分子診斷學(xué)完整終結(jié)版

1、湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！分子診斷學(xué)完整終結(jié)版1.分子診斷學(xué): 是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法來研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和2.SNP:單核音酸多態(tài)性，指在基因組上單個核昔酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。3.基因（gene）:是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA 所必學(xué)的全部核苷酸序列，是遺傳的結(jié)構(gòu)和功能單位。分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。4結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA 的編碼序列調(diào)控基因：保證轉(zhuǎn)錄功能起調(diào)控作用的非編碼序列5 操縱子 （ operon） 操縱基因與其控制下的結(jié)構(gòu)基因共同組成的功

2、能單位6斷裂基因：指基因的內(nèi)部存在間隔區(qū)，間隔區(qū)的DNA 序列與該基因所決定的蛋白質(zhì)沒有關(guān)系。間隔區(qū)又稱為內(nèi)含子。出現(xiàn)在成熟RNA 中的有效區(qū)段為外顯子。7 .重疊基因：指基因的開放閱讀框（ORF）存在一個或多個核苷酸重疊的基因8 .跳躍基因：又稱轉(zhuǎn)座子，基因在染色體上的位置不固定，能由一條染色體跳到另一條染色體上。9 .必須基因：生物體中存在的一些維持生物細(xì)胞生長所必需的基因，缺少或突變這些基因均能導(dǎo)致生物體死亡10 .基因組（genome） ：細(xì)胞中一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和 .11基因組結(jié)構(gòu)主要指不同的DNA功能區(qū)在DNA分子中的分布和排列12多順反子（polycistron ） ：

3、操縱子中常常有一至多個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串連一起，受同一個調(diào)控區(qū)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄在同一個 mRNA 分子中。13 .黏性末端：基因組雙鏈兩端具有能夠互補的單鏈DNA 部分14 .末端正向重復(fù)序列：又稱末端冗余，指病毒雙鏈DNA 分子兩端有一段相同的核苷酸15 .末端反向重復(fù)序列（ ITR ） ： 指病毒基因組兩端的反向互補重復(fù)序列16 .重疊基因：指兩個或兩個以上基因的ORF 共有一段DNA序列17 .分段基因：指病毒基因組由幾條不同的核酸分子組成，多冗于 tDNA 病毒， RNA 病毒及雙鏈RNA 病毒18 .LTR:即長末端重復(fù)序列，逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的dsDNA 中，兩端有LTR 結(jié)構(gòu)19

4、 .DNA 重組： 是指將不同來源的DNA 分子通過磷酸二酯鍵將末端連接形成重組DNA.20 .DNA 克?。ǚ肿涌寺。簩⒛骋惶囟―NA 片段通過重組DNA 技術(shù)插入到一個載體（質(zhì)粒和病毒等）中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA 片段的群體。21.限制性片段長度的多態(tài)性（RFLP：個體之間DNA勺核昔 酸序列存在差異，稱為 DN夠態(tài)性。若因此而改變了限制性 內(nèi)切酶的酶切位點可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化，稱RFLP。22. 限制性核酸內(nèi)切酶（RE） : 重要的工具酶之一。RE 是一類能識別和切割雙鏈DNA寺定核昔酸序列的核酸水解酶.（水 解磷酸二酯鍵）2

5、3.DNA聚合酶I是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個 DNA聚合 酶，分子量為109000具有5 '3'聚合酶活性、3'5'核酸外 切酶活性、 5 -3核算外切酶活性的工具酶。24.Klenow片段：用特異性的蛋白酶可將 DNA聚合酶I裂解為小片段與大片段，大片段即Klenow 片段，具有5-3聚合酶活性及3 -5外切酶活性，而失去了53外切酶活 性，是分子生物學(xué)研究的常用工具酶25 .TaqDNA聚合酶：一種耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶。具有53聚合酶活性和依賴于聚合作用的 53外切酶活 性。 （最佳作用溫度是7080， TaqDNA 聚合酶可用于DNA測定及通過聚

6、合酶鏈反應(yīng)（PCR）對DNA分子的特定序列 進(jìn)行體外擴增）26 .同工異源酶：在DNAk,來源不同但能識別和切割同一位點的酶。27.逆轉(zhuǎn)錄酶：是具有依賴RNA 的 DNA 聚合酶活性、核酸酶 H 的水解作用、以DNA 為模版的DNA 聚合酶作用的多功能酶。28 .末端脫氧核糖核昔酰轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)移酶） TdT :在 二價陽離子存在下，催化d NT P轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈 DNA 分子的 3'-OH 末端的工具酶。29 . DNA連接酶：催化雙鏈DNA一端的3'0H與另一雙鏈DNA5 '端的磷酸根形成3 ',5/ 一磷酸二酯鍵，將 具有相同黏性末端或平端的兩條雙鏈

