分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義(最終版)

1、精品文檔分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆與鑒定、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉和了解目的基因克隆與鑒定的過程和方法。2、學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒、T載體的特點(diǎn)。3、學(xué)習(xí)和掌握TA克隆的連接體系及操作要點(diǎn)。4、學(xué)習(xí)和掌握Xcml酶切制備T載體的過程及方法。5、學(xué)習(xí)和掌握 CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法。6、學(xué)習(xí)并掌握熱激法轉(zhuǎn)化技術(shù)的原理和操作步驟。7、學(xué)習(xí)并掌握重組子鑒定和篩選的原理及藍(lán)白篩選的原理和方法。8、學(xué)習(xí)并掌握堿法小量制備質(zhì)粒DNA的原理及操作步驟。、相關(guān)知識(shí)（一）T載體的制備pMD18-T Vector是一種高效克隆 PCR

2、產(chǎn)物（T-A Cloning）的商業(yè)化專用載體，由 pMC 18載體改建 而成。在pMC 18多克隆位點(diǎn)處的 Xbal和Sal I識(shí)別位點(diǎn)之間插入了 EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，用 EcoRV進(jìn)行 酶切反應(yīng)后，再左兩側(cè)的 3'端添加" T'而成，可以大大提高 PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。相關(guān)知識(shí)點(diǎn)：（1）質(zhì)粒的提??；（2）酶切；（3） PCR等。（二）DNA的重組與連接（PCR產(chǎn)物的克?。┌袲NA片段從某一類型的載體無性繁殖到另一類型載體中，例如從某種質(zhì)?？寺〉搅硪环N質(zhì)粒， 這個(gè)過程稱為亞克隆。所謂重組，就是把外源目的基因裝進(jìn)”載體的過程，即DNA的重新組合。為了將目的基因重

3、組于載體分子中，需要將載體DNA和目的基因分別進(jìn)行適當(dāng)處理，一般采用內(nèi)切酶法將載體DNA分子切割成可與外源基因連接的線性分子，使其與相同酶切過的載體分子相互連接，彼此成為配伍 末端（compatible end）,以產(chǎn)生末端連接?，F(xiàn)在一些生物公司也開發(fā)了針對(duì)不同插入DNA片段的專用載體，如專門用于克隆 PCR產(chǎn)物的載體，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。相關(guān)知識(shí)點(diǎn)：（1）克隆與亞克隆；（2） DNA重組；（3）內(nèi)切酶；（4）粘性末端與平末端；（5）連接 酶；（6）連接酶的分類及功能等。（三）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備外源基因與載體在體外連接成重組體DNA分子后，需將其導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，得到大量、單一

4、的重組體分子，這就是外源基因的無性繁殖，或稱為克隆。受體細(xì)胞也叫宿主細(xì)胞，大腸桿菌 宿主菌是目前基因工程最常用的受體細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞（ competent cell）是經(jīng)過一定方法處理后，具有 接受外源DNA能力的大腸桿菌，只有發(fā)展了感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定地?cái)z取外來的DNA分子。相關(guān)知識(shí)點(diǎn)：（1）克??；（2）宿主細(xì)胞的定義及分類；（3）感受態(tài)細(xì)胞定義及其功能；（4）轉(zhuǎn)化定義及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。（四）重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。把重組DNA分子導(dǎo)入到細(xì)菌中產(chǎn)生克隆有兩個(gè)目的，一是大量產(chǎn)生重組 DNA分子，在完成連接

