生化實(shí)驗(yàn)講義：實(shí)驗(yàn)九酵母蔗糖酶最后

1、生化實(shí)驗(yàn)講義:實(shí)驗(yàn)九-酵母蔗 糖酶（最后）作者: 日期:實(shí)驗(yàn)九酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)的研究本實(shí)驗(yàn)為學(xué)生提供一個較全面的實(shí)踐機(jī)會，學(xué)習(xí)如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對這種酶的性質(zhì)，尤其是動力學(xué)性質(zhì)作初步的研究。自 186 0 年 Ber th ole t 從酒酵母S acchac om yc e s Cerevisia e中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來，它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶(invertase) ( D 呋喃果糖苷果糖水解酶)(fr U Ct ofura n os id e f ructo h ydr o la se )(EC.3.2.1.2 6)特異地催化非還原 糖中的 一呋喃果糖苷鍵水解，

2、具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖 , 也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。本實(shí)驗(yàn)提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶(exter n al y east inve r tase),其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有 50%糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗S），內(nèi)酶，本實(shí)驗(yàn)糖酶（i n terna 1 yeast in vertase）,含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞 基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內(nèi)酶多兩個氨基酸， e r和Met，它們的分子量也不同,外酶約為

3、27萬（或22萬，與酵母的來源有關(guān) 約為13 .5萬。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學(xué)性質(zhì)仍 十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取提取純化的主要是外酶。兩種酶的性質(zhì)對照表如下：名 稱M W糖含量亞基底物 為蔗 糖的Km底物 為棉 子糖 的K m等電 點(diǎn)pl最適pH穩(wěn)定pH范圍最適溫度外酶27萬（22 萬）5 0 %雙26m M150mM5. 04.9(3.55.5)3.07. 560 C內(nèi) 酶13. 5萬0 .3、0.4、0.5、0 .6、0.8、1.0m 1,用去離子水補(bǔ)足到1.0ml。各級分先要仔細(xì)尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細(xì)

4、記錄稀釋倍數(shù)的計算（使用移液管和量筒稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考：粗級分I:1050倍熱級分I I:1 0 5 0倍醇級分I II :10 5 0倍柱級分IV :不稀釋確定了稀釋倍數(shù)后，每個級分取3個不同體積的樣進(jìn)行測定，然后取平均值，計算出各級分蛋白質(zhì)濃度。六、級分I、II、II I蔗糖酶活性測定用0.0 2m 0 l / L pH 4 .9乙酸緩沖液（也可以用pH56的去離子水代替）稀釋各級分酶液，試測出測酶活合適的稀釋倍數(shù)：I :10001 00 0 0 倍I I :1 0 00 1 0 0 0 0 倍I II :100 0 10 0 0 0倍以上稀釋倍數(shù)僅供參考。按“表1”的順序在試管

5、中加入各試劑，進(jìn)行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口,沸水浴加熱改為用909 5C水浴加熱81 0min。七、柱級分IV酶活力的測定1 m l。“表1”中的11、12管1. 酶活力的測定參照“表 1 ”設(shè)計一個表格，反應(yīng)混合物仍為2. 第1管仍為蔗糖對照，9、10管為葡萄糖的空白與標(biāo)準(zhǔn)，與 相同。,分別為0 .02 ml、0. 06ml,然后各加0.2ml乙酸緩沖液（0. 2mol/L pH4.3. 27管加入柱級分IV （取樣前先試測出合適的稀釋倍數(shù)）5 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml 和 0.9 ），每管用去離子水補(bǔ)充到0.8ml。4. 17管各加入0.2 ml 0.2 m

6、ol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖開始計時，室溫下準(zhǔn)確反應(yīng)1 0min,立即加入1 ml堿性銅試劑中止反應(yīng)，然后按“表1”中的步驟進(jìn)行測定。，不進(jìn)行計算。計算柱級分IV的酶活力：U ni ts / ml原始溶液。以每分鐘生成的還原糖的m0 l e s數(shù)為縱座標(biāo)，以試管中1ml反應(yīng)混合物中的酶（mg蛋白/ml ）為橫座標(biāo)，畫出反應(yīng)速度與酶濃度的關(guān)系曲線。5. 第8管為0時間對照，與第7管相同，只是在加入0.2ml蔗糖之前，先加入堿性銅 試劑，防止酶解作用。此管只用于觀察6.7.濃度表1 級分I、n、川的酶活力測定各管名稱T對照粗級分I熱級分n醇級分m葡萄糖管數(shù)T123568911471 012酶液（

