shRNA文庫RNA干擾研究者的福音

1、shRNA文庫：RNA干擾研究者的福音letters to natureNature 428,427 - 431 (25 March 2004); doi:10.1038/nature02370<>A resource for large-scaleRNA-interference-based screens in mammalsPATRICK J. PADDISON 1,*, JOSE M. SILVA 1,*, DOUGLAS S. CONKLIN 1,*,?, MIKE SCHLABACH 2,?, MAMIE LI 2, SHOLA ARULEBA 1, VIVEKANAN

2、D BALIJA 1 ANDY O'SHAUGHNESSY 1, LIDIA GNOJ 1, KIM SCOBIE 1, KENNETH CHANG 1, THOMAS WESTBROOK 2,?, MICHELE CLEARY 3, RAVI SACHIDANANDAM1,W. RICHARD MCCOMBIE 1, STEPHEN J. ELLEDGE 2,? & GREGORY J. HANNON1 Cold Spring Harbor Laboratory, Watson School of Biological Sciences, 1 Bungtown Road, C

3、old SpringHarbor, New York 11724, USA2 Department of Biochemistry, Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Houston, Texas 77030, USARosetta Inpharmatics, 12040 115th Avenue NE, Kirkland, Washington 98034, USAThese authors contributed equally to this work ? Pres

4、ent addresses: Department of Biomedical Sciences, Center for Functional Genomics, University at Albany, East Campus, B342A, One University Place, Rensselaer, New York 12144-2345, USA (D.S.C.);Department of Genetics, Harvard Partners Center for Genetics and Genomics, Harvard Medical School Room 158D,

5、 NRB, 77 Avenue Louis Pasteur, Boston, Massachusetts 02115, USA (M.S., T.W. and S.J.E.)Correspondence and requests for materials should be addressed to G.J.H. () or S.J.E. ().Gene silencing by RNA interference (RNAi) in mammalian cells using small interf

6、ering RNAs (siRNAs) and short hairpin RNAs (shRNAs) has become a valuable genetic tool. Here, we report the construction and application of a shRNA expression library targeting 9,610 human and 5,563 mouse genes. This library is presently composed of about 28,000 sequence-verified shRNA expression ca

7、ssettes contained within multi-functional vectors, which permit shRNA cassettes to be packaged in retroviruses, tracked in mixed cell populations by means of DNA 'bar codes', and shuttled to customized vectors by bacterial mating. In orderto validate the library, we used a genetic screen des

8、igned to report defects in human proteasome function. Our results suggest that our large-scale RNAi library can be used in specific, genetic applications in mammals, and will become a valuable resource for gene analysis and discovery.2004年3月30日，Open Biosystems 公司正式宣布對(duì)外發(fā)售。該 Expression Arrest? shRNA L

9、ibraries 構(gòu)建者們?cè)O(shè)計(jì)、合成、測(cè)序并克隆了上千個(gè)小分子發(fā)夾RNA ,研究者只需在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中選擇特定的shRNA克隆就可在近期內(nèi)得到用于RNAi用的shRNA世界著名分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室(CSHL )的Dr. Hannon設(shè)計(jì)、測(cè)序并克隆獲 得了大量的shRNA克隆，shRNA可以在常規(guī)的 DNA 載體上表達(dá)。Expression Arrest? shRNA克隆可以通過轉(zhuǎn)染方法進(jìn)入細(xì)胞，或者也可以通過病毒介導(dǎo)(腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)進(jìn)入細(xì)胞。體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以構(gòu)建持續(xù)的細(xì)胞系，持久抑制目標(biāo)基因表達(dá)。全球的研究或商業(yè)性的實(shí)驗(yàn)室目前正在大范圍的使用 RNAi技術(shù)評(píng)價(jià)基因的功能，而