5、反應(yīng)后，重組 DNA分子往往只有納克級(jí)的量，不易 操作和進(jìn)行下一步的分析，若把重組DNA分子導(dǎo)入到細(xì)菌細(xì)胞中，細(xì)菌細(xì)胞可分裂多次產(chǎn)生克隆，克隆中每一個(gè)細(xì)胞都含有很多個(gè)拷貝的重組DNA分子，這樣重組 DNA分子的量就多了；二是對(duì)重組DNA分子進(jìn)行純化，在構(gòu)建重組 DNA分子的過程中很難保證體系中不污染其他的DNA分子，連接過程完成以后體系中有多種分子存在，除了需要的重組DNA分子以外，還含有沒有連接上的載體分子、沒有連接上的DNA片段、自身環(huán)化的 DNA分子和連接上污染 DNA片段的重組 DNA分子，未連接上的載體和 DNA片段對(duì)實(shí)驗(yàn)影響不大，因?yàn)樗鼈兗词箤?dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，因?yàn)椴荒軓?fù)制，很快就要被細(xì)

6、菌細(xì)胞中的酶降 解掉；對(duì)克隆工作帶來影響的是后兩種分子，因?yàn)樗鼈兌紴榄h(huán)狀，在細(xì)菌細(xì)胞中都能復(fù)制，因而都能產(chǎn) 生克隆，但是每個(gè)細(xì)胞中只能導(dǎo)入一個(gè)質(zhì)粒DNA分子，每個(gè)單克隆都是由一個(gè)細(xì)胞形成的，因此在每個(gè)克隆中所有的細(xì)胞都只含有同一種質(zhì)粒。所以只要對(duì)不同的克隆進(jìn)行篩選，就可以鑒定所需的重組DNA分子。所謂的重組子(recombinant)也叫做轉(zhuǎn)化子(transformant)是指吸收了重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將重組子從其它細(xì)胞群中(如上面提到的對(duì)克隆影響較大的自身環(huán)化的DNA分子和連接上污染 DNA片段)分離出來，并鑒定無性繁殖的外源基因確實(shí)為目的基因，這過程稱為篩選(screening)。

7、根據(jù)載體體系、宿主細(xì)胞的特性以及外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)情況的不同，初步把篩選方法分為直接篩選和間接篩 選，直接篩選法又可進(jìn)一步分為 DNA鑒定篩選法、選擇性載體篩選法、分子雜交選擇法；間接篩選也可以進(jìn)一步分為免疫學(xué)方法、mRNA翻譯檢測(cè)法；本試驗(yàn)采用平板篩選法中的藍(lán)白篩選法。質(zhì)粒(plasmid) 噬菌體(phage)2.5kvgeneblaster相關(guān)知識(shí)點(diǎn):，轉(zhuǎn)化(transformation )轉(zhuǎn)染(transinjection)顯影注射(1)導(dǎo)入的方法,電轉(zhuǎn)化基因槍 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 堪它方法：快速冷凍法、碳化硅纖維介導(dǎo)法(2)重組子：轉(zhuǎn)化子(3)重組反應(yīng)體系中的成分：(4)篩選的方法DN

8、A鑒定篩選法：定位、測(cè)序直接篩選法選擇性載體篩選法：入pha裹、抗藥性生互補(bǔ)分子雜交篩選法：ISH、Southern Blot免疫化學(xué)免疫學(xué)方法J間接篩選法J酶免疫檢測(cè)mRNA翻譯檢測(cè)法(五)質(zhì)粒DNA的提取(堿裂解法)原核生物沒有真正的細(xì)胞核， DNA 一般位于一個(gè)類似核”的結(jié)構(gòu)一一稱為類核體上(因?yàn)椴皇且粋€(gè)完整的細(xì)胞核)。E.coli的遺傳物質(zhì)主要是染色體DNA , E.coli的染色體為雙股環(huán)狀DNA ,含有1 400個(gè)以上的基因，另外還有一些質(zhì)粒DNA。1、質(zhì)粒的概念質(zhì)粒是細(xì)菌(如 E.coli)染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。一般說來，質(zhì)粒不是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所精品文檔 必須的結(jié)構(gòu)，就

