試驗(yàn)程序——姐妹染色單體交換（SCE）試驗(yàn)（C）（二）

1、試驗(yàn)程序姐妹染色單體交換（sce）試驗(yàn)（c）（二） (1)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞（chl)sce測(cè)試法 1)儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)首先需要有良好的無(wú)菌操作間。室內(nèi)密封性良好，經(jīng)消毒殺菌后可長(zhǎng)時(shí)光維持潔凈無(wú)菌。如無(wú)過(guò)濾滅菌空氣送入式無(wú)菌間，用普通無(wú)菌室并配有超凈工作臺(tái)也可完成工作。 恒溫培養(yǎng)箱：用法co2孵育箱比較抱負(fù)，保持5%co2濃度可維持培養(yǎng)液穩(wěn)定的ph值；如條件不允許，用一般隔水式恒溫箱也可滿足要求，溫度維持在37±0.5，將培養(yǎng)瓶塞塞緊，可維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的ph值。 電熱干燥箱：用于烘干玻璃器皿和干熱消毒。干熱消毒溫度要求達(dá)160,2h以上。 超凈工作臺(tái)：最好挑選雙側(cè)可操作式、空間較大

2、型的，便于雙人對(duì)坐操作。 冰箱：一般冰箱，供常常用法的試劑、藥品、培養(yǎng)液等冷藏用；-20低溫冰箱，供批量?jī)?chǔ)藏血清、試劑、培養(yǎng)液等用。 天平：一般天平、分析天平、電子分析天平等，供稱量藥物、試劑等用。 顯微鏡：一般光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、照相顯微鏡等。前兩者必備。 離心機(jī)：一般離心機(jī)，用于細(xì)胞懸液離心，最大轉(zhuǎn)速4000r/min即可；小型臺(tái)式離心機(jī)，供細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)離心用；高速離心機(jī)，制備s9用。 高壓消毒鍋：小型手提式加熱式。供各種不適于干熱消毒的制品消毒用，如橡膠制品、塑料制品、針頭和試劑等。 水純扮裝置：可按照各試驗(yàn)室用法水量大小而采購(gòu)不同型號(hào)的純化水裝置。試驗(yàn)用水多用雙蒸以上的蒸餾水。 抽濾

3、裝置：用于不能加熱消毒的培養(yǎng)液、試劑和小牛血清等除菌時(shí)用。玻璃細(xì)菌濾器，普通用g6漏斗抽濾。此濾器清洗、消毒、滅菌等操作較棘手。目前用法金屬濾器較多，可選用不同孔徑濾膜加壓過(guò)濾。濾器的清洗消毒較便利。濾膜為一次性用品。 酸度計(jì)：用于測(cè)定各種溶液的ph值。 電磁加熱攪拌器：配制難溶試劑時(shí)加溫、攪拌用。 超聲波洗滌機(jī)：洗滌器皿用。 水浴鍋：用于小牛血清滅活和染片等。 紫外燈或黑光燈：30w紫外燈，或兩個(gè)20w黑光燈，供sce染片時(shí)用。 co2鋼瓶：供給co2孵育箱用。 加樣器：5、2、1、0.5、0.2、0.1m1等，用于加受試物、消化液、青霉素、鏈霉素等用。 2）器材：細(xì)胞培養(yǎng)需用大量器材，品種

4、與數(shù)量都要充分。按正在用法、正在清洗、已清洗好備消毒、已消毒好備用等舉行分類管理。玻璃制品的質(zhì)量要求嚴(yán)格。除厚薄勻稱、透亮度好外，還要求是中性玻璃，尤其培養(yǎng)瓶質(zhì)量要求很高，否則細(xì)胞不貼壁生長(zhǎng)。 試劑瓶：500、250、100、50、l0ml等各若干個(gè)。輸液瓶亦可用于儲(chǔ)藏試劑，因其有刻度，瓶塞緊，很好用。 培養(yǎng)瓶：普通常用25m1玻璃制品，也可用培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板。 容量瓶：1000、500、250、100、50m1等，供配試劑用。 量筒：500、250、100、50、20ml等，配試劑用。 燒杯：500、250、100、50ml等。 離心管：l0ml刻度離心管，需用量較多。 三角瓶：250、100