7、m l）0.00.050.201 0.5 10 0.050. 2 00.500. 0 50 .200.50/H20(ml)0 .60.550.400.1 00.050 .2 0 0 .100. 5 50.4 00. 1 01.00.8乙酸緩沖液0.20.20. 20.20. 20. 20.2 0.20 . 2(0 . 2mol / L0. 2/pH 4.9)葡萄糖2 mm 0 l/L/0.2蔗糖 0.2mol/L0.20. 20.20.20.2 10 . 2 0.20 .20. 20. 2/加入蔗糖，立即搖勻開始計時,室溫準(zhǔn)確反應(yīng)1 0min后，立即加堿性銅試劑中止反應(yīng)。堿性銅試劑1. 01.

8、 01.01.01.0 1.0 1 .01.01 . 01.01. 0 1.0用保鮮膜封口，扎眼,沸水浴加熱8min，立即用自來水冷卻。磷鉬酸試劑1.01.01. 01.01.01. 01.0 1.01.01.01.0 1.0H 2 05. 05.05. 05. 05 .05 .05 . 05.05.05 .05. 0 5. 0A 6 50nmE = g mol/ m inml平均E g mo l /min - mlUnits/ml 原始組分稀釋后酶液的活力(按還原糖計算):EA650 0.2 2(卩 moles)A650 10 B min ml式中： A 6 5 0 第210管所測A 650

9、A 50第12管所測A 65 00 .2 第12管葡萄糖取樣量 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度 2mmol /L = 2 o 1 /ml1 0 反應(yīng) 10mi nB 每管加入酶液 ml數(shù)原始酶液的酶活力E(平均E/2)x稀釋倍數(shù)(Un it s / ml原始組分)八、計算各級分的比活力，純化倍數(shù)及回收率，并將數(shù)據(jù)列于下表：為了測定和計算下面純化表中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對于下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進(jìn)行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。酶的純化表如下：級分記錄 體積(ml)校正 體積(m l)蛋白質(zhì)(m g/m1 )總蛋白(mg)Un its /ml總

10、U nits比活U n its/ mg純化 倍數(shù)回收率%I1 . 0100n出w注:一個酶活力單位 Un i ts,是在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化1 mole蔗糖水 解所需的酶量，而水解1 mole蔗糖則生成2 mo l e s還原糖，計算時請注意。下面是對假定的各級分記錄體積進(jìn)行校正計算的方法和結(jié)果：級分記錄體積ml核正體積計算取樣體積ml校正后體積m 1I15151.51 5. 0 0n13. 513. 5X (15/ 13 .5)1 . 515. 00出55X (1 5 / 13 . 5)X (13 .5/ 12)1.56.25w66X (15/13.5) X (13 . 5/12)

11、 X (5/3. 5)10.7 1（四）反應(yīng)時間對產(chǎn)物形成的影響酶的動力學(xué)性質(zhì)分析，是酶學(xué)研究的重要方面。 下面將通過一系列實(shí)驗(yàn)， 研究P H、 溫度和不同的抑制劑對蔗糖酶活性的影響，測定蔗糖酶的最適pH、最適溫度、蔗糖酶催化反應(yīng)的活化能，測定米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax和各種抑制劑常數(shù) K】，由此 掌握酶動力學(xué)性質(zhì)分析的一般實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)是以蔗糖為底物，測定蔗糖酶與底物反應(yīng)的時間進(jìn)程曲線，即在酶反應(yīng)的最適條件下，每間隔一定的時間測定產(chǎn)物的生成量，然后以酶反應(yīng)時間為橫座標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱座標(biāo)，畫出酶反應(yīng)的時間進(jìn)程曲線，由該曲線可以看出，曲線的起始部分在某一段時間范圍內(nèi)呈直線，其斜率代表