10、Expression Arrest? shRNA文庫的產(chǎn)生促進(jìn)了人和小鼠的基因功能研 究，具有非常重要的科研和應(yīng)用價(jià)值。Expression Arrest? shRNA 文庫由 Open Biosystems 公司運(yùn)作上市， 目前人和小鼠的文庫 總共包括6,500個(gè)基因，每個(gè)基因包括1-4個(gè)shRNA克隆。這些基因主要是一些非常有應(yīng)用前景的基因，其蛋白質(zhì)成分有可能在將來的疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮作用。該文庫正在發(fā)展壯大，OpenBiosystems 寄希望將來的文庫能包括目前所有證實(shí)的人和小鼠基因，且每個(gè)基因包括6-10個(gè)shRNA克隆。Expression Arrest? shRNA文庫的出現(xiàn)是大規(guī)

11、模RNAi篩選技術(shù)的突破，科研工作者可以通過非常簡(jiǎn)單的方式直接從該文庫中找到針對(duì)某特定基因的shRNA ,無需耗時(shí)耗力的 siRNA設(shè)計(jì)、合成和驗(yàn)證過程。Benefits of shRNA vs. siRNAsiRNAshRNA使用代價(jià)高相對(duì)較低持久性最多2周可選擇獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞宿主類型細(xì)胞系原代細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞、細(xì)胞系設(shè)計(jì)復(fù)雜的設(shè)計(jì)方法Completed獲取需要合成Completed應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、病毒侵染檢測(cè)方法Western雜交、表型分析RT-PCR、芯片檢測(cè)Western雜交、表型分析、 RT-PCR、芯片檢測(cè)研究領(lǐng)域細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)&體外研究Express

12、ion Arrest Human shRNA Library美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室 （CSHL）的Dr. Hannon構(gòu)建的人的shRNA文庫由大量針對(duì)驗(yàn)證的目標(biāo) 基因設(shè)計(jì)的shRNA克隆組成。human shRNA 1.1 版本的文庫包括 8,500 shRNA 克隆，涉及5,700 人類基因。該文庫可以快速、高效地對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行功能缺失的遺傳篩選和遺傳相互作用的 檢測(cè)。冷泉港實(shí)驗(yàn)室（CSHL ）提供的人的shRNA文庫的出現(xiàn)可以免去客戶設(shè)計(jì)和合成siRNA的煩惱，針對(duì)目標(biāo)基因的每個(gè)小分子shRNA均被克隆和測(cè)序驗(yàn)證。為了確保最有效的調(diào)控基因的表達(dá)水平，每個(gè)基因都設(shè)計(jì)了多個(gè)shRNA克隆，每個(gè)

13、shRNA序列都分別與目標(biāo)基因的特異序列相對(duì)應(yīng)。當(dāng)您訂購對(duì)某一個(gè)基因下單時(shí)，該基因所有的 shRNA克隆都會(huì)一起提供給您。pSM1 Vector載體元件意義U6啟動(dòng)子產(chǎn)生的RNA的3'端有4個(gè)突出的U逆轉(zhuǎn)錄病毒信號(hào)序列與包裝蛋白的成分形 成復(fù)合物感染哺乳動(dòng) 物細(xì)胞PKG-Puro哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性的選擇氯霉素細(xì)菌篩選標(biāo)記同源重組位點(diǎn)通過同源重組將 shRNA 表達(dá)框轉(zhuǎn)入載體Expression Arrest Mouse shRNA Library美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室(CSHL )的Dr. Greg Hannon構(gòu)建了針對(duì)小鼠特異目標(biāo)基因的shRNA文庫。1.1版本的文庫包括 3,50

14、0 shRNA克隆，覆蓋850小鼠基因。該文庫可以快速、高效地 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行功能缺失的遺傳篩選和遺傳相互作用的檢測(cè)。冷泉港實(shí)驗(yàn)室(CSHL )提供的小鼠的 shRNA文庫的出現(xiàn)可以免去客戶設(shè)計(jì)和合成siRNA的煩惱，針對(duì)目標(biāo)基因的每個(gè)小分子shRNA均被克隆和測(cè)序驗(yàn)證。為了確保最有效的調(diào)控基因的表達(dá)水平，每個(gè)基因都設(shè)計(jì)了多個(gè)shRNA克隆，每個(gè)shRNA序列都分別與目標(biāo)基因的特異序列相對(duì)應(yīng)。當(dāng)您訂購對(duì)某一個(gè)基因下單時(shí)，該基因所有的shRNA克隆都會(huì)一起發(fā)給您。pSM1 Vector載體元件意義U6啟動(dòng)子產(chǎn)生的RNA的3端有4個(gè)突出的U逆轉(zhuǎn)錄病毒信與包裝蛋白的成分形號(hào)序列成復(fù)合物感染哺乳動(dòng)

