反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中西沙必利濃度

1、    反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中西沙必利濃度        摘要目的:建立反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中西沙必利濃度方法。方法:采用Luna C18不銹鋼分析柱, 以0.02mol.L-1磷酸-乙腈(6238，用濃氨水調(diào)pH至6.2)為流動(dòng)相, 卡馬西平作內(nèi)標(biāo)。樣品在堿性條件下用含5%異戊醇的正庚烷旋渦混合萃取濃集后進(jìn)樣, 在273 nm波長(zhǎng)下檢測(cè),按內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果:標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.5128g.L-1范圍內(nèi)有良好線性，最低檢測(cè)濃度為0.3g.L-1，方法回收率為92%103

2、%，日內(nèi)RSD小于2.5%，日間RSD小于5.5%。結(jié)論:本法具有快速簡(jiǎn)便，靈敏準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已用于西沙必利片劑及膠囊劑的生物利用度測(cè)定，結(jié)果良好。關(guān)鍵詞西沙必利; 高效液相色譜法; 血藥濃度中分類(lèi)號(hào)：R969.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1001-5213(2000)11-0643-03 Determination of cisapride in human plasma by RP-HPLCQIN Yong-Ping，ZOU Yuan-Gao，LIANG Mao-Zhi(Institute of Clinical Pharmacology, First Affiliated Hospita

3、l, West Chinese University Medical Science, Shichuan Chengdu 610041)ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a RP-HPLC for the determination of cisapride(CSP) in human plasma using carbamazepine as internal standard.METHODS：A variable wavelength UV detector and luna C18 column were used. The alkalinized plasm

4、a sample was extracted with 3.0 ml n-heptane containing 5% iso-amylalcohol. After evaporation of the organic layer, the residue was dissolved in mobile phase and injected onto the column. The mobile phase of 0.02 mol.L-1 phosphoric acid-acetonitrile (6238, adjusted to pH 6.2 with ammonia water) was

5、pumped at 1.2 ml.min-1 through the column. The detector at 0.002aufs was set at 273 nm.RESULTS：The retention times for CSP and carbamazepine were 5.0 min and 4.5 min respectively. Standard curve was linear in the concentration range of 0.5128 g.L-1. The detection limit in plasma was 0.3 g.L-1; and m

6、ethod recovery was 92%103%; withinday RSD less than 2.5%; inter-day RSD less than 5.5%.CONCLUSIONS：This method was found to be simple, rapid, sensitive and accurate for determination of CSP in human plasma.KEY WORDScisapride ; HPLC; plasma concentration西沙必利(cisapride，CSP)是一種作用于5-HT受體的新型胃腸道動(dòng)力促進(jìn)藥物?？诜?/p>

7、收快，在臨床上片劑已用于治療胃輕癱綜合征，上消化道不適等疾病，取得了良好的臨床療效。有關(guān)CSP血藥濃度測(cè)定法，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外文獻(xiàn)較多14，其所用內(nèi)標(biāo)國(guó)內(nèi)均無(wú)法找到，樣品預(yù)處理有的操作復(fù)雜，有的成本高，且靈敏度和精密度不夠理想。為研究國(guó)產(chǎn)四類(lèi)新藥CSP片劑及膠囊劑與進(jìn)口片劑的人體相對(duì)生物利用度，建立了CSP血藥濃度的反相高效液相色譜測(cè)定法。1儀器與試藥1.1儀器與色譜條件美國(guó)Waters公司680型高效液相色譜儀(510型泵，486型紫外檢測(cè)器)；日本島津CR7Ae plus色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)，7725型進(jìn)樣閥(20 l)；使用Luna C18不銹鋼分析柱（15 cm×4.6 mm，

8、5 m）,以0.02 molL-1的磷酸乙腈(6238，用濃氨水調(diào)pH至6.2)為流動(dòng)相，流速1.2 mlmin-1；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為273 nm, 靈敏度為0.002AUFS。1.2藥品與試劑對(duì)照品西沙必利由成都市科倫藥物研究所提供， 純度99.8%，批號(hào)971016。內(nèi)標(biāo)用卡馬西平(精制化學(xué)對(duì)照品)由中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)得。實(shí)驗(yàn)所用乙腈為色譜純,水為重蒸餾水, 氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、正庚烷、異戊醇為分析純, 其中異戊醇用前經(jīng)重蒸餾處理。1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精確稱(chēng)取對(duì)照品西沙必利6.4 mg，置于100 ml容量瓶中，加乙腈70 ml溶解后，加0.02 molL-1的磷酸鹽緩沖液（pH6.