12、酶反應(yīng)的初速度。隨著反應(yīng)時間的延長，曲線斜率不斷減小，說明反應(yīng)速度逐漸降低，這可能是因?yàn)榈孜餄舛冉档秃彤a(chǎn)物濃度增高而使逆反應(yīng)加強(qiáng) 等原因所致，因此測定準(zhǔn)確的酶活力，必須在進(jìn)程曲線的初速度時間范圍內(nèi)進(jìn)行，測定這一曲線和初速度的時間范圍，是酶動力學(xué)性質(zhì)分析中的組成部分和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法見“表2” ：0的第一管作空白對照，此10支試管是校正蔗糖的酸水解。用第11管作為對 用以計算第29各測定管所生成還原糖的1. 準(zhǔn)備1 2支試管，按“表2”進(jìn)行測定。用反應(yīng)時間為試管要先加堿性銅試劑后加酶。第 照，測定第12管葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)的光吸收值，“ moles”數(shù)。0. 25 mo les，全部反應(yīng)后可產(chǎn)生 0.

13、5 moles 20min內(nèi)基本反應(yīng)完。2. “表2”中底物蔗糖的量為每管的還原糖，所有的蔗糖和酶濃度應(yīng)使底物在3. 畫出生成的還原糖的m ol e s數(shù)（即產(chǎn)物濃度 moles/ml）與反應(yīng)時間的關(guān)系曲線 即反應(yīng)的時間進(jìn)程曲線，求出反應(yīng)的初速度。表2反應(yīng)時間對產(chǎn)物濃度的影響管數(shù)711 02311 1 24567892 . 5mmo 1/ L0.10.1 0.10.10. 10.1 0.1 0.1 0 . 1蔗糖0 .1/ /乙酸緩沖液0.2 0.2 0.20 .20 . 20 .2 0 .20 .2 0.20 .2/ /H2O0.40.40.40.40.40.40 . 40 .40. 40.

14、71 .00.8葡萄糖2mm ol/ / / / L/ 0. 2堿性銅試劑1.0/ / / / /由加酶開始計時蔗糖酶（1：5）0. 30 . 30.30. 30.30. 30.30.30.3/反應(yīng)時間 min0134812203040反應(yīng)到時后立即向“212”管加入1ml堿性銅試劑中止反應(yīng)堿性銅試劑/1. 0 1 .01.01. 01.0 1 . 01.0 1 . 01.01.0 1.0蓋薄膜,扎孔，沸水浴上煮8m i n后速冷磷鉬酸試劑1.01.0 1 .01.0 1.0 .1 .0 1.0 1.01.0 1.01 .01.0H 2 O5. 05.05.05. 05.05.05.05.05

15、. 05.05 .05.0測定A650生成還原糖的m o l es數(shù)（五 ）pH對蔗糖酶活動性的影響酶的生物學(xué)特性之一是它對酸堿度的敏感性，這表現(xiàn)在酶的活性和穩(wěn)定性易受環(huán)境pH的影響。p H對酶的活性的影響極為顯著，通常各種酶只在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的pH值下所表現(xiàn)的活性不同，其表現(xiàn)活性最高時的p H值稱為酶的 最適pH。各種酶在特定條件下都有它各自的最適pH。在進(jìn)行酶學(xué)研究時一般都要制作一條pH與酶活性的關(guān)系曲線，即保持其它條件恒定，在不同 pH條件下測定酶促反 應(yīng)速度，以pH值為橫座標(biāo)，反應(yīng)速度為縱座標(biāo)作圖。由此曲線，不僅可以了解反應(yīng)速度 隨pH值變化的情況，而且可

16、以求得酶的最適 PH。酶溶液pH值之所以會影響酶的活性，很可能是因?yàn)樗淖兞嗣富钚圆课挥嘘P(guān)基 團(tuán)的解離狀態(tài)，而酶只有處于一種特殊的解離形式時才具有活性，例如：H+HP KaiEH（有活性）P Ka2酶的活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離形式如果發(fā)生變化，都將使酶轉(zhuǎn)入“無活性”狀態(tài)。在最適P H時，酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適合于酶與底物的作用。此外，緩沖系統(tǒng) 的離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度也會對酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生影響。蔗糖酶有兩組離子化活性基團(tuán)，它們均影響酶水解蔗糖的能力。其解離常數(shù)分別是 P K a = 7 和 pK a =3 。實(shí)驗(yàn)方法：1. 按下表配制12種緩沖溶液（公用）：將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10

