Western blot詳細操作過程

1、Western BlotWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素?。∟C）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。流程：蛋白樣品的提取蛋白樣品定量與變性PAGE凝膠電泳轉膜麗春紅染色封閉抗體孵育底物顯色。實

2、驗器材和試劑：一 蛋白提取試劑1.10% SDS裂解液：稱取10g SDS粉末加入雙蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室溫保存。2.RIPA裂解液1ml裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM)0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml)試劑盒RIPA5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml) 0.9848ml 裂解液0.5ml裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM)0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml)2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)

3、 0.4924ml 裂解液PMSF必須搖勻至無結晶時才可與裂解液混合3蛋白酶抑制劑：100mmol/L PMSF：17.4mg PMSF粉末溶于1ml異丙醇(AR)，分裝250ul每管后20保存。使用終濃度為1 mmol/L?！綪MSF：在溶液中不穩(wěn)定，應在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂解液中。PMSF劇毒，嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收后有致命危險一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄?！慷?蛋白定量試劑：1. BCA蛋白定量試劑盒2. 10ml 0.9%的生理鹽水（90mg NaCl溶于10ml去離子水中）三 上樣用試劑：6&

4、#215;SDS上樣緩沖液：取一個離心管，秤取2.0g SDS粉末，6mg溴酚藍(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用槍頭加入5mL 1.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)，用移液管加入10mL Glycerol(甘油，丙三醇)，槍頭加入2mL -mercapteethanol（-巰基乙醇）充分混勻，加雙蒸水定容至20ml，渦旋溶解。4避光保存。四 電泳工作液：1. 1.5mol/L Tris-HCl緩沖液：（三（羥甲基）氨基甲烷）稱取18.171g Tris粉末，加入60mL 雙蒸水中，加鹽酸調節(jié)pH至6.8或8.8，定容至100mL。4保存?？芍掳?/p>

5、不要直接接觸皮膚。2. 1.0mol/L Tris-HCl緩沖液：稱取12.114g Tris粉末，加入60mL 雙蒸水中，加鹽酸調節(jié)pH至6.8或8.8，定容至100mL。4保存?？芍掳?，不要直接接觸皮膚。3. 0.5mol/L Tris-HCl緩沖液：稱取6.057g Tris粉末，加入60mL 雙蒸水中，加鹽酸調節(jié)pH至6.8或8.8，定容至100mL。4保存?？芍掳?，不要直接接觸皮膚。4.10% APS：(一周內使用，最好新鮮配置)稱取0.5g APS粉末，加入雙蒸水至5 mL，充分溶解，4保存。5.10% SDS:秤取10g SDS粉末溶于100ml雙蒸水中，可50水浴下溶解，室溫保

6、存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用5.分離膠（下層膠）：分離膠5%7.5%10%12%15%30% acrylamide/bis1.68ml2.5ml3.35ml4.02ml5ml1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml10% SDS100ul100ul100ul100ul100ulDdH2O5.474.65ml3.8ml3.13ml2.15ml10%APS（灌膠時再加）50L50L50L50L50LTEMED（灌膠時再加）5ul5ul5ul5ul5ul分離蛋白分子量57-212KD36-94KD20-80KD12-6

7、0KD10-43KD混勻后在室溫下靜置15min，然后加入5ul TEMED即為分離膠，即可灌膠。6. 4%濃縮膠（上層膠）：0.7mL 30% Acr/Bis；1.5mL 0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)；60L 10% SDS；3.6mL雙蒸水混勻后加入50L 10% APS和5L TEMED（灌膠時再加）。7.1×電泳液緩沖液（使用液）（PH=8.3）：3.04 g Tris粉末，14.4g甘氨酸（Glycine）粉末，1g SDS粉末溶于800ml雙蒸水中，調PH=8.3，用ddH2O定容至1000ml，室溫保存?？芍貜褪褂?-5次。10×電泳液