9、0）定容至刻度即成西沙必利貯備液(64 mgL-1)。置4 冰箱保存，臨用時(shí)將貯備液用流動(dòng)相稀釋至所需濃度，即得西沙必利工作液。精確稱(chēng)取卡馬西平對(duì)照品9.5 mg，置于100 ml容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度即成內(nèi)標(biāo)貯備液(95mgL-1)。置4 冰箱保存，臨用時(shí)將貯備液用重蒸水稀釋至所需濃度, 即得內(nèi)標(biāo)稀釋液。2方法與結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備取正常人空白血漿1.0 ml共9份,分別加入不同濃度的西沙必利工作液100 l，使各管血漿濃度分別為128,64,32,16,8,4,2,1,0.5 gL-1，再分別加入內(nèi)標(biāo)稀釋液100 l(含卡馬西平15 ng)，2.0 molL-1的氫氧化鈉

10、100 l?；靹蚝笥煤?%異戊醇的正庚烷3.0 ml旋渦混合萃取5 min，離心5 min (2 500 rmin-1)，轉(zhuǎn)上層液于10 ml尖底試管內(nèi)，置55 水浴中通空氣流揮干，殘?jiān)苡?0 l流動(dòng)相，進(jìn)樣20 l。記錄色譜峰高，由西沙必利與卡馬西平的峰高比(Y)對(duì)西沙必利濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=0.02164X+0.00076 (r=0.999 9)。結(jié)果表明血藥濃度在0.5128 gL-1范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。2.2保留時(shí)間及檢測(cè)限空白及樣品血漿色譜見(jiàn)1, 西沙必利及內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間分別為5.0 min和4.5 min。西沙必利的最低檢出量為0.1 ng, 最低

11、檢出濃度為0.3 gL-1 (以信噪比3計(jì))。1空白及樣品血漿色譜a. 空白血漿b. 加入內(nèi)標(biāo)的空白血漿c. 口服西沙必利15mg后3.5h樣品血漿1.內(nèi)標(biāo)卡馬西平2.西沙必利2.3萃取回收率取空白血漿分別加入高、中、低濃度的西沙必利工作液，配成濃度分別為80.0,20.0和5.0 gL-13種濃度的樣品，每種濃度3份，按血漿樣品測(cè)定法處理后進(jìn)樣。將所得峰高與濃度為1 600，400，100 gL-1的工作液直接進(jìn)樣20 l所得峰高相比, 即得萃取回收率,各濃度測(cè)定3次的平均萃取回收率分別為(79.8±2.1)%，(80.3±4.8)%和(83.0±1.7)%。2

12、.4方法精密度取含西沙必利高、中、低3種濃度的混合血漿樣品，每種濃度樣品分成10份，取5份于同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次。其西沙必利的平均濃度分別為(80.0±0.5)，(19.3±0.4)和(5.30±0.12) gL-1，對(duì)應(yīng)的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.6%，2.2%和2.3%。每種濃度另5份于3周內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次, 其西沙必利的平均濃度分別為(80.0±1.4), (19.9±1.0)和(5.08±0.23) gL-1, 對(duì)應(yīng)的日間RSD分別為1.7%，5.1%和4.6%。2.5方法回收率取空白血漿分別加入高、中、低濃度的西沙必利

13、工作液,每種濃度分別配5份樣品，按血漿樣品測(cè)定法處理后進(jìn)樣，計(jì)算方法回收率。當(dāng)加入量為80.0,20.0,5.0 gL-1時(shí)，測(cè)定5次的平均方法回收率分別為(99.3±2.0)%，(98.7±3.9)%和(96.0±4.2)%。2.6受試者血樣測(cè)定取受試者血漿樣品1.0 ml，加入重蒸水100 l代替西沙必利工作液,再按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作,以藥物和內(nèi)標(biāo)的峰高比在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出各樣品中西沙必利濃度。12名受試者分別口服西沙必利15mg國(guó)產(chǎn)片劑、膠囊劑和對(duì)照藥（進(jìn)口片劑）后，其血藥濃度-時(shí)間曲線的變化趨勢(shì)基本一致。 3討論3.1內(nèi)標(biāo)選擇文獻(xiàn)所用內(nèi)標(biāo)有Risperid

14、one1、Ticlopiding2、Trihexyl phenidyl hydrochloride3和Cletoprid4，均為不常見(jiàn)的化合物，國(guó)內(nèi)難以找到。經(jīng)篩選，容易獲得標(biāo)準(zhǔn)品的卡馬西平，在所用色譜條件下不僅剛好能與CSP分開(kāi)（調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH可控制卡馬西平與CSP的分離度為1.6），而且萃取回收率與CSP相近，很好地起到了內(nèi)標(biāo)的作用，提高了測(cè)定的精密度（日內(nèi)RSD<2.5%，日間RSD<5.1%），優(yōu)于文獻(xiàn)1報(bào)道。3.2流動(dòng)相pH對(duì)保留時(shí)間及峰高的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相pH對(duì)CSP的保留時(shí)間影響大，因此，考察了用濃氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH于不同值時(shí)，CSP與內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間及峰高

15、的變化情況。結(jié)果保留時(shí)間內(nèi)標(biāo)不隨流動(dòng)相pH變化而改變，CSP則隨pH增高而明顯延長(zhǎng)，峰高降低，pH低時(shí)，CSP先于內(nèi)標(biāo)出峰。考慮到CSP峰在內(nèi)標(biāo)峰前有雜質(zhì)干擾，因此，選擇pH6.2的流動(dòng)相用于樣品測(cè)定，既能使CSP與內(nèi)標(biāo)完全分開(kāi)，不受血漿雜質(zhì)干擾，又能保持較高峰高，且分析時(shí)間短（不到6 min），對(duì)提高測(cè)定的精密度和靈敏度具有重要作用，最低檢測(cè)濃度（0.3 gL-1）和精密度（日間RSD<5.5%）均優(yōu)于文獻(xiàn)14報(bào)道。3.3樣品預(yù)處理文獻(xiàn)1采用固相萃取法，不僅成本高，而且雜質(zhì)峰較多，干擾測(cè)定。雖然血漿用量少（150 l），但最低檢測(cè)濃度為10 gL-1。文獻(xiàn)4采用多次萃取法（3次），試劑

16、耗費(fèi)多，操作復(fù)雜，血漿用量大（2 ml）。經(jīng)比較在不同酸堿條件下，用多種有機(jī)溶劑（二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、正庚烷等）及其組合提取試驗(yàn)，選擇了前述樣品預(yù)處理方法，具有操作簡(jiǎn)便、試劑用量少、成本低、萃取回收率高、雜質(zhì)峰小、完全不干擾測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。總之，本文報(bào)道的測(cè)定CSP血藥濃度方法具有操作簡(jiǎn)便、試劑成本低、靈敏度高、精密度好等優(yōu)點(diǎn)，已用于CSP片劑、膠囊劑生物利用度樣品測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。秦永平（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所, 四川 成都 610041）鄒遠(yuǎn)高（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所, 四川 成都 610041）梁茂植（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所,

17、四川 成都 610041）黃英（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所, 四川 成都 610041）余勤（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所, 四川 成都 610041）參考文獻(xiàn)：1Cisternino S, Schlatter J, Saulnier JL. Determination of cispride and norcispride in human plasma using high-performance liquid chromatography with ultraviolet detectionJ. J of Chromatography，1998, 714(2):3952Hsu JY, Hsu MY, Hsu HC, et al. A comparative bioavailability study on two brands of cispride tables using univariate and multivarite statistical methodsJ. Yaowu Shipin Fenxi,1998, 6(4):7033Rao PB, Dhuri SD,Sundarsan M, et al. A new