17、m l,其溶液pH值以酸度計測量值為準(zhǔn)。溶液pH緩沖試劑體積ml緩沖試劑體積m12.50. 2mol/L磷酸氫二 鈉2 .000 .2m ol/ L檸檬酸8 .003 .00. 2 mol/L磷酸氫二 鈉3.6 50.2mol/L檸檬酸6 .353.50 . 2 mol / L磷酸氫 二鈉4.8 50 .2m 0 l / L檸檬酸5.1 53. 50. 2m ol/L乙酸鈉0.6 00. 2m 0 l/ L 乙酸9. 404. 00 .2mol/L乙酸鈉1. 8 00.2 m ol/ L 乙酸8 .204. 50.2mol / L乙酸鈉4 . 300. 2m 0 l/ L 乙酸5. 7 05.

18、00.2mol/L乙酸鈉7.0 00.2mol /L 乙酸3.005.50 .2mo 1 /L乙酸鈉8 .800. 2 mol/L 乙酸1 .206.00.2m 0 1 / L乙酸鈉9. 500.2m 0 l/ L 乙酸0.506.00.2mol / L磷酸氫二鈉1.230 .2m ol/ L磷酸二氫鈉8.776. 50.2mol /L磷酸氫二鈉3.1 50.2m o1 /L磷酸二氫鈉6.857. 00 .2 m o 1 / L磷酸氫 二鈉6. 100.2 m ol/ L磷酸二氫鈉3.902. 準(zhǔn)備二組各12支試管，第一組1 2支試管每支都加入 0.2ml上表中相應(yīng)的緩沖液，然后加入一定量的蔗

19、糖酶（此時的蔗糖酶只能用H 20稀釋，酶的稀釋倍數(shù)和加入量要選擇適當(dāng)，以便在當(dāng)時的實(shí)驗(yàn)條件下能得到0.61 . 0的光吸收值（A6 5 0）。另一組12支試管也是每支都加入0.2ml上表中相應(yīng)的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時的空白對照管。所有的試管都用水補(bǔ)足到0.8ml。3. 所有的試管按一定時間間隔加入0.2ml蔗糖（0. 2mo 1/L ）開始反應(yīng)，反應(yīng)10min后分別加入1.0ml堿性銅試劑，用保鮮膜包住試管口并剌一小孔，在沸水浴中煮8 分鐘，取出速冷，分別加入1.0ml磷鉬酸試劑，反應(yīng)完畢后加入5 .0ml水，搖勻測定A 650。4 .本實(shí)驗(yàn)再準(zhǔn)備二支試管，一支

20、用水作空白對照；另一支作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管。5 .畫出不同pH下蔗糖酶活性（m oles/m i n ）與p H的關(guān)系曲線，注意畫出pH值相同，而離子不同的兩點(diǎn)，觀察不同離子對酶活性的影響。（六）溫度對酶活性的影響和反應(yīng)活化能的測定對溫度的敏感性是酶的又一個重要特性。溫度對酶的作用具有雙重影響 ，一方面溫度升高會加速酶反應(yīng)速度；另一方面又會加速酶蛋白的變性速度，因此，在較低的溫度范圍內(nèi),酶反應(yīng)速度隨溫度升高而增大，但是超過一定溫度后，反應(yīng)速度反而下降。酶反應(yīng)速度 達(dá)到最大時的溫度稱為酶反應(yīng)的最適溫度。如果保持其它反應(yīng)條件恒定，在一系列不同 的溫度下測定酶活力，即可得到溫度酶活性曲線，并得到酶反應(yīng)的最

21、適溫度。最適溫度不是一個恒定的數(shù)值，它與反應(yīng)條件有關(guān)。例如反應(yīng)時間延長，最適溫度將降低。大多數(shù)酶在60C以上變性失活，個別的酶可以耐100C左右的高溫。本實(shí)驗(yàn)除了測定蔗糖酶催化 蔗糖水解反應(yīng)的熱穩(wěn)定溫度范圍與最適溫度外，還可以同時測定反應(yīng)的活化能?；罨?越低，反應(yīng)速度就越快。酶作為催化劑可以大大降低反應(yīng)的活化能，從而大大增加反應(yīng)的速度。本實(shí)驗(yàn)除了測定蔗糖酶催化反應(yīng)的活化能外，還要測定酸催化這一反應(yīng)的活化能后者比前者要大的多，說明酸催化的能力遠(yuǎn)不及蔗糖酶?；罨芸捎冒⒗勰釣跛狗匠淌接嬎悖篒nk式中：Ea為話化能（Ca l/mo le ），k為反應(yīng)速度常數(shù)（mol e s/m i n），R為氣體