5、、50m1等，配養(yǎng)分液用。 吸管：10、5、2、lml等，移液用，需用量多。 滴管：無(wú)刻度，移液和吹打混懸液體用，需用量多。 金屬盒（飯盒）：分裝培養(yǎng)瓶、小試劑瓶、針頭、滴管、膠塞等物品消毒、染色時(shí)用。 其他抽濾裝置，g5、g6砂芯漏斗，注射器，凍存管，酒精燈，吸頭，橡皮吸球，試管架，橡皮塞，涼片架，涼片板，血球計(jì)數(shù)板，濾膜，濾紙，ph試紙，記號(hào)筆，平皿，工作服，口罩，帽子，拖鞋等。 3)試劑配制： 培養(yǎng)液：目前對(duì)化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境污染物遺傳毒性監(jiān)測(cè)，最常用的細(xì)胞株有chl、cho、v79等，此類細(xì)胞用eagle、mem、rpmi-1640和f-12等培養(yǎng)基均可得愜意結(jié)果，可按各培養(yǎng)基解釋書(shū)配制。

6、現(xiàn)介紹用rpmi-1640(sigma公司出品）配制辦法。rpmi-1640(sigma公司出品）紙袋封裝，每袋10.4g，加hepes3g，加nahco32g，溶于l000ml二次蒸餾水中，或按比例縮減，無(wú)菌過(guò)濾，分裝于2-3個(gè)試劑瓶中，密封，置-20冰箱保存，可用半年。用時(shí)取出存4冰箱，可用2周。全培養(yǎng)液配制比例：rpmi-16409份，小牛血清1份，青霉素100單位/ml培養(yǎng)液，鏈霉素l00g/ml培養(yǎng)液，調(diào)ph值7.0-7.2即可。人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需加入肝素、植物凝集素（pha)。 消化液： a.0.25%胰蛋白酶：稱取活性為1：250的胰蛋白酶粉劑0.25g，另預(yù)備d-hanks工

7、作液l00ml。先用半量d-hanks工作液于燒杯，在控溫磁力攪拌器上攪拌約1-2h使溶解，溫度不超過(guò)36。再將剩余的d-hanks工作液所有加入，用nahco3調(diào)ph值至7.2，然后，除菌過(guò)濾，分裝于青霉素小瓶中，密封，置-20冰箱保存。 b.0.5胰酶-0.02%edta平衡鹽溶液：稱lg活性為1：250胰酶，溶于200ml無(wú)菌的0.02%edta平衡鹽溶液，在室溫下溶解4h或4過(guò)夜，用5%nahco3調(diào)ph值至7.2,分裝于青霉素小瓶，-20凍存。 d-hanks液：d-hanks原液，分離稱取nacl80.0g,na2hpo4 2h2o0.6g,kh2po40.6g,nahco33.5

8、g，加二次蒸餾水溶解至l000ml。配制時(shí)要注重按挨次逐一加入上述試劑，應(yīng)等前一種試劑徹低溶解后再加下一種試劑。原液配好后分裝于500m1或250ml試劑瓶中，8pd/in2*15min高壓滅菌，冷后置一般冰箱保存。用時(shí)取d-hanks原液l00ml，加三次蒸餾水896ml，再加0.5的酚紅液4m1,混勻即成，存4冰箱。 0.02%edta平衡鹽溶液：稱edta0.2g,nacl8.0g,kc10.2g,na2hpo4 12h2o2.89g,kh2po40.2g,葡萄糖0.2g溶于l000ml二次蒸餾水中，高壓滅菌，用nahco3調(diào)ph值為7.2。 0.5%溶液：稱0.5g酚紅粉，置干燥研缽中