9、細(xì)胞生存而言，質(zhì)粒是可有可無的。質(zhì)粒分子本身含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)，故能在細(xì) 菌內(nèi)獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)恒定地遺傳給子代細(xì)胞。2、研究質(zhì)粒的意義(1)質(zhì)粒作為一種裸露的，比病毒更簡(jiǎn)單、更有自主復(fù)制能力的 DNA分子，正好處于生命與非生 命的分水嶺上。由于質(zhì)粒能夠復(fù)制、能夠傳遞、能夠表達(dá)其遺傳信息，說明質(zhì)粒是獨(dú)立的有機(jī)體，是亞 細(xì)胞生命體系的成員，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命形態(tài)，所以質(zhì)粒是研究生命起源的一塊重要的基石。(2)要把一個(gè)有用的基因通過基因工程手段送進(jìn)生物細(xì)胞中，需要運(yùn)載工具。攜帶外源基因進(jìn)入受 體細(xì)胞的這種工具叫載體。由于質(zhì)粒具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力，因此，質(zhì)粒作為基因工程

10、的重要 運(yùn)載工具，在現(xiàn)代分子生物學(xué)占有重要地位。3、質(zhì)粒的分類不同的質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的拷數(shù)也不同，卞據(jù)質(zhì)粒在細(xì)胞中拷貝數(shù)的多少，Rownd (1969)把質(zhì)粒分為嚴(yán)密型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒。(1)嚴(yán)密型質(zhì)粒(stringent plasmid)：嚴(yán)密型質(zhì)粒多半是一些具有自身傳遞能力的大質(zhì)粒，其 DNA 的復(fù)制與宿主染色體 DNA的復(fù)制相偶聯(lián)，受到某種程度的控制，每個(gè)細(xì)胞僅有1-2個(gè)拷貝。(2)松馳型質(zhì)粒(relaxed plasmid)：松馳型質(zhì)粒多半是分子量較小、不具傳遞能力的質(zhì)粒，其復(fù)制 是在松馳控制下進(jìn)行的，每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)約為10200個(gè)。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入氯霉素時(shí)，細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成被抑制，

11、細(xì)胞染色體DNA和嚴(yán)密型質(zhì)粒 DNA的復(fù)制停止，松馳型質(zhì)粒 DNA的復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行。松馳型質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)可達(dá)數(shù)百個(gè)，基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒。相關(guān)知識(shí)點(diǎn)：(1)質(zhì)粒的分類：與宿主相關(guān)程度：嚴(yán)密型質(zhì)粒( stringent plasmid)、松弛型質(zhì)粒(relaxed)是否有轉(zhuǎn)移基因：接合型質(zhì)粒、非接合型質(zhì)粒帶有特殊用途的基因：生殖質(zhì)粒(F質(zhì)粒)、抗性質(zhì)粒(R-質(zhì)粒)、col質(zhì)粒(編碼殺死其他細(xì)菌的蛋白質(zhì))、降解質(zhì)粒、致病質(zhì)粒(Ti)(2)質(zhì)粒的提取方法：煮沸法、CsCl、試劑盒、堿裂解法；(3)質(zhì)粒的構(gòu)型：OSC 構(gòu)型：cccDNA (covalently closed circl

12、e DNA)LOC 構(gòu)型：ocDNA (open circle DNA)S L 構(gòu)型：L-DNA (linearDNA)精品文檔三、實(shí)驗(yàn)原理（一）T載體的制備I-vector3*TCTATCTA TAXcm I是一種出型的限制性核酸內(nèi)切酶，其識(shí)別序列為：5-CCANNNNN ANNNNTGG- 3'3 -GGTNNNN ANNNNNACC-5其中陰影部分為Xcml的識(shí)別序列，“人為Xcmi的切割位點(diǎn)，其識(shí)別序列中間的9個(gè)任意核甘酸（N）Xcml酶切后3'末端士是T的載體，本實(shí)驗(yàn)利XXcm I的酶切特異性及酶切效率沒有影響。為了能得到用用了Xcm I的識(shí)別序列的特點(diǎn)，引物的 3端