22、常數(shù)（1 .9 8 7Cal/d e g -m ol e ）,T為絕對溫度（C +273）, A為常數(shù)?？梢灾苯佑盟鶞y定的吸光度值或反應(yīng)速度v代替，進(jìn)（提示：蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反應(yīng)是一級本實(shí)驗(yàn)中的速度常數(shù)“ k”， 行作圖和計算，請對此進(jìn)行推導(dǎo)和論證 反應(yīng)）。實(shí)驗(yàn)方法：16個不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應(yīng)速度。本實(shí)驗(yàn)要測定 0C 100 C ,之間 這1 6個溫度是冰水浴的 0 C,室溫（約20 C ），沸水浴的1 0 0C和1 3個水浴溫度：1 0 C、 30C、40C、5 0C、55C、6 0C、65C、70C、7 5C、80C、85C、90C、9 5C。每個溫度準(zhǔn)備2支試管，一

23、支加酶，測酶催化,1支不加，以乙酸緩沖液作為酸，測酸 催化。1. 確定酶的稀釋倍數(shù)， 試管中加入0. 2ml 0.2mol/L pH 4.9的乙酸緩沖液，0 .2 m l稀釋的酶，加水至 0.8m l加入0.2ml0.2 mo 1/ L的蔗糖開始計時，在室溫下反應(yīng)10min，仍用費(fèi)林試劑法進(jìn)行測定 ，須得到0. 2 0 .3 A的吸光度，準(zhǔn)備一個水的空白 對照管（0.8ml去離子水加0.2ml 0. 2 mo 1 / L的蔗糖），用于測定所有的樣品管。2. 測定上列各個溫度下的反應(yīng)速度，每次用2支試管，均加入0.2ml乙酸緩沖液，一支加0.2m l酶,另一支不加酶，均用水調(diào)至0 .8ml，放入

24、水浴溫度下使反應(yīng)物平衡30秒，A650值，記錄每個水浴的準(zhǔn)確溫度。值均進(jìn)行酸催化的校正。用分別畫出酶催化和酸催化的反應(yīng)速n k 1/T的關(guān)系曲線，用二條Ink1/T關(guān)系曲線的線性部分計加入0.2 mo l/L蔗糖0.2ml，準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，立即加入1 .0ml堿性銅試劑中止反應(yīng)， 按規(guī)定進(jìn)行操作，測定各管E a =8 0 00 Ca 1/mole :Ea= 2 500 0 Ca l/mol e)0 C,反應(yīng)速度提高的倍數(shù)3. 酶催化的各管A 65 0 度對溫度的關(guān)系曲線和1 算兩種活化能。（文獻(xiàn)值：蔗糖酶催化蔗糖水解的活化能為：酸催化蔗糖水解的活化能為4. 計算溫度系數(shù)Q10，即溫度每升高1

25、V(T 10)k(T10)Q10望VtkT請推導(dǎo)計算公式：10 Ealn Q竹R T (T 10)（七）底物濃度對催化反應(yīng)速度的影響及來米氏常數(shù)Kn和最大反應(yīng)速度V max的測定根據(jù) Mic ha elis Men t en 方程:V max SKm x S：可以得到L i neweaver-Bur k雙倒數(shù)值線方程:KmV max1 1C S： V max在1/V測定Km縱軸上的截距是 和 V ma X,1/V max，在1 /xs :橫軸上的截距是 -1/Km。特別是測定 K n,是酶學(xué)研究的基本內(nèi)容之一，K m是酶的一個基本的特性常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)，特別是同一種酶能夠

26、作用于幾種不 同的底物時，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力強(qiáng)弱,Km值越大，說明酶與底物的親和力越弱，反之,K m值越小，酶與底物的親和力越強(qiáng)。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛，其優(yōu)點(diǎn)是：可以精確地測定K m和V max; 根據(jù)是否偏離線性很容易看出反應(yīng)是否違反M i cha e l i s-M e nt e n動力學(xué)； 可以較容易c haeli s -Me nt en方程改變?yōu)椋旱胤治龈鞣N抑制劑的影響。此作法的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)點(diǎn)不均勻，V小時誤差很大。為此，建 議采用一種新的 Eisenth a l直線作圖法，即將MiKmVV max V C S：1 S 1 ; V 2S2；V 3 S 3；作