7、 DNAf段連接起來，實 現(xiàn)DNA勺體外重組，其催化黏性末端連接效率要比平末端高 得多。30 .堿性磷酸酶：用于催化去除 DNA RNM dNTP上的5'-磷 酸基團的工具酶。31 .T4 多核苷酸激酶：來源于 T4 噬菌體感染的大腸桿菌包括前向反應(yīng)和交換反應(yīng)。用于催化 ATP上的丫 -磷酸轉(zhuǎn)移 到DNA鏈的5 /端上的工具酶.32 .核酸酶S 1 :可用于水解雙鏈 DNA、RNA或DNA R N A雜交分子的單鏈部分的工具酶.33 .載體（vector ）:是攜帶靶DNA（目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增和表達(dá)的運載工具，本質(zhì)為DNA。34 . 克隆載體：能將目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)

8、制擴增并產(chǎn)生大量目的基因的載體稱為克隆載體。35 .分子診斷主要特點：直接以疾病基因為探索對象，屬于病因?qū)W診斷，對基因的檢測結(jié)果不僅具有描述性，更具有準(zhǔn)確性；可準(zhǔn)確診斷疾病的基因型變異，基因表型異常以及由外源性基因侵入引起的疾病；靈敏度高，便于早期診斷及疾病預(yù)防；以基因分析為基礎(chǔ)，特異性高。36 分子診斷三個階段:（第一個階段：準(zhǔn)備和醞釀階段1953年前， 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA 是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。（三個實驗：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗、體外轉(zhuǎn)化實驗、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗） 、第二個階段：DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)、中心法則、PCR 技術(shù)第三個階段：2001 年， 首張人類基因組序列圖譜及其他物種基因組序列的

9、公布。基因組分、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的巨大技術(shù)進(jìn)步，促進(jìn)進(jìn)入第三階段，即以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集型技術(shù)。主要應(yīng)用：感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤的分子診斷，個體化醫(yī)療，其他如耐藥性、療效監(jiān)測，多基因疾病37 .四項生物技術(shù)：細(xì)胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基因擴增技術(shù)38 .C值：基因組的大小，常用堿基數(shù)目或堿基對數(shù)目來描述 C 值是特異的，物種不同，差異極大，真核生物中，一般隨著進(jìn)化，C 值增大C 值矛盾：又稱C 值悖論，生物的進(jìn)化程度與基因組大小不完全成比例的現(xiàn)象39 .真核生物基因組基本特征：有細(xì)胞核基因組和細(xì)胞器基因組之分；核基因組以線狀 DNA分子的形式存在于染色 質(zhì)上；

10、基因多數(shù)為斷裂基因，有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和大量重復(fù)序 列；單順反子，基因家族；核基因組由染色體 DNA組 成，分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與蛋白質(zhì)結(jié)合。40 .注意點：染色質(zhì)的基本組成單位是核小體，由組蛋白核心和周圍的DNA 組成。組蛋白H2A、 H2B、 H3 和 H4 各 2個分子組成核心即組蛋白八聚體一個基因有n 個內(nèi)含子，則相應(yīng)有n+1 個外顯子重復(fù)序列分為4類：單一序列、輕度重復(fù)序列（ 2 10 個拷貝）、 中度重復(fù)序列（ 10 12 個拷貝）、高度重復(fù)序列（1萬以上）多基因家族：一些有編碼功能的重復(fù)序列，即指起源相同，序列相似，功能相關(guān)的的一組基因， 分為基因簇（相對集中分布在某一染色體的特定區(qū)

11、域）和另一類基因家族成員在整個染色體上散在分布，甚至位于不同染色體超基因家族：由基因家族和單基因組成的較大的基因家族，結(jié)構(gòu)不等的同源性，功能不一定相同假基因：基因家族中有的成員因突變而失活，不能表達(dá)出有活性的產(chǎn)物。41人類基因組計劃（HGP） ：旨在測出人類基因組30億堿基對的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并確定它們在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，發(fā)展基因組學(xué)新技術(shù)，探討人類基因組研究的社會法律與倫理等問題的一個國際性研究項目。1）主要任務(wù)：人類的 DNA 測序， 包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜等的繪制2）測序策略：經(jīng)典的逐步克隆法、全基因組鳥槍法 3）人類基因組概貌：GC含