13、帶有Xcml酶切位點(diǎn)，其序列如下:Primeri : 5 -CGCCCATGCTAAGCGCTGGTAAT - 3'Primer2 : 3- TCTCTAAGGTA TGCAATATGACCCGC - 5'引物中“人為Xcml的切割位點(diǎn)，當(dāng)Xcml對(duì)PCR得到的線性片段進(jìn)行酶切的時(shí)候，便會(huì)產(chǎn)生一個(gè)與T載體形式完全一樣的3'-T粘性末端。（二）DNA的重組與連接（PCR產(chǎn)物的克?。?988年，Clarke發(fā)現(xiàn)所有的PCR產(chǎn)物都在Taq DNA聚合酶的作用下在 3端附加上了一個(gè) 3突出的 腺甘酸，因?yàn)門aq DNA聚合酶具有非模板介導(dǎo)的核甘酸轉(zhuǎn)移酶活性，可在雙鏈DNA末端加

14、上一個(gè)單一的3突出的dATP,利用Taq DNA聚合酶的這一特性，在克隆載體上附加3胸腺喀咤（dTTP）形成T-A克隆系統(tǒng)，即可直接對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效的克隆，這樣的載體稱為T-載體。（三）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備技術(shù)是從20世紀(jì)70年代初期發(fā)展起來的，當(dāng)時(shí)人們發(fā)現(xiàn)如果把E.coli細(xì)胞浸在一冰冷的鹽溶液，它吸收 DNA分子的能力要比不浸的細(xì)胞強(qiáng)；經(jīng)過摸索和總結(jié)，人們終于采用 50 mmol/L的氯化鈣（CaCl2）溶液來制備感受態(tài)細(xì)胞。其他的鹽（如氯化鋤 RbCl）也很有效。盡管對(duì)這 一處理的確切機(jī)制仍不清楚，但有人對(duì)感受態(tài)提出了兩種假說，一種認(rèn)為是細(xì)菌細(xì)胞壁的局部

15、失去了壁 結(jié)構(gòu)或局部溶解，讓外源DNA分子通過質(zhì)膜進(jìn)入；另一種認(rèn)為 DNA分子能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞是由于細(xì)胞處于感受態(tài)時(shí)表面形成了一種可接受DNA的酶位點(diǎn)。一旦細(xì)胞被處理制備成感受態(tài)細(xì)胞，它們就能穩(wěn)定地?cái)z取外源DNA分子了。（四）重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定轉(zhuǎn)化是使重組體 DNA分子在熱休克的短暫時(shí)間內(nèi)被導(dǎo)入受體。一般認(rèn)為DNA分子在轉(zhuǎn)化過程中將經(jīng)歷四個(gè)階段，第一個(gè)階段是吸附階段，完整的雙鏈 DNA分子將吸附于感受態(tài)細(xì)胞的表面；第二個(gè)階段 為轉(zhuǎn)入階段，雙鏈 DNA分子解鏈，以單鏈的形式進(jìn)入細(xì)胞，而另一鏈則被降解；第三階段是自身穩(wěn)定階 段，外源質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA;第四個(gè)階段是表達(dá)階段

16、，即目的基因隨同質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制。有些株系的E.coli盡管用抗生素抗性基因的插入失活法來篩選重組子很方便，但有的質(zhì)粒還是采用 了其他基因進(jìn)行篩選，效果同樣不錯(cuò)。以pMC 8載體為例，它除了含有氨茉青霉抗性基因以外，還含有一個(gè)稱為L(zhǎng)acZ，的基因。該基因編碼3半乳糖昔酶的一部分。 半乳糖甘酶參與的將乳糖分解成葡萄糖和半 乳糖的生化過程，本來是由E.coli染色體上的LacZ基因編碼。有些株系的E.coli帶有修飾過的LacZ基因（即缺少LacZ，的LacZ基因），只編碼3半乳糖昔酶的“-肽。這些株系的E.coli細(xì)胞只在有吸收了像 pMC 8這樣帶有LacZ基因的質(zhì)粒分子的情況下才能夠合成