27、圖時，在縱軸和橫軸上截取每對實(shí)驗(yàn)值：V 連接諸二截點(diǎn)，得多條直線相交于一點(diǎn)，由此點(diǎn)即可得Km和Vmax。此作圖法的優(yōu)點(diǎn)是： 不用作雙倒數(shù)計算； 很容易識別出那些不正確的測定結(jié) 果。還可以用H a nes方程進(jìn)行作圖，斜率是1/Vmax ,截距分別是一 Km和K m/ VmaCS：VKmV max丄S：V max實(shí)驗(yàn)方法：本實(shí)驗(yàn)和下一個實(shí)驗(yàn)均采用頁的N e Iso ns法分析反應(yīng)產(chǎn)物還原糖，N el so ns法的 “試劑配制方法”。因?yàn)槭褂昧藙《舅幤?，操作必須?.試劑配制見本實(shí)驗(yàn)最后第分仔細(xì)小心！為了掌握N e Isons法測定的范圍，可先作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。按下面的“表3” 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作：E

28、is en thal直線作圖法：表3 Nelson 法測定葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖(4mm 0 I / L)果糖(4mm ol/L)蔗糖(4 m mol/ L )H 20Nels o n試齊y砷試劑H2O每管中糖的 m ol es數(shù)A 510/0.20/0.020. 0 50.100 .150 .200. 250. 30/貢1.0-00.8 01.0/*095_0900.85_0.8 00.757 00.80蓋薄膜，扎孔，沸水浴中煮20m in后速冷1.07.0充分混合，除氣泡，放置5m in旋渦混合器上充分混合用第1管作空白對照，測定其余各管510nm的吸光度A510。用A 510值對還原糖的

29、mol e數(shù)作圖。2.按下面的“表4”測定不同底物濃度對催化速度的影響。（表4見下頁）為使K m測準(zhǔn),必須先加蔗糖，精確移液，準(zhǔn)確計時，每隔3 0秒鐘 或1分鐘加酶一 次，加酶后要搖動一下試管，每支試管都要保證準(zhǔn)確反應(yīng)1 0分鐘撚后加1.0ml N e lsons試劑，立即用保鮮膜蓋住管口，繞上橡皮筋，用針剌一小孔，幾根試管用一根橡皮筋套住放入沸水浴，煮2 0分鐘后取出放入冷水中速冷。加砷試劑時移液管身不要接觸試管壁。最后加7.0ml H2O以后，要充分搖勻，必要時可用一小塊保鮮膜蓋住管口，反復(fù)倒轉(zhuǎn)試管,混勻。用塑料比色杯測定時，空白對照管溶液必須充分搖勻，徹底除去氣泡，測 A51 0值時要檢

30、查參比杯內(nèi)壁上是否有氣泡，若有，須倒回原試管，再搖動除去殘余氣泡。實(shí)驗(yàn)中不允許用嘴吸砷試劑。實(shí)驗(yàn)完畢后要注意洗手。3. 第9、10二管是先加中止反應(yīng)的N e l s on s試劑，后加酶，以保證加酶后不再產(chǎn)生任何還原糖，用以校正蔗糖試劑本身的水解和酸水解。用第9、10二管的數(shù)據(jù)畫一直線，求出其他各管的校正數(shù)據(jù)，對所測各管的A510值進(jìn)行校正，然后計算每管的S,1/ S ,V 和 1/V。4. 畫出反應(yīng)速度 V與底物濃度S的關(guān)系圖，（米氏曲線）和1/V1 / : S雙倒數(shù)關(guān) 系圖，（不要直接用A51 0值作圖），計算Km和Vma X,并與文獻(xiàn)值進(jìn)行比較。管數(shù)7123410 1 1 1 25678