12、量： 平均41% （33%65%）CpG島：即二核昔酸CG染色 體的重組率基因突變率：男性多見重組序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、衛(wèi)星DNA、Tn等單核音酸多態(tài) 性（SNP）含量基因數(shù)量：2、6萬一3、9萬個蛋白質(zhì)數(shù) 量： 選擇性剪接較多，使得蛋白質(zhì)多而復(fù)雜疾病基因人基因組序列：99、 99%相同4）人類基因組多樣性：同一人種或不同人種基因組存在或多或少的差異。通常 DNA 分子中某一特定位點的變異頻率低于1% 為基因突變，高于1%為DNA 分子多肽。人類DNA 分子多肽性的產(chǎn)生有以下幾種主要方式：重復(fù)序列單元的拷貝數(shù)變異，如微衛(wèi)星DNA多態(tài)性 轉(zhuǎn)座因子導(dǎo)致的分子多肽，如 Alu

13、序列多態(tài)性單個核苷酸的變異即SNP42 .原核生物基因組一般特點：基因組相對較小，通常為 一條雙鏈DNA分子功能相關(guān)的基因高度集中，構(gòu)成操縱 子重復(fù)序列少，大多數(shù)的蛋白質(zhì)基因保持單拷貝形式， RNA基因常是多拷貝沒有內(nèi)含子，基因連續(xù)多順反子， 構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位絕大部分DNA 都是用于編碼蛋白質(zhì)的，只有很少不編碼序列DNA 分子中有各種功能區(qū)43、質(zhì)粒是多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物細(xì)胞的染色體外的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子44 .遺傳特性：雙鏈環(huán)狀DNA 分子， 且為共價閉合環(huán)狀DNA（ cccDNA） 質(zhì)粒復(fù)制有賴于宿主細(xì)胞的復(fù)制，但其自身基因可控制合成的時限及拷貝數(shù)垂直傳遞不影響宿主細(xì)胞代謝，但可能賦予宿

14、主細(xì)胞新的表型治理的復(fù)制方式為半保留復(fù)制。單向/雙向，單向，雙向。45 .特性：質(zhì)粒的不相溶性：兩種不同質(zhì)粒如果利用同一復(fù)制和維持機制，會在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過程中相互競爭，因而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。這兩種質(zhì)粒屬于同一不相容群（InC） 。質(zhì)粒的穩(wěn)定性：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定存在不被丟失稱為質(zhì)粒的穩(wěn)定性。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性。質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記。46 .質(zhì)粒的拷貝數(shù)：在正常生長條件下，每個宿主細(xì)胞或每 條染色體所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。由其攜帶的復(fù)制子決定。復(fù)制子是一個復(fù)制單位，包括復(fù)制起點及其相關(guān)的調(diào)控元件。質(zhì)粒的復(fù)制由復(fù)制子與調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用來啟動。47 .松弛

15、型質(zhì)粒：以RNA 為調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒的復(fù)制不需任何自身編碼的蛋白質(zhì)，完全由宿主細(xì)胞提供的壽命較長的酶及其他蛋白質(zhì)因子來完成，這些質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細(xì)胞的控制，以所謂的“松弛”方式進(jìn)行。屬高拷貝質(zhì)粒。48 .嚴(yán)緊型質(zhì)粒：攜帶與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子相互作用的復(fù)制子的質(zhì)粒。屬低拷貝質(zhì)粒。49 .轉(zhuǎn)座因子：又稱可轉(zhuǎn)座元件，指能在基因組中從一個位點移至另一位點的DNA 序列。1） 轉(zhuǎn)座現(xiàn)象或移位：指由可移動因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座作用結(jié)果：a.導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組DNA的插入突- 9 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！變或基因重排，是毗鄰基因失活或表達(dá)水平下降。b.轉(zhuǎn)座因

16、子被認(rèn)為是基因組進(jìn)化的重要推動力量，還可作為遺傳學(xué)研究及基因工程的工具。2） 原核生物轉(zhuǎn)座因子的種類：插入序列 （ IS） 、 轉(zhuǎn)座子 （ Tn） 、可轉(zhuǎn)移性噬菌體。 IS： a.IS 兩端有正向重復(fù)序列（ DR） 和反向重復(fù)序列（ IR） ；b.IR 結(jié)構(gòu)的對稱使IS 既可正向插入靶位點，也可反向插入靶位點；c.IS 的中間位編碼序列，僅編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶，含有依賴p 因子的轉(zhuǎn)錄終止信號及終止密碼，從而導(dǎo)致插入位點的基因失活或表達(dá)水平下降。 Tn ： 基因組中存在的能自主復(fù)制和位移的一些DNA 序列。特點：a.兩端有反向重復(fù)序列；b.轉(zhuǎn)座后靶位點重復(fù)序列是正 向重復(fù)序列；c.編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的