8、緩沖液（儲存液）（PH=8.3）：30.4 g Tris粉末，144g甘氨酸（Glycine）粉末，10g SDS粉末溶于800ml雙蒸水中，調PH=8.3（濃HCl調），用ddH2O定容至1000ml，室溫保存。五 轉膜工作液：1×轉膜液緩沖液（使用液）（PH=8.3）：3.0 g Tris粉末，14.1g甘氨酸（Glycine）粉末，1.25g SDS粉末溶于800ml雙蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室溫保存，使用時再加250mL甲醇(AR)可重復使用3-5次。10×轉膜液緩沖液（儲存液）（PH=8.3）：30.0 g Tris粉末，141g甘氨酸（Gl

9、ycine）粉末，12.5g SDS粉末溶于800ml雙蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室溫保存。使用時稀釋10倍，加入20%甲醇?？扇?0×溶液100ml, ddH2O 900ml，甲醇250ml。（重復利用再重新加入甲醇50ml）六 封閉液1g脫脂奶粉于20mL 1X TBST混勻,4保存。保存時間不能太久，有味道就不能用了。七 抗體孵育用液1X TBST緩沖液（使用液）：24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml雙蒸水中，用ddH2O定容至1000ml調節(jié)pH至7.4。室溫保存。10X TBST緩沖液（儲存液）：

10、24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml雙蒸水中，用ddH2O定容至1000ml調節(jié)pH至7.4。室溫保存。八 麗春紅染液（可回收利用）九 顯影液Western Lightning ECL Pro十 STRIP膜再生試劑 100ml 5ml 8ml 12ml 14ml10% SDS 20ml 1ml 1.6ml 2.4ml 2.8ml0.5M Tris HCl （pH6.8） 12.5ml 0.625ml 1ml 1.5ml 1.75mlddH20 67.5ml 3.375ml 5.4ml 8.1ml 9.45ml- mercaptoeth

11、anol 0.8ml 40ul 64ul 96ul 112ul操作步驟： （一） 蛋白樣品制備 （1）待測蛋白細胞收集 1.準備冰盒，提前準備好需要的試劑和器材，EP管：標記好相關信息（細胞名稱，蛋白提取，轉染信息，時間）；離心管，滴管，含血清的培養(yǎng)液，胰蛋白酶，PBS。4離心機提前預冷； 2.棄掉皿內的無血清培養(yǎng)液（含血清的培養(yǎng)液，可直接收到相應的離心管），用1.0ml的PBS清洗，將PBS收到相應的離心管內，再用1.0ml的PBS清洗，收集PBS，每皿加1ml的胰蛋白酶進行消化，37，5min。3.消化后將皿放在冰盒上，冰上操作。用培養(yǎng)液（可以用離心管內帶血清的培養(yǎng)液）吹打細胞，收入離心管

12、（可再沖洗一次，沖洗干凈），將離心管配平后放1500r/5min離心。4.取出離心管，吸掉上清（注意不要碰到蛋白固體），管底留少量液體，用手彈離心管底部，震蕩離心管，加入1ml的PBS吹打幾次后移入相應的EP管，在離心管再加入0.5ml的PBS清洗加入EP管。EP管配平后4，1500r/5min。5.取出EP管，輕輕吸掉上清，留少許液體在底部，彈幾下EP管進行震蕩，加入1.5ml的PBS渦旋3-5次，配平后4，1500r/5min。6.取出EP管，輕輕吸掉上清，留少許液體在底部，配平狀態(tài)在4離心機進行離心，轉速為最高轉速14800轉，達到此速度立刻停止，取出EP管，小心吸掉所有的液體。7.將E