17、完整的3半乳糖甘酶。因此在篩選pMC 8的重組子時(shí)，先將轉(zhuǎn)化子涂布于含有氨節(jié)霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后再通過檢測(cè)3半乳糖昔酶的活性來選擇重組子，既能抗氨茉霉素，又能合成伊半乳糖甘酶的細(xì)胞就是重組子細(xì)胞?，F(xiàn)代化學(xué)的發(fā)展給我們提供了非常直接地檢測(cè)3半乳糖甘酶活性的方法，這種方法涉及一種乳糖的類似物一一5-澳-4-氯-3-口引喋-&D-口比喃半孚L糖昔（5-bromo-4-chLoro-3-indoLyL- 3-D-galactopyranoside ）,因?yàn)樗挠⑽拿L(zhǎng)， 所以人們就用 X-gal 來代替它的長(zhǎng)名。3半乳糖甘酶可以將 X-gal分解成一種深藍(lán)色的產(chǎn)物，這個(gè)反應(yīng)是很靈敏的。當(dāng)

18、帶有 氨茉青霉素的培養(yǎng)基中加有X-gal及一種 伊半乳糖甘酶的誘導(dǎo)物 （異丙基-&D-硫代半乳糖昔，IPTG）時(shí)，那些能合成完整，半乳糖昔酶的未重組克隆就會(huì)因它能酶解X-gal而變成深藍(lán)色，而重組子因LacZ，基因被破壞不能合成完整的伊半乳糖甘酶而呈白色，藍(lán)白分明，重組子的篩選也已涇渭分明。E.coli修飾過的pUC系列質(zhì)粒多LacZ基因修飾的LacZ基因（缺少LacZ'基因）3半乳糖昔酶C末端Q肽3半乳糖昔酶N末端”-肽完整的伊半乳糖昔酶 J Xgal/IPTG 深藍(lán)色(五)質(zhì)粒DNA的提取(堿裂解法)堿裂解法是一種用得最廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是當(dāng)今分子生物學(xué)研究中的常

19、規(guī)作法。堿變性法抽提質(zhì)粒 DNA是基于染色體 DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的，當(dāng)細(xì)胞在有 NaOH和SDS (十六烷基磺酸鈉)的溶液H中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與染色體、RNA、DNA發(fā)生變性，加入中和液醋酸鉀溶液出后，溶液變成中性，質(zhì)粒 DNA復(fù)性，質(zhì)粒DNA以原來的構(gòu)型保存在原溶液中，進(jìn)行 離心，蛋白質(zhì)與染色體 DNA隨細(xì)胞碎片沉淀下來，質(zhì)粒DNA則留在上清液中。這種方法主要用于從小量培養(yǎng)物或同時(shí)從許多細(xì)胞克隆中進(jìn)行DNA提取，比較方便和省時(shí)，該法提取的DNA純度較高，不需進(jìn)一步純化即可滿足測(cè)序、PCR等。(1) Solution I :破壞細(xì)胞壁。(2) Solution n

20、：高pH值，SDS使宿主染色體 DNA和蛋白質(zhì)變性。(3) Solution出：乙酸鉀中和質(zhì)粒 DNA復(fù)性、染色體 DNA不復(fù)性，仍和變形蛋白質(zhì)纏繞成大的復(fù) 合物。四、實(shí)驗(yàn)過程(一)T載體的制備1、pYCQI載體的質(zhì)粒提取(1)挑取含有質(zhì)粒pBI121的大腸桿菌單菌落，接種于 50mL LB (含Amp抗生素60科g/mD液體培 養(yǎng)基中，37C, 180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜(約 12-14h)。(2)取適量培養(yǎng)物加入離心管中，室溫 8 000 r/min離心4 min,棄上清，收集菌體。(3)將100dL預(yù)冷的溶液I加入到離心管中，在旋渦混合器上劇烈振蕩，使菌體分散混勻。(4)加入溶液II