9、研磨勻稱，邊磨邊加入0.lmol/lnaoh12ml，使之徹低溶解，然后加二次蒸餾水至100ml,4冰箱保存。 細(xì)胞凍存液：在含20%-30小牛血清的1640培養(yǎng)液中，加入二甲亞砜，使其終濃度為10%（或加入丙三醇并使終濃度為5%)。 抗菌素： a：取80萬(wàn)單位青霉素一瓶，注入8m1生理鹽水，分裝于滅菌小塑料帶蓋離心管中，-20冰箱保存。 b：取100萬(wàn)單位鏈霉素一瓶，注入l0ml生理鹽水，分裝于滅菌小塑料帶蓋離心管中，-20冰箱保存。 小牛血清或胎牛血清：是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必不行少的養(yǎng)分物和刺激因子，選購(gòu)時(shí)需挑選新奇出品，外觀清亮、微黃，用前須置56水浴，30min滅活。無(wú)菌過(guò)濾（血清質(zhì)量很好時(shí)，

10、可免除），然后分裝于青霉素小瓶（避開(kāi)反復(fù)凍融，影響血清質(zhì)量）密封，置-20冰箱保存。 s-9混合液：s-91m1,nadp（氧化型輔酶ii）33.8mg,g-6-p-na(6磷酸葡萄糖）14.1mg,1.65mol/lkcl和0.4mol/lmgcl2混合液0.2m1,0.2mol/l磷酸緩沖液5m1,無(wú)菌二次蒸餾水3.8m1,混合得l0mls-9混合液?，F(xiàn)用現(xiàn)配，其加量不得超過(guò)培養(yǎng)液的10%。 碳酸氫鈉溶液：用于調(diào)ph值，可配10%,5%溶液，用二次蒸餾水溶解，高壓滅菌，8pdl/in215min，密封存于4冰箱，用過(guò)后再用時(shí)必需重新滅菌，或買(mǎi)市售安瓶裝品。 秋水仙堿：一種抑制紡錘體的生物堿

11、，起到堆積更多染色體中期分裂相的作用，通常培養(yǎng)液中含0.2g/ml即可達(dá)很好效果。秋水仙堿毒性劇烈，可長(zhǎng)久保存。稱l0mg秋水仙堿溶于100m1滅菌生理鹽水，得0.01濃縮液。4冰箱避光保存（最好用黑紙包好瓶子）。用時(shí)再按1：10稀釋。 低滲液：低滲處理為使細(xì)胞膨賬，核膜破碎，染色體適度簇?fù)矶子^看。普通用0.075molkcl溶液。稱5.598kc1,溶于1000m1蒸餾水中。室溫保存。 細(xì)胞固定液：起固定細(xì)胞表面，防止細(xì)胞粘連成團(tuán)作用。常用甲醇和冰乙酸混合液，按3：1比例配制。需現(xiàn)用現(xiàn)配，配好的液體不應(yīng)超過(guò)1h，由于混合液易揮發(fā)，影響固定效果。 5-溴脫氧尿苷(brdu)溶液：用無(wú)菌青霉素

12、小瓶稱brdu4mg，加入無(wú)菌生理鹽水4m1，用黑紙包瓶（避光），置4冰箱保存。 2×ssc液：稱17.538nacl,8.828檸檬酸鈉（na3c6h7 2ho2)，溶于1000ml蒸餾水中。 hoechst-33258液。 （pbs): a稱取9.478na2hpo4溶于1000m1蒸餾水。 b稱9.088kh2po4溶于1000m1蒸餾水。按照不同的ph值需要，用時(shí)a、b液按不同比例配制。 giemsa染液：取giemsa染料lg，放研缽中，加甘油少許研磨，邊研邊加甘油，共加66ml，置60溫箱中保溫90min，冷卻后加66m甲醇（也可按比例一次多配，供長(zhǎng)久用法），混勻后于室溫

13、靜置1-2周，過(guò)濾，用棕色瓶?jī)?chǔ)藏備用。臨用時(shí)磷酸緩沖液稀釋至所需濃度。 4)染毒：環(huán)境水樣或化學(xué)污染物舉行sce監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)之前，須經(jīng)過(guò)樣品處理，使成為固體樣品。然后，需確定是否為水溶性的。如是水溶性的物質(zhì)，可用滅菌生理鹽水溶解；如是非水溶性物質(zhì)，可用滅菌二甲亞諷(dmso)溶解。受試物在培養(yǎng)基中的濃度最高不得超過(guò)5mg/ml。受試物濃度普通以能抑制50的細(xì)胞生長(zhǎng)濃度為最高濃度；或以抑制細(xì)胞有絲分裂指數(shù)減低50為指標(biāo)，因抑制有絲分裂也是物質(zhì)毒性的一種表現(xiàn)。然后以倍比稀釋法或數(shù)量級(jí)遞減稀釋。確定受試物最高濃度，應(yīng)多設(shè)幾個(gè)劑量組，作細(xì)胞存活曲線，求出細(xì)胞存活一半時(shí)受試物的濃度，以免需多次試驗(yàn)確定。確定