13、P管放在-80冰箱內保存。（2）細胞總蛋白的提?。?1.準備相應的試劑和器材，按照配方配置裂解液和 PMSF溶液，4離心機提前開機預冷，準備冰盒。2.取出收集好的蛋白樣品置于冰上。3 按照配方配置裂解工作液，（根據(jù)試劑盒實際要求）搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合），取40-50ul（細胞多用50ul）裂解工作液加入細胞EP管中，吹打均勻，渦旋幾次，冰上裂解30min,（裂解期間每10min渦旋一次），裂解完成后再渦旋一次然后轉移至4離心機14800r/20min（提前開離心機預冷）。取出離心后的EP管吸取上清，置于新的EP管中。4. 將輕微離心后的上清可分裝后放于20保

14、存。（二） 蛋白含量的測定 1. 配置10ml 0.9%的生理鹽水（90mg NaCl溶于10ml去離子水中），用于配置相應的BSA梯度溶液。2. 將標準樣品和蛋白樣品按下表稀釋和加樣檢測范圍=(20-2000ug/ml)瓶號ABCDEFGH樣品BSA含量0ug1ug2.5ug5ug10ug20ug40ug50ug2mg/mlBSA-0.5ul1.25ul2.5ul5ul10ul20ul25ul1ul0.9%saline25ul24.5ul23.75ul22.5ul20ul15ul5ul-24ul工作液200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ul200ulB

15、SA終濃度(ug/ml)04010020040080016002000工作液最后加 ，加工作業(yè)速度要快，且在冰上操作。樣品：工作液=1：8（25ul:200ul）3. BCA A:BCA B=50:1,每孔需要200ul工作液。根據(jù)需要的數(shù)量配置工作液，所需工作液的總體積為：(標準品的個數(shù) + 待測蛋白質樣品的個數(shù))×( 實驗重復次數(shù))×(用于每個樣品的工作液的體積) =所需的工作液（當試劑 B 加入到試劑 A 中時，開始可觀察到有渾濁產(chǎn)生，經(jīng)攪拌后渾濁會迅速消失，得到綠色澄清工作液。工作液儲存于密閉容器中，在室溫下可穩(wěn)定保存數(shù)天）注：如果樣品有限，則可取標準品和待測未知樣

16、品10ul（樣品與工作液的比例為1:20）。然而，在這種情況下，定量分析的檢測范圍將被限制在125-2000g/mL。A B C D E F G H I待測蛋白標準蛋白樣品4. 將微孔板密封，在 37恒溫箱30轉中孵育30分鐘。（孵育時蓋報紙避光）5. 將微孔板冷卻到室溫。使用微孔板讀數(shù)儀，測量樣品在 562nm 或該波長附近的吸光值。打開酶標儀“Gen5 CHS 2.04”圖標新建記錄檢測，吸收光波長562打開96孔板蓋子放入機器開始檢測，將結果復制到Excel中拷貝。· 該方法在波長 540-590nm 范圍內均可成功得到結果。由于微孔板酶標儀的光路長度比使用比色皿的分光光度計短

17、，因此微孔板方案要求樣品與工作液的比例更高，才能獲得與試管標準方案相同的靈敏度。如果想要得到較高的562nm 處的吸光值，則需將孵育時間增加到2 小時。延長孵育時間或升高溫度將會增加樣品在562nm 處的吸光值，也會降低試劑的最低檢測下限和該方案的檢測范圍。6. 將各個標準品和待測蛋白質樣品在 562nm 處的吸光值根據(jù)公式計算出相應的蛋白濃度。2016/3/9全蛋白No.Sample nameODOD0ODOD0Test volume (l)protein concentration (g/l)Sample volume (l)protein (g)Adding sample volume(

18、l/20g蛋白)Sample1A549-Ctrl-24h0.6950.3470.34816.90 40499.07 2.90 Sample2A549-NT siRNA-24h0.6390.3470.29215.76 40272.44 3.47 Sample3A549-NEK2 siRNA-24h0.7090.3470.36217.18 40289.56 2.78 Sample4A549-NEK2 siRNA-24h0.6760.3470.32916.51 40386.32 3.07 Sample5A549-Ctrl-48h0.5910.3470.24414.79 50411.31 4.17 S