21、 (1%SDS 100iL , 0.2 mol/L NaOH 100科D ,快速顛倒10次混勻(不要?jiǎng)×艺袷?。(5)加入150。預(yù)冷的溶液III,將管緩慢顛倒數(shù)次混勻并冰上放置5min后，4C 12 000 r/min,離心 4min。(6)少量多次吸取上清轉(zhuǎn)移至新管，小心不要引入白色的蛋白質(zhì)污染。(7)加入400姓預(yù)冷的苯酚氯仿異戊醇 (25: 24: 1),上下顛倒，去除蛋白質(zhì)，4C 12 000 r/min離 心 5min。(8)小心移出上清于一新 1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后冰置10min,以沉淀質(zhì)粒 DNA 。 4 c 12 000 r/min 離心 3min

22、。（9）棄上清，用200 dL預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心3min ,去上清，濾紙吸干多余 液體，固體在室溫下放置無乙醇味。（10）獲得的質(zhì)粒載體 pYCQI沉淀溶于25pLddH20, -20C保存?zhèn)溆谩?、PCR擴(kuò)增反應(yīng)取一支0.2mLPCR管，冰上建立 PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)液按表1進(jìn)行配制。表1 pYCQ1載體的PCR反應(yīng)體系Ex Taq Buffer2.5 LddH2O17.5 妙dNTP (2.5mmol/L)1.5 心 LP1 (10 pmol/L )1.0妙P2 (10 pmol/L )1.0妙模板（質(zhì)粒載體 pYCQ1 ）1.0妙Ex Taq 酶

23、0.5妙Total Volume25L擴(kuò)增程序：94 c 2min； 94 c 0.5min, 5060 c 0.5min, 72 c 1.5min , 30 個(gè)循環(huán)；72 c 4min, 4 C 保存。3、XcmI單酶切PCR產(chǎn)物取一支0.2mLPCR管，冰上建立酶切反應(yīng)體系，酶切反應(yīng)液按表2進(jìn)行配制。表2 Xcm I酶切反應(yīng)體系Xcm I Buffer2.5 LPCR打增產(chǎn)物16.5 妙Xcm I0.5LddH2O5.5 LTotal Volume25L加封口膜后才可放入水浴鍋中，37c水浴2.5h。酶切后，65c水浴10min終止酶切反應(yīng)。（二）DNA的重組與連接（PCR產(chǎn)物的克?。?、

24、與PCR產(chǎn)物連接取一支0.2mLPCR管，冰上建立連接反應(yīng)體系，連接反應(yīng)液按表3進(jìn)行配制，16c水浴1h。表3連接反應(yīng)體系成分用量10 x T4 DNA Ligase Buffer1.0ddH2O2.0 始BvM14-glyI 基因5.0載體(Xcm I酶切產(chǎn)物)1.0T4 DNA Ligase1.0 始Total Volume10L(三)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備5、DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)從37c培養(yǎng)的平板中挑取一個(gè) DH&單菌落，接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37c 180 r/min 振蕩過夜。(2)次日按1%的量(500葭)接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37c18

25、0 r/min振蕩培養(yǎng)1h 40min。(3)將菌液分裝于10mL離心管中，4 000 r/min 4 c離心5min ,去上清，收集菌體，加入 5mL預(yù)冷 的0.lmol/L CaCl 2。輕輕懸浮沉淀，置冰上 30min。(4) 4 000 r/min離心5min ,去上清，加入 1mL預(yù)冷的0.1 mol/LCaCI 2,輕輕懸浮沉淀。(5)進(jìn)行分裝，每一個(gè) 1.5mL離心管中加約200dL的感受態(tài)細(xì)胞，4c保存?zhèn)溆谩?四)重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定6、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細(xì)胞(5) 10 dL連接產(chǎn)物和200 dL感受態(tài)細(xì)胞在無菌條件下混勻，冰置 30min。(6) 42c