31、90 .5mol/L蔗糖/0.020.030.040.0 60/ /.08 0 .1 00 .200.100 .2 0H 200. 6 0.5 80.570. 5 61 .0 0. 80.540 . 520 .500.400.500.40乙酸 緩沖液0 .2 0. 2 0.2 0.2/ /0.20.2 0. 20. 20.20.2Nel S on試劑/ / / /1. 0 / / /1.0*蔗糖酶0. 2 0.2 0.2 0.20. 2 / /0. 20.2 0. 20 .20 .2葡萄糖4mmol / L/ / / / 0. 2/ /由加酶開始準(zhǔn)確計時，反應(yīng)10min。Nels on 試劑1

32、 .0 1.0 1.0 1 .0/ 1.0 1.01.0 1.0 1.01.0/蓋薄膜，扎孔，沸水浴中煮20 min后速冷砷試劑1.0 1.0 1. 0 1. 01 .0 1.0 1.01 .01. 0 1. 01 .01.0充分混合,除氣泡，放置5m inH 207. 07 .07.07.7 .07. 07. 07.007.07.07.07. 0旋渦混合器上充分混合A 51 0校正值校正后A 510:S：1/S:V1/V表4底物濃度對酶催化反應(yīng)速度的影響（K m和Vma x測定表）* :表4中酶的稀釋倍數(shù)需仔細(xì)試測，使第2管的A 510值達(dá)到0. 20.3，以便能同時適用于下面的脲抑制實(shí)驗(yàn)。

33、催化反應(yīng)速度的計算：A5i0（校正）0.2 4A51O 10 2V :Ao :0.2 X 4 :1 0 :2 :每m I反應(yīng)液，每m in消耗掉的蔗糖底物的ol數(shù) 第1 2管的吸光度值，以11管為參比4卩mo 1/ ml葡萄糖取0 .2ml反應(yīng)10mi n每卩mo l蔗糖水解成2卩mol還原糖（八）尿素（脲）抑制蔗糖酶的實(shí)驗(yàn)抑制劑與酶的活性部位結(jié)合，改變了酶活性部位的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)，引起酶活力下降。根 據(jù)抑制劑與酶給合的特點(diǎn)可分為可逆與不可逆抑制劑?？赡嬉种苿┡c酶是通過共價健結(jié)合，不能用透析等物理方法解除。這二種抑制劑類型可以通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判斷。實(shí)驗(yàn)方法為：在固定抑制濃度的情況下，用一系列不同濃度的

34、酶與抑制劑結(jié)合，并測定反應(yīng)速度。以 反應(yīng)速度對酶濃度作圖，根據(jù)曲線的特征即可判斷之。如下圖所示：在可逆抑制類型中可分為競爭性抑制，非競爭性抑制和反競爭性抑制三種：1. 競爭性抑制：在競爭性抑制中，酶既可以與底物結(jié)合，又可以與抑制劑結(jié)合，但卻不能與二者同時 結(jié)合，即有ES和EI，而不存在E SI。其動力學(xué)特征是表觀值K m增加，而最大反應(yīng)速度 V max不變，公式為：V maxSViKm(1 欝S表觀米氏常數(shù)K m為:Km Km(1 欝Km 已知抑制劑濃度I，由斜率計算出抑制劑常數(shù) Ki,即可算出表觀米氏常數(shù)2. 非競爭性抑制：在非競爭性抑制中，酶可以與底物和抑制劑同時結(jié)合，形成EI S,但E

35、IS不能進(jìn)步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。其動力學(xué)特征是Vmax降低而Km不變，公式為：V max SVI(1 曲(Km S)表觀最大反應(yīng)速度V max為:V max 1V maxKi已知I,由斜率計算出Ki,即可計算出表觀V 實(shí)驗(yàn)方法：1.判斷可逆與不可逆抑制的實(shí)驗(yàn)可選做。2.不含抑制劑（脲）的實(shí)驗(yàn)，可用實(shí)驗(yàn)（七）的數(shù)據(jù) 也可以重做，注意酶濃度要大些。3.含脲抑制劑的實(shí)驗(yàn)可參照“表 驗(yàn)，即分別為加4m 0 l/L的脲0.少加 H2O 0.1m 1、0. 2m 1和兩管仍為校正酸水解。第4 ”設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案。10m 1、0. 2 0 ml4.畫出反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系圖，和1/ 和相應(yīng)的表觀值，討論脲對蔗糖酶活性的影響。，但必須是用同一稀釋倍數(shù)的酶共做三種抑制劑濃度I的實(shí)和0.3 0 ml,（注意：此時要分別0 .