19、ample6A549-NT siRNA-48h0.5360.3470.18913.70 50430.08 5.41 Sample7A549-NEK2 siRNA-48h0.5740.3470.22714.45 50354.13 4.49 Sample8A549-NEK2 siRNA-48h0.5860.3470.23914.69 50263.45 4.26 （三）蛋白變性按下表進行配置：（上樣緩沖液應新鮮配置）NO.A549-Ctrl-24hA549-NT siRNA-24hA549-NEK2 siRNA-24hA549-NEK2 siRNA-24hA549-Ctrl-48hA549-NT s

20、iRNA-48hA549-NEK2 siRNA-48hA549-NEK2 siRNA-48h樣品用量（ul）2.903.472.783.074.175.414.494.26ddH20(ul)12.1011.5312.2211.9310.839.5910.5110.74Loadingbuffer(ul)33333333樣品終含量（ug）2020202020202020總體積（ul）18181818181818配置過程在冰上操作漩渦震蕩后70水浴10min，可以-20保存?zhèn)溆谩＃ㄋ模?SDSPAGE電泳 （1） 清洗玻璃板：用水輕輕沖洗玻璃板，洗干凈后用干凈的紙或布擦干，然后將接觸膠的一面用酒精擦

21、洗，擦干后開始裝配。玻璃板的下緣必須對齊。若不繼續(xù)使用，需用乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，梳子應用水洗干凈，臨用前用乙醇擦拭晾干。（2） 灌膠與上樣 1、 玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準備灌膠。裝配好后，插入梳子，在最上邊的紅線下側一點點處（梳子插入的位置）用油筆做一條直線標記，分離膠加至此線。2、 配置分離膠，在燒杯里放入旋子（旋子在放燒杯的一層），低速轉動10-15min，然后加入50ul 10% APS和5ul TEMED后立即搖勻即可灌膠，燒杯口緊貼灌膠板，將分離膠灌入玻璃板夾層，待膠面升到畫的界限，停止灌膠。然后膠上加一層雙蒸水，平移均勻加入，加到滿，壓平分離膠，液封后

22、的膠凝的更快，等待30-40min，待凝固后，形成明顯的界限，倒出上層的雙蒸水，并用紙吸干剩余的雙蒸水。（操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加雙蒸水時要沿著玻璃板左右平移加，速度不能太快，否則膠會被沖變型。） 3、 在等待分離膠凝固的同時按前面方法配4的濃縮膠,配好后在凝固好的前10-15min，燒杯里加入旋子慢速旋轉10-15min，然后加入50ul 10% APS和5ul TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后選擇合適的梳子插入濃縮膠中，待凝固。（灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平）實驗提前5-8小時制作電泳膠/或過夜。（

23、一塊板可用2ml 1×TBST放在密封的袋中保存）4.在分離膠凝固的同時配置電泳緩沖液并進行蛋白變性處理。5、膠凝固后，取出PAGE膠板，用雙蒸水沖洗干凈，將膠水平放置，雙手從兩側同時緩慢抽出梳子，用雙蒸水輕輕沖洗膠孔，裝入電泳槽板上，上推膠板以避免漏液，裝入垂直槽固定架，將其放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，用槍頭插入膠孔輕輕吹打幾次，趕出孔內液體。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。） 6、 按照上樣順序將變性過的蛋白進行加樣，在樣品一側加入10ul Marker,對應電極蓋好蓋子。7、調整電壓為100-120進行電泳，90mi

24、n，隨時觀察，條帶到底即可停止進行轉膜。（五）轉膜1.電泳過程配置轉膜緩沖液2將裁剪掉右上角的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜泡入甲醇中（緩慢搖動）2min（硝酸纖維素（NC）膜不需要浸泡甲醛），用雙蒸水沖洗干凈，加入雙蒸水搖動2min。在反應盆內倒入的轉膜緩沖液，將海綿，濾紙和PVDF膜完全浸入緩沖液中，至少浸泡30min,需要浸泡的是兩塊濾紙，兩塊海綿，一塊PVDF/NC膜。3.將電泳完的凝膠玻璃板取出，用雙蒸水沖洗干凈，用塑料的鏟子緩慢撬開小玻璃板，然后用浸泡過緩沖液的一塊濾紙貼在膠上，反過來將玻璃板用長片撬下來，按照marker的標志切割目的蛋白所在區(qū)域的凝膠，將濃縮膠部分切除（大蛋白不需要