14、染毒劑量辦法： a以細(xì)胞生長(zhǎng)克隆數(shù)作細(xì)胞存活曲線求ic50。先用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液為1000個(gè)/ml左右，每培養(yǎng)瓶加0.5m1細(xì)胞懸液，再加2.4ml培養(yǎng)基，混勻后置37恒溫箱培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁后染毒。將稀釋好的受試物每瓶加0.1m1，應(yīng)設(shè)7-10個(gè)濃度組，籠罩三個(gè)數(shù)量級(jí)，每個(gè)濃度組設(shè)三個(gè)平行樣，染毒24h，去掉培養(yǎng)液，再換新奇培養(yǎng)液3ml，繼續(xù)培養(yǎng)4-7d,使形成克隆。去掉培養(yǎng)液，加甲醇0.5ml固定10-15min,giemsa染色，數(shù)克隆數(shù)。以空白對(duì)比克隆數(shù)為100%，各劑量組克隆數(shù)除以空白組克隆數(shù)，得各劑量組克隆百分?jǐn)?shù)。縱坐標(biāo)為各劑量組克隆百分?jǐn)?shù)，橫坐標(biāo)為受試物濃度，繪制細(xì)胞存活曲線，求

15、出ic50的濃度。 b活細(xì)胞計(jì)數(shù)法求ic50。預(yù)備好接種細(xì)胞數(shù)全都、每瓶含培養(yǎng)液2.9ml、已培養(yǎng)到細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)久的培養(yǎng)瓶若干瓶，加入已溶解好的不同濃度的受試物0.lml,混勻后置37恒溫箱培養(yǎng)。每種濃度需三個(gè)平行樣，并設(shè)空白對(duì)比。繼續(xù)培養(yǎng)24h。傾去所有培養(yǎng)液，消化瓶壁細(xì)胞，加入定量培養(yǎng)液稀釋并混勻?yàn)榧?xì)胞懸液。取部分細(xì)胞懸液，一按9:1比例加入0.4臺(tái)酚藍(lán)染液。靜置2-3min，取細(xì)胞懸液滴在血球計(jì)數(shù)板蓋玻片邊緣，使液體彌漫計(jì)數(shù)板，但不能有氣泡或過(guò)多液體使蓋片飄蕩。如操作不勝利，可以重做。然后在顯微鏡下計(jì)四個(gè)角大方格中的活細(xì)胞數(shù)?；罴?xì)胞不著色。如有壓線細(xì)胞，計(jì)右側(cè)和上線的，不計(jì)左側(cè)和下線的。

16、每個(gè)樣品應(yīng)重復(fù)計(jì)數(shù)一次，取平均值。細(xì)胞計(jì)數(shù)公式： 細(xì)胞數(shù)ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù) 分離求出每種濃度活存細(xì)胞數(shù)后，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖。以活存細(xì)胞數(shù)作縱坐標(biāo)，受試物濃度作橫坐標(biāo)，繪出細(xì)胞存活曲線，求出受試物半數(shù)抑制濃度。以ic50為最高劑量組，中劑量組可以倍數(shù)關(guān)系遞減，使結(jié)果呈一定劑量關(guān)系為原則。 5）試驗(yàn)步驟：染毒劑量確定后，可舉行正式試驗(yàn)。先設(shè)計(jì)分組，要設(shè)對(duì)比組（空白對(duì)比、溶劑對(duì)比、陽(yáng)性對(duì)比等），試驗(yàn)組數(shù)按照試驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置。每組起碼設(shè)兩個(gè)平行樣。將繁殖有足夠數(shù)量、處于指數(shù)分裂期、貼壁生長(zhǎng)良好的的chl細(xì)胞，消化后用全培養(yǎng)液制成勻稱全都的細(xì)胞懸液，每瓶加入量