17、蛋白；d.可以在基因組中移 動。50.轉(zhuǎn)座類型：復(fù)制型轉(zhuǎn)座、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座。復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)座過程中能夠復(fù)制，結(jié)果是供體與受體都有一個拷貝的轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶和解離酶。非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子不復(fù)制，直接從一個位點移到另一個位點，結(jié)果是供體失去一個轉(zhuǎn)座因子而受體得到一個轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶。51.病毒基因組：1）特點：只有一種核酸，4種類型，為雙 鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA核酸大小差 別較大（1.3xi03bp3.6xi06bp）具有啟動子和操縱子結(jié)- 10 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！構(gòu) 具有重疊結(jié)構(gòu)2）結(jié)構(gòu)：帽子和 poly （A

18、）尾結(jié)構(gòu)，對 RNA 起保護作用，并于病毒感染性有關(guān)52 .分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶有：限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶I ,逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶，堿性磷酸酶，多核 苷酸激酶等。53 .限制性核酸內(nèi)切酶（REE命名：HindmH產(chǎn)生該酶的 宿主菌屬名-大寫，斜體in代表宿主菌的種名縮寫一小 寫，斜體d代表宿主菌的株或型-正體III代表同一種菌 株中不同限制酶的編號（按發(fā)現(xiàn)先后順序）-羅馬數(shù)字。回 問結(jié)構(gòu)：通常是雙鏈DN陰子中按對稱軸排列的反向互補序 列。星號活力：RE在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，能切割一些與其特異識 別順序類似的序列，酶的特異性降低，這種現(xiàn)象稱為星號活力，使用時應(yīng)避免產(chǎn)生星號活力。54

19、 .DNA聚合酶.（1） DNA聚合酶I 和Klenow片段（2） TaqDNA 聚合酶55 .Klenow 片段的主要用途：補齊雙鏈DNA 的 3端， 使 3端標(biāo)記； 在 cDNA 克隆中， 第二股鏈的合成； DNA 序列分析56 .逆轉(zhuǎn)錄酶：（多功能酶）功能：（ 1）依賴RNA 的 DNA 聚合酶活性，以 RNA 為模版， 4種 dNTP 為底物 （此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄作用）， 催化合成DNA。 （ 2） 核酸酶 H 的水解作用（ 3）以 DNA 為模版的DNA 聚合酶作用- 13 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！57 .末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)

20、移酶）TdT 功能：在載體或目的基因3端上加上互補的多聚體尾，形成便于重組的人工黏性末端用于DNA 片段3端的同位素探針標(biāo)記58 .DNA 連接酶主要有兩者：大腸桿菌DNA 連接酶和T4 噬菌體 DNA 連接酶輔基分別為NAD+ （只能連接黏性末端）ATP （既能連接黏性末端， 又能連接平末端）重組 DNA 技術(shù)中常用T4 噬菌體DNA 連接酶 T4DNA 連接酶最初來自受T4 噬菌體侵染的大腸桿菌，但目前的分離純化手段已能快速而又簡便的得到大量高度特異性酶。注意： DNA 分子磷酸二酯鍵的斷裂稱為切口（Nick） ，可以用 T4 DNA 連接酶來修復(fù)。DNA 分子中核酸缺失，稱缺口（ gap

21、） ，不能單獨用連接酶來修復(fù)。59 .堿性磷酸酶（1）細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）一由大腸桿菌分離 出來的（2）小牛腸堿性磷酸酶（CIP）一由牛腸道分離出來的（兩個催化去除DNA、 RNA 或 dNTP 上的5 -磷酸基團）主要用途：.除去DNA段上的5,磷酸，以防自身連接。 . 在使用 T4 多核苷酸激酶和32P 同位素標(biāo)記前，除去RNA或DNAk 5,端的磷酸，以便進(jìn)一步用32P標(biāo)記的r-磷酸重新 磷酸化，使5'端段被32P標(biāo)記。60核酸酶Si的作用：.除去雙鏈DNA勺黏性末端以生產(chǎn)平 末端。.除去cDN始成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情

22、奉獻(xiàn)！.分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RN粉子的雜交情況等。載體主要有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。根據(jù)其用途分為克隆載體和表達(dá)載體61. 克隆載體常有兩種：質(zhì)粒載體和噬菌體載體1 ）質(zhì)粒載體復(fù)制特性：緊密型和松弛型（與宿主有關(guān)）作為克隆載體的質(zhì)粒具備特點：具有松弛型復(fù)制子；在復(fù)制子外存在幾個單一的酶切入點，以便目的DNA 插入；具有插入失活的篩選標(biāo)記，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗生素抗性標(biāo)記；分子量相對較小和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒缺點：容量較小，一般只能接受小于15kb 的外來 DNA。質(zhì)?？寺≥d體用途保存和擴增 2kb目的DNA構(gòu)建cDNA 文庫目的DNA勺測序作為核酸