5易溶易溶易溶氯化亞砜淡黃色發(fā)煙液體118.961.64-10578

4、.8分解易溶易溶Gly-Gly白色葉狀結(jié)晶或片狀晶體，有光澤132.12262溶難不Tyr白色結(jié)晶粉末181.201.456342難不不乙醚無(wú)色透明液體74.121.350.7134-116.334.6微溶溶HCl-Tyr-OEt白色結(jié)晶245.7溶溶溶HCl·Gly-GLy-OEt白色結(jié)晶196.6溶溶溶乙酸乙酯無(wú)色液體88.111.37190.902-83.677.2溶溶溶碳酸氫鉀白色晶體100.12溶不不苯甲醇無(wú)色液體108.131.53961.0419-15.3205.7溶易易芐氧羰酰氯無(wú)色有刺激性氣味的液體170.5分解溶溶硫酸鎂白色粉末1202.66112.4溶微不石油醚

5、無(wú)色透明液體0.640.664080不溶溶Z-Tyr-OEt白色晶體343Z-Tyr-Gly-Gly-OEt白色晶體449.1三乙胺無(wú)色油狀液體，有強(qiáng)烈氨臭101.191.40100.726-114.889.5微溶溶丙酮無(wú)色液體58.080.78451.3588-94.756.05溶溶溶4、 實(shí)驗(yàn)步驟（1）、HCl·Gly-Gly-OEt的合成、取8Ml無(wú)水乙醇，用冰鹽浴冷至-10，緩慢加入2Ml氯化亞砜，加完后繼續(xù)攪拌20min。、加入Gly-Gly 1.0g，先初步搖勻，放入磁子，用磁力攪拌器室溫?cái)嚢?天。、用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑得到白色固體。、用乙醇-乙醚重結(jié)晶：先用3mL乙

6、醇微熱，將固體溶解；在逐步加入乙醚，剛開始一段時(shí)間沒(méi)有晶體析出，用玻璃棒摩擦瓶壁，很快析出大量白色結(jié)晶。、抽濾。烘干并稱重，記錄質(zhì)量m1=1.16g。（2）、Z-Tyr-OEt的合成：、將HCl·Tyr-OEt 0.8g懸浮于16mL乙酸乙酯中，加入KHCO32g的13mL水溶液，冰浴下快速攪拌，15min內(nèi)滴加Z-Cl的苯甲醇溶液0.7Ml。、加完后攪拌20min，撤去冰浴，室溫再攪拌2-3h。、反應(yīng)結(jié)束后用4mol/L的鹽酸酸化，使水相的pH為1，分出有機(jī)相，用水、飽和食鹽水洗滌，硫酸鎂干燥。、減壓蒸除溶劑后，得到黃色油狀物，置于冰水中，緩慢結(jié)晶，過(guò)濾得第一批晶體；在母液中加入緩

7、慢加入石油醚再結(jié)晶得第二批晶體，共得產(chǎn)物稱重，記錄質(zhì)量m2=0.64g。（3）、以-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt。、取0.425gZ-Tyr-OEt與HCl·Gly-GLy-OEt0.25g懸浮于12.5mL二氯甲烷中，加入三乙胺350uL并在攪拌使底物完全溶解；、調(diào)節(jié)pH值約為10，反應(yīng)液為均一透明溶液；、加入-胰凝乳蛋白酶5mg和用注射器加入50uL水。室溫下攪拌反應(yīng)1-2天，反應(yīng)液中有白色沉淀產(chǎn)生。、反應(yīng)3天后，測(cè)反應(yīng)后體系的pH，將反應(yīng)液過(guò)濾，濾餅依次用二氯甲烷、1mol/L鹽酸、去離子水洗滌。在紅外燈下烘干產(chǎn)物，稱重記錄質(zhì)量m3=0.2g。5、 實(shí)驗(yàn)數(shù)