26、水浴熱激90s,立即放置冰上 90s。(3)加入890 dL已預(yù)熱至37c的SOC液體培養(yǎng)基，37c擴(kuò)培，180 r/min振蕩l h。(4)振蕩培養(yǎng)后，將菌液按不同梯度的量涂布于含有X-ga l(40pL)、IPTG (4姓)的LB (Amp 60科g/mL)平板。(5)待菌體吸附后(約15min),倒置于37 C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜(約14-16h),觀察菌落顏色，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。(6)挑取重組菌落，接種至 1.5mL離心管(含1mL LB+Amp液體培養(yǎng)基)中，擴(kuò)培備用。(五)質(zhì)粒DNA的提取(堿裂解法)(1)步驟同(一)中的質(zhì)粒的提取步驟。(2)將提取的質(zhì)粒進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，

27、電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)拍照，檢測(cè)重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。五、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)（一）T載體的制備、DNA的重組與連接（PCR產(chǎn)物的克?。┮?yàn)楸驹囼?yàn)使用的載體為 T載體，所以不需要插入片段與載體的同時(shí)酶切。如果需要在酶切反應(yīng)之 后再進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，應(yīng)注意以下兩點(diǎn)：（1）限制性內(nèi)切酶未能完全被滅活，使用乙醇沉淀可避免這一問題的發(fā)生。（2） DNA樣品中混有可影響連接活性的雜質(zhì)，酶解后的DNA直接用于連接時(shí)而不經(jīng)過乙醇沉淀重溶于無菌蒸儲(chǔ)水中時(shí)常常會(huì)碰到這種問題。（二）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1、商品化的感受態(tài)細(xì)胞有 PH 525、JB 101、Top 10、DH 5-2。2、對(duì)所用試劑如 CaCl2的要求很高，

28、要注意質(zhì)量與濃度。3、用CaC2法制備的感受態(tài)細(xì)胞在4c放置過夜后感受態(tài)效率提高。4、感受態(tài)細(xì)胞對(duì)凍融非常敏感?；瘍龅募?xì)胞不應(yīng)重復(fù)冷凍，如果冰箱出了故障則應(yīng)棄去并重新制備。（三）重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定1、通常藍(lán)色顯色不太完全，可以將平板置于冰箱中放置過夜使顏色變深。2、實(shí)驗(yàn)中應(yīng)作對(duì)照，通常對(duì)照是取部分感受態(tài)細(xì)胞，用未酶解的載體質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，應(yīng)該得到一塊 長(zhǎng)滿藍(lán)色克隆的平板，證明感受態(tài)細(xì)胞是好的。3、除對(duì)照外，如果其他板上一個(gè)菌落也沒有。出現(xiàn)這種問題的原因可能是連接酶失活，應(yīng)當(dāng)更換。4、平板上的菌長(zhǎng)成菌苔狀，出現(xiàn)這種情況可能有如下兩個(gè)原因：（1）對(duì)未轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞缺乏選擇壓力，使

29、它們同轉(zhuǎn)化細(xì)胞一起生長(zhǎng)，其原因是平板中缺乏抗生素或抗生素活性較低，在培養(yǎng)基未能充份冷卻時(shí)即加入抗生素可能導(dǎo)致抗生素部分失活。（2） E.coli菌株可能獲得了含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒。這時(shí)應(yīng)使用新鮮氨茉青霉素重新配制LB平板，同時(shí)配制不含抗生素的平板，將貯存的細(xì)菌分別涂在兩種平板上，若該菌株能在含有氨茉青霉素的平板上生長(zhǎng)，則說明該菌獲得了某個(gè)質(zhì)粒，應(yīng)棄之，并 且制備新鮮菌；若細(xì)菌在不含抗生素的平板上生長(zhǎng)，在含氨茉青霉素的平板上不能生長(zhǎng)，則說明在轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn)中所使用的平板或者沒加抗生素，或者抗生素濃度不夠。（五）質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）加入溶液H進(jìn)行蛋白質(zhì)的變性過程中要記住兩點(diǎn)：（1）時(shí)間不能

