冰凍切片漂片

1、 1 / 8 免疫組化步驟： 1.將腦片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗說明書，加3%雙氧水封閉10min（如果是從切片保護(hù)液取出，則要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步驟有差別），本實(shí)驗(yàn)室使用的二抗試劑盒為中杉金橋超敏二步法試劑盒； 2.吸去雙氧水，PBS洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片； 3.然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需50微升一抗稀釋液，小鼠腦片為30微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體； 4.然后，4，過夜（18h或者24h），不建議使用37； 5.然后，PB

2、S洗凈兩遍；剩下步驟見二抗試劑盒說明書。 6.DAB配方為：10mgDAB固體加到20ml 0.01MPBS，臨用時(shí)加100-200微升30%雙氧水，注意避光。 7.顯色10min，看片子染色深淺情況適當(dāng)調(diào)整顯色時(shí)間。一般3分鐘顯色就比較明顯，如果20分鐘仍未顯色，則看下面的參考。 8.然后PBS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片，自然晾干。干燥天氣2-3h，潮濕天氣3-4h。 9.脫水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上鹽分較多，在70%酒精前在雙蒸水1min。 免疫熒光步驟及注意事項(xiàng)： 1，將腦片放到6空板的

3、山羊血清封閉液中，封閉20-40min；（如果是從切片保護(hù)液取出，則要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；3，然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入PBS稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需50微升一 2 / 8 抗稀釋液，小鼠腦片為30微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；4，4，過夜（18h或者24h），不建議使用37，如果熒光亮度不強(qiáng)，可以延長孵育時(shí)間到48或72小時(shí)；5，然后，PBS洗凈兩三遍，按照二抗說明書稀釋的熒光二抗，室溫孵育2小時(shí)。注意避光操作。 6， 0.01MP

4、BS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片上，避光自然晾干； 7，滴加防淬滅劑后，蓋上蓋玻片鏡下觀察。 常見問題： 1，熒光太暗： 可能蛋白表達(dá)少；可能一抗孵育時(shí)間短；二抗孵育時(shí)間短；清洗次數(shù)過多；溶液pH不合適；熒光萃滅；一抗?jié)舛冗^低或過高；二抗?jié)舛冗^低或過高；激發(fā)波長不在抗體適用波段。 2，背景熒光太深： 一抗?jié)舛冗^高，清洗不徹底；二抗?jié)舛冗^高，清洗不徹底；封閉時(shí)間過短，非特異性過強(qiáng)；一抗非特異性過強(qiáng)；二抗非特異性過強(qiáng)；顯微鏡熒光強(qiáng)度過強(qiáng)。總之實(shí)驗(yàn)是喜歡強(qiáng)陽性，不喜歡假陰性，呵呵。任何實(shí)驗(yàn)都需要花時(shí)間摸索才能找到其最佳的工作條件。 另附免疫組化常見問題解析。原理是相同的，只是最后的顯色方法不一樣，有些問題有

5、啟發(fā)作用。 免疫組織化學(xué) 1.邊緣效應(yīng)? 原因:1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致.解決辦法： 3 / 8 制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。 2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法： 試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。 2.產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？ 1.抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。

6、解決辦法: 這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。 這是最重要的一條。 2.一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 3.內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 4.非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果； 5.DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高； 6.PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 做出陽性結(jié)果？另外不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最

7、佳濃度。 2、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。 3、組織切片本身這種抗原含量低； 4 / 8 4、血清封閉時(shí)間過長。 5、DAB孵育時(shí)間過短。 6、細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。 7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問題。 4.背景強(qiáng)的原因?1,考慮一抗?jié)舛雀撸?,然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；3,也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短4,適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等。 5.DAB顯色真的需要3-1

8、0分鐘嗎？我之前做的顯色40秒就夠了，再多本底就太深，現(xiàn)在 做另一個(gè)顯色3分鐘也不出，真的有必要延長顯色時(shí)間嗎？ 1.DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗； 2.DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間； 3.此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間； 4.DAB顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。 6.

9、石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？， 1烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度 二，用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做 5 / 8 三，有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖 到組織上方， 讓它流下沖洗組織，四，用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。 7.年前爬的細(xì)胞片在-20度放了半年（保鮮膜密封），現(xiàn)在取出來再作，做了兩次，步驟均是按以前的作的，但今天做時(shí)，原來顯色很強(qiáng)的片子現(xiàn)在顯色很弱了，問什么呢？是不是片子放的時(shí)間太長了？抗體在4度放的時(shí)間也不長而且這次濃度比以前做的還高? 1.首先，抗體濃度和孵育時(shí)間在免疫組化中至關(guān)重要。在抗

10、原抗體反應(yīng)并非抗體濃度越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈，這叫前帶現(xiàn)象。所以選擇最佳的一抗?jié)舛群头跤龡l件也是十分重要的，其實(shí)抗體濃度過高或過低均會(huì)引起陰性。 2.我到認(rèn)為你這片子的影響可能更大。盡管在-20度保存，但是時(shí)間一般超過3個(gè)月就不能保證其中抗原的丟失，建議可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。 3.你說抗體放在4度保存是指未稀釋還是稀釋后抗體，存放多長時(shí)間？一般稀釋后抗體不能保存很長時(shí)間的。 8.為什么切片傾斜，抗體分布不均勻，就會(huì)造成一半陽性，一半陰性？我認(rèn)為，即使切片傾斜，抗體覆蓋少的那部分組織和其他部分抗體的濃度是一樣的，只是抗體體積的大小差異！如果說抗體傾斜沒覆蓋好的地方是陰性，那為什么不是干