25、切除），將轉膜夾放在轉膜槽上，黑色在下，白色在上，在黑色板上鋪上海綿，用移液槍吸取10mL的緩沖液，緩慢沖洗3次（有泡沫的部分不要吐出），然后用滾子朝一個方向滾，趕出氣泡，重復三次，一共滾三次；然后將帶有膠的濾紙鋪上，滾三次，鋪上膜，滾三次，鋪上濾紙，滾三次，鋪上海綿，滾3次，將白色蓋板蓋上，卡扣位置朝上，插入電泳槽，黑色對黑色，紅色對紅色，倒?jié)M緩沖液，對應電極蓋上蓋子。將電流調制40-42V進行轉膜，轉膜90min/或30V 4度overnight。轉膜過程中配置1×TBST和封閉液。 4.轉膜完成后取出PVD/NCF膜(膜上蛋白marker清晰，膠上無明顯蛋白marker，表明轉

26、膜完全)，剪除無蛋白區(qū)域，在右上角剪去一角，已確認方向，將膜用雙蒸水清洗三次，浸泡進麗春紅染液中染色，置于搖床中速3min左右（麗春紅染液回收），用雙蒸水重復漂洗2-3次直至出現(xiàn)清，拍照記錄晰條帶，如條帶清晰整齊則表明之前的步驟成功。再用TBST清洗一次（不能直接沖著膜加液）。（六）封閉 1轉膜過程配置封閉液，在磁力攪拌器上一直攪拌溶解，溶解后4度保存?zhèn)溆谩?.將洗掉染液的PVDF膜取出放入盛有封閉液的方盒中，將膜完全浸潤，蓋好蓋子，在搖床上中速搖動1h。（七）抗體孵育1.取出封閉后的膜加入1×TBST 5ml左右搖晃幾下倒掉，倒入10ml（浸沒）TBST，搖床中速15min，再清洗

27、2次，每次5min。2.將稀釋后的一抗連同膜轉移到密封塑料袋內（或者孵育盒內），在室溫下轉動1-2小時，轉移至4冰箱中搖動過夜。3.將過夜后的膜從一抗中取出（一抗回收）加入10ml（浸沒）TBST，搖床中速15min，倒掉后再清洗2次，每次5min。4.將稀釋后的二抗倒入抗體孵育盒，將PVDF膜置于二抗中室溫緩慢搖動30min-1h。（二抗回收）加入10ml（浸沒）TBST，搖床中速5min，重復三次。 （清洗過的膜放在1×TBST，4保存）。（切帶后，一個空需要大約1.5ml二抗）（八）底物顯影 1.將Western Lightning ECL Pro化學發(fā)光A液和B液按1:1的比

28、例根據(jù)膜的大小選擇合適用量在EP管中混合均勻（一整張膜需要1ml，即A,B液各0.5ml），將PVDF膜控干后鋪于顯影塑料盒內，將顯影混合液均勻的涂在PVDF膜上，避光孵育5min左右，將膜夾在塑料膜內，將塑料膜置于顯影儀器進行顯影。打開Gene Sys軟件BlotsChemi Blot(Series)BioRad blot(7×8.4cm)ChemiFast(ECL Plus)Marker 勾選選擇拍攝張數(shù)（根據(jù)實際情況選擇）勾選“of previous image”選擇三張拍攝時間（30s，1min,3min根據(jù)實際情況選擇）調整曝光出來圖像的效果保存關閉儀器。根據(jù)顯影結果進行分析。（九）STRIP膜再生