15、 物細(xì)胞PKG-Puro哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定性的選擇氯霉素細(xì)菌篩選標(biāo)記同源重組位點(diǎn)通過同源重組將 shRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)入載 體(斑馬魚)文庫Zebrafish Morpholino LibraryExpression Arrest Zebrafish Morpholino 文庫由美 國著名的 Gene Tools, LLC 公司開發(fā)，Open Biosystems是該公司的獨(dú)家代理。通過該模式生物可以 為科研工作者提供了解譯基因功能的途徑。嗎咻寡聚核甘酸 (Morpholino oligonucleotides , MF )嗎咻寡聚核甘酸(MF)是非離子型 DNA類似物， 其中的核糖被嗎咻所

16、代替，磷酸二酯鍵被 phosphoroamidate所代替，可從 Gene Tools LLC 公司(Corvallis , OR, USA)購得。最近，已經(jīng)有綜述介紹了它在應(yīng)用上的成功和局限性，尤其聚焦于發(fā)育生物學(xué)上的應(yīng)用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)發(fā)表的關(guān)于嗎咻復(fù)合物的文章是用斑馬魚月5胎進(jìn)行研究的。Genesis雜志的整個(gè)一期（volume30 , issue3 , 2001 ）都是關(guān)于利用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行的基因功能研究。用MF對(duì)斑馬魚胚胎中廣泛表達(dá)的GFP基因（轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物）在所有的細(xì)胞中進(jìn)行了敲除。在這項(xiàng)研究中建立了等量的已知基因突變和人類疾病模型，利用MF確定了一些新的基因功能。有報(bào)道說MF可以糾正突變

17、的 b球蛋白前體 mRNA的錯(cuò)誤剪接，具有潛在的治療意義。用與錯(cuò) 誤剪接位點(diǎn)互補(bǔ)的寡聚核甘酸處理地中海貧血病人外周血中的紅細(xì)胞祖先，可以糾正錯(cuò)誤剪接， 提高血色素A的合成。Catalog Number: PZF1245 - Individual Zebrafish MorpholinoZebrafish Morpholino文庫包括上千個(gè)寡核甘酸序列，每個(gè)寡核甘酸序列都是針對(duì)目標(biāo)序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，可以快速誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的下調(diào)。Morpholinos寡核甘酸特異性非常高并且具有核酸酶抗性，因此其可以長(zhǎng)效地、特異性誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)下調(diào)。Morpholino 一般與目標(biāo)基因起始位點(diǎn)的序

18、列互補(bǔ) 每個(gè)寡核甘酸都通過質(zhì)譜檢測(cè)驗(yàn)證，無菌包裝運(yùn)輸干粉）。（大概互補(bǔ)區(qū)間長(zhǎng)度在25-50個(gè)堿基左右），購買時(shí)，每個(gè)morpholino 的量是50 nM （凍? 特異性與目標(biāo)基因的起始位點(diǎn)互補(bǔ)? 高核酸酶抗性? 可單獨(dú)購買，也可以 96-well板形式購買? 到貨周期短果蠅RNAi文庫Catalog Number:RDM1189 - Drosophila RNAi CollectionRDM1190 - Individual RNAi ConstructsRNAi出現(xiàn)為研究果蠅的基因功能提供了新的途徑。Openbiosystem 公司提供的果蠅 RNAi文庫包括7,000 DNA序列，可以直接用來體外轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生RNAo該文庫中的dsDNA可以覆蓋果蠅基因組的50 %以上。對(duì)于每個(gè)基因，均采用特異性引物擴(kuò)增其外顯子序列（約 300-600個(gè)堿基）。DmRNAi結(jié)構(gòu)包括兩個(gè) T7啟動(dòng)子， 無RNase ,可直接用于體外轉(zhuǎn)譯研究。Open Bios