17、按照稀釋細(xì)胞數(shù)而定，每瓶約5×105個(gè)/ml或1×106個(gè)/ml等量的細(xì)胞懸液，然后加入全培養(yǎng)基使總量為3.0m1。置37恒溫箱培養(yǎng)，約24-48h,觀看細(xì)胞貼壁呈指數(shù)生長(zhǎng)久。換不含血清的培養(yǎng)液每瓶2.9ml，加入配制好的不同濃度的受檢物、陰性、陽(yáng)性對(duì)比物，使25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液總量為3.0ml,混勻，置恒溫箱培養(yǎng)染毒1-2h；加活化劑s9時(shí)，換不含血清的培養(yǎng)液每瓶2.6ml，加入配制好的不同濃度的受試物、陰性、陽(yáng)性對(duì)比物各.lml，加配置好的s9活化劑0.3ml，使25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液總量為3.0m1,混勻，置恒溫箱培養(yǎng)染毒1-2h。去除含受試物的培養(yǎng)液，用hanks

18、液洗一遍細(xì)胞后，加入含brdu(10g/ml培養(yǎng)液）的徹低培養(yǎng)液避光培養(yǎng)。如用一般溫箱，則將瓶塞塞緊，如用co2孵育箱則瓶蓋要松，以使co2能調(diào)整培養(yǎng)液的ph值。繼續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)細(xì)胞周期（24-28h,chl細(xì)胞周期為12-14h)。在終止培養(yǎng)前2h，按0.02g/ml（培養(yǎng)液）加入秋水仙堿，終止培養(yǎng)時(shí)倒掉培養(yǎng)液，消化收獲細(xì)胞，制片。 染色體片制備： 將培養(yǎng)到期的培養(yǎng)基所有倒入事先已編號(hào)的離心管中，向每瓶細(xì)胞中加入消化液0.5m1，放置2-3min（視室溫而定時(shí)光長(zhǎng)短），使細(xì)胞所有脫落。再用原培養(yǎng)液將細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管，并輕輕將細(xì)胞打成混懸液。以1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。每管加0.0

19、75mol/lkcl低滲液5m1，置37溫箱15min。緩慢加入lml新配置好的固定液（甲醇二冰乙酸3：1)，輕輕混勻。以1000r/min離心5min。棄去上清液，加固定液4m1混勻，固定20min。以1000r/min離心5min，起碼固定二次，棄去上清液。加0.1-0.2m1新固定液，充分混勻制成清亮的細(xì)胞懸液。滴2-4滴于清潔、冰凍的玻片上，置涼片板上空氣干燥。每一樣品需制2-3片。 6）分化染色：在細(xì)胞的dna合成過(guò)程中，brdu能作為核普酸前體物替代胸腺嘧啶核苷mr)摻入到新合成的核苷酸鏈中。所以，當(dāng)細(xì)胞在含有brdu的培養(yǎng)液中經(jīng)受第一次分裂時(shí)，形成的中期染色體中兩條姐妹染色單體的

20、dna雙鏈的化學(xué)組成就產(chǎn)生了差別。其中一條dna鏈中的tdr的位置被brdu代替，而另一條dna鏈中的tdr未被代替。此時(shí)，當(dāng)用giemsa染色時(shí)，兩條染色體著色程度全都都被深染。而當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受了兩個(gè)細(xì)胞周期之后，中期染色體的dna雙鏈在化學(xué)組成上有了進(jìn)一步的差別，其中一條染色單體的雙鏈中都含有brdu；而另一條單體中，僅有一條鏈含有brdu。雙股dna鏈都含有brdu的染色單體，當(dāng)用熱鹽溶液處理或受到光的照耀后易被水解，降低了與熒光染料或giemsa染料的親和力，從而著色淺，造成了兩條染色單體染色深淺的不同。sce分化染色法可采納以下幾種： a.hoechst33258黑光燈法：將老化3-7d的染色體標(biāo)本依次浸入0.14mol/lnacl,0.004mol/lkcl和0.01mol/l磷酸緩沖液（ph7.0)中各5min。浸入用0.0lmol/l磷酸緩沖液配制