30、過長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA的斷裂會(huì)慢慢斷裂；（2）必須溫柔混合，不然基因組 DNA也會(huì)斷裂，這樣會(huì)帶來很多麻煩。六、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材1、實(shí)驗(yàn)儀器：水浴鍋、搖床、高壓滅菌鍋、無菌操作臺(tái)、移液槍、凍冷離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（721型）、離心機(jī)、移液管、超低溫冰箱、電子天平、接種環(huán)、涂布棒、冰浴、培養(yǎng)箱、振蕩器 （Vortex）、飯盒、 玻璃器皿（三角瓶、平皿）、試管、制冰機(jī)、冰盒、計(jì)時(shí)器、磁力攪拌器。20.2mL PCR 0.5mL1.5mL10mL濾紙、沙布、脫脂棉、 Tip頭（各種大?。?。七、實(shí)驗(yàn)主要試劑及配制方法（一）實(shí)驗(yàn)主要試劑1、T載體的制備Amp抗生素、胰化蛋白月東、酵母提

31、取物、NaCl、NaOH、SDS、苯酚-氯仿-異戊醇（25： 24： 1）、異丙醇、乙酸鉀、冰乙酸、70%乙醇、氯霉素、引物、 Ex Taq酶、dNTP、Xcm I酶、Buffer、ddHzO。2、DNA的重組與連接（PCR產(chǎn)物的克?。㏄CR產(chǎn)物（插入 DNA）、pMD20-T 載體（大連寶生物生產(chǎn)）、ddH2。、T4 DNA 連接酶、Buffer。3、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備胰化蛋白月東、酵母提取物、無菌水、NaCl、NaOH、TOP10菌種、DH5 a菌種、葡萄糖、CaCM4、重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定PCR產(chǎn)物連接混合物、感受態(tài)細(xì)胞、合適的對(duì)照DNA、LB培養(yǎng)基（每升中含有 10g胰

32、蛋白棟、5g酵母浸膏、10g NaCl,用5M NaOH調(diào)節(jié)pH7-8）、LB氨茉青霉素平板（每升 LB培養(yǎng)基中加入15g瓊脂， 再加入氨茉青霉素至終濃度為 100 d g/mD、氨茉青霉素（用滅菌蒸儲(chǔ)水配制 50mg/mL的貯液）、IPTG （取 2g溶于8mL雙蒸儲(chǔ)水中，定容至 10mL,過濾除菌，-20C保存）、X-gal （貯液濃度為 20mg/mL ,溶于二 甲基甲酰胺中，-20 C暗處保存）、SOC培養(yǎng)基。5、質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）胰化蛋白月東、酵母提取物、NaCl、NaOH、氯霉素（34mg/mL ,溶于乙醇，工作濃度為170科g/mL、HB 101大腸桿菌菌株、葡萄糖、

33、Tris H- Cl、EDTA-Na 2 2H2。、SDS、乙酸鉀、冰乙酸、乙醇、無菌水、 （二）配制方法1、LB液體培養(yǎng)基（不加抗生素）去離子水950m胰化蛋白月東10g母提取物5gNaCl10g搖動(dòng)至完全溶解，用5moL/L NaOH也0 0.2mL）調(diào)pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,在151bf/in2（1.034 M05pa）高壓滅菌 20min。2、0.1M CaCl2 配制CaCl22.3g力口 H2O至200mL （滅菌）3、5moL/L NaOH （ NaOH 分子量=40）將200gNaOH溶于450mLH2O中，加水定溶至1L。4、LB 培養(yǎng)基 (LriaBertani 培養(yǎng)基)去離子水950mL細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白月東(bacto-tryptone)10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至完全溶解，用 5moL/L NaOH (約0.2mL)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入