8、據(jù)記錄和處理（1）HCl·Gly-Gly-OEt的產(chǎn)率：m1=1.16gM理論= 1.2g w=m1/ M理論×100%=96.7%;（2）Z-Tyr-OEt的產(chǎn)率：m2=0.64gM理論=0.8gw=m/ M理論×100%=80%,產(chǎn)物顏色偏黃，可能有副產(chǎn)物生成，或者是洗滌不夠充分，所以測(cè)量產(chǎn)率偏高（3）Z-Tyr-Gly-Gly-OEt的產(chǎn)率：m3=0.2gM理論=0.625gw=m/ M理論×100%=32%產(chǎn)率低，并且產(chǎn)物不能溶于丙酮?？赡芩卯a(chǎn)物不是目標(biāo)產(chǎn)物，而是副產(chǎn)物或者是反應(yīng)物。原因分析：、反應(yīng)物為上一次實(shí)驗(yàn)所得的產(chǎn)物，可能含有雜質(zhì)，影響到

9、此次的實(shí)驗(yàn)；、操作過(guò)程中，水的滴加速度過(guò)快，且沒(méi)有控制好用量，加得過(guò)多，而水的含量過(guò)多會(huì)使酶的活性降低；6、 實(shí)驗(yàn)思考與討論1、 冰鹽浴：冰鹽浴的降溫原理與溶液的凝固點(diǎn)下降有關(guān)。當(dāng)食鹽和冰均勻地混合在一起時(shí)，冰因吸收環(huán)境熱量稍有融化變成水，食鹽遇水而溶解，使表面水形成了濃鹽溶液。由于濃鹽溶液的冰點(diǎn)較純水低，而此時(shí)體系中為濃鹽溶液和冰共存，因此體系的溫度必須下降才能維持這一共存狀態(tài)（濃鹽溶液和冰的共存溫度應(yīng)該比純水的冰點(diǎn)更低）。這將導(dǎo)致更多的冰融化變成水來(lái)稀釋濃鹽溶液，在融化過(guò)程中因大量吸熱而使體系溫度降低。一般能降到-20。2、氯化亞砜：遇水遇熱易分解：SOCl2+2H2O=H20+SO2+2

10、HCl在HCl·Gly-GLy-OEt、HCl·Tyr-OEt合成中的作用：A. 作為氯化劑；B. 使成酯反應(yīng)更易進(jìn)行，與一般酯化不同的是，在氯化亞砜的作用下，酯基中的兩個(gè)氧原子都來(lái)自于羧基。3、 雙溶劑重結(jié)晶的適用條件及操作混合溶劑重結(jié)晶：原理：某種有機(jī)物在某溶劑中溶解度很好時(shí)，先用最少量的該溶劑加熱溶解，再加入溶解度稍差的另一種溶劑，降低該有機(jī)物的溶解度，然后降溫析出晶體?；旌先軇┲亟Y(jié)晶步驟：、按照選擇溶劑的方法，試出混合溶劑各自量的比例、將被重結(jié)晶物質(zhì)加熱溶解于適量的易溶溶劑中、趁熱過(guò)濾，以除去不溶性雜質(zhì)、用滴管逐滴加入熱的不易溶的溶劑，直至出現(xiàn)渾濁，且不再消失為止、

11、再加熱使其澄清，若不澄清，可再加較少量的易溶溶劑，使其剛好澄清、將此熱溶液在室溫下放置，冷卻析出晶體本實(shí)驗(yàn)中C2、C3、C5提純均用到雙溶劑法（又稱反溶劑法）重結(jié)晶，即先將待提純物質(zhì)溶于少量良溶劑（產(chǎn)品在溶劑中溶解性很好），可適當(dāng)加熱，并及時(shí)濾去不溶性雜質(zhì)，確保溶液澄清透明。然后將大量不良溶劑（產(chǎn)品溶解性較差）注入到溶液中等待結(jié)晶。注意事項(xiàng)：若局部結(jié)晶過(guò)快導(dǎo)致晶型不佳，可沿瓶壁緩慢滴入，且勿震蕩過(guò)猛；：若晶體不敏感，則注入適量不良溶劑再震蕩即可，也可以加晶種誘導(dǎo)結(jié)晶。：注意良溶劑與不良溶劑需互溶。4、影響有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)的因素：酶在各種有機(jī)溶劑體系中表現(xiàn)出來(lái)的催化性質(zhì)(包括酶的活性、穩(wěn)定性及專一性)相差甚遠(yuǎn),主要取決于反應(yīng)體系中水的含量和所選用的溶劑。（1）、溶劑的影響：溶劑對(duì)酶的影響體現(xiàn)在其對(duì)酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子柔性以及活性中心的作用。-胰凝乳