11、片所導(dǎo)致的非特異性高背景的染色呢？當(dāng)切片傾斜到有一半甚至都沒液體時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)陰陽臉樣的著色。 你認(rèn)為呢？ 9.高溫抗原修復(fù)后就沒必要滅火內(nèi)源性過氧化物酶?經(jīng)過高溫POD已經(jīng)滅活了，不錯(cuò)POD是被被滅活了，但它仍有還原能力，仍能跟DAB發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使DAB顯色，我們用雙氧水是耗竭POD的還原能力，使之不能在跟DAB反應(yīng)。所以無論修復(fù)與否都應(yīng)該滅活POD，盡可能消除非特異性著色。 6 / 8 10.冰凍切片有時(shí)會(huì)有小洞? 冰凍切片有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)切片上會(huì)有空洞，這是因?yàn)榻M織在冰凍過程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是組織冰凍時(shí)間太慢，或者冰凍的溫度不夠低，慢慢形成冰晶，二是有些組織在冰凍之前需要做適當(dāng)

12、的固定，如腦組織，然后放入30%的蔗糖4度冰箱過夜以減少冰晶形成，并且能最大程度保持組織細(xì)胞形態(tài)。另外在切片是組織塊復(fù)溫要在37度速融，否則易造成組織塊的破壞。 11.常用免疫組化結(jié)果分析方法? 1.陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組36張性范圍進(jìn)行評(píng)分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。 12.DAB呈色后到底什么樣染色是特異性染色？ 陽性標(biāo)記可以從色度特征，陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)

13、特征來進(jìn)行基本的判斷。色度特征： 一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，標(biāo)記方法越敏感，陽性結(jié)果顯色則越強(qiáng)。根據(jù)陽性標(biāo)記的顯色程度分為： 淡黃色，提示為弱抗原；棕黃色，提示為中等度抗原；棕黑色，示為強(qiáng)抗原。在結(jié)果判斷中，后兩者較有意義，可作為判斷依據(jù)。細(xì)胞學(xué)特征： 陽性表達(dá)必須在細(xì)胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的陽性表達(dá)即使陽性也不應(yīng)作為判斷依據(jù)。一般分為胞膜型，胞核型，胞質(zhì)型，微絨毛型,復(fù)合型幾種。這是需要結(jié)合背景知識(shí)的。 同樣，非特異性染色也有一定的特點(diǎn)： 它首先是指抗原無明確定位，各種細(xì)胞累及一片，色度無深淺之分，這種標(biāo)記組織片不能作為免疫組織標(biāo)記結(jié)果判斷的依據(jù)，造成非選民性染色的

14、原因常為組織標(biāo)本固定不佳，抗體質(zhì)量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。 7 / 8 因此，免疫組化特異性染色定位非常重要，一般情況下，陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互交雜，陽性染色強(qiáng)度深淺不一。如果缺乏細(xì)胞音的不均一性染色，即或呈陽性染色，常提示為非特異性染色。 另外，組織片邊緣反應(yīng)和出血壞死灶周圍陽笥反應(yīng)不能作為診斷依據(jù)。 13.1.石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？我用組織芯片和普通切片在多種條件下進(jìn)行了抗原修復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在熱修復(fù)后，組織脫片最主要原因是組織脫水不良，腫瘤組織黏附性差在小塊組織時(shí)也容易撕脫（減小熱修復(fù)加熱功率，PBS沖洗時(shí)不要直對(duì)組織沖洗、可以有效防范）。 2.DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片

15、著色不均勻： 如一片著色，一片不著色或染色淺？這就是免疫組化染色的陰陽臉，免疫組化實(shí)驗(yàn)是環(huán)環(huán)相扣的實(shí)驗(yàn)，任何一步試劑孵育不全（沒有均勻的在組織上孵育）都可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果。 3.免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？那就要考慮真陰性還是假陰性！假陰性是你操作不當(dāng)或者試劑質(zhì)量的問題了。 4.切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？你的抗體是否特異，孵育時(shí)間溫度濃度是否過長！ 5.一抗從4度拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？我沒遇到這樣的說法，是否是想加速復(fù)溫？還有我不知道國內(nèi)的院校為什么對(duì)37孵育如此感興趣，在你們買國外抗體時(shí)，他們的說明書上除了酶修復(fù)要37外，其他步驟中均沒有說要在37中孵育。 6.免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？尤其微波修復(fù)?？乖迯?fù)沒有什么最佳條件只有可能管用的修復(fù)條件。 7.有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細(xì)胞，對(duì)石蠟切片需要否？tritonX100是脂質(zhì)溶解劑，做免疫細(xì)胞化學(xué)時(shí)細(xì)胞膜是完整的半透膜，孵育的抗體要自由的通過細(xì)胞膜就要用tritonX100來破膜。石蠟切片細(xì)胞多數(shù)是切開狀態(tài)了。 8 / 8 但是脂質(zhì)有時(shí)會(huì)吸附抗體，含脂質(zhì)高的組織也可以用triton。 8.蘇木素復(fù)染的時(shí)間應(yīng)該是多少？復(fù)染過度咋辦？要看你是用什么蘇木素，免疫組化復(fù)染，不比我們平常的HE，它只要一般的輕微染色就夠了，染過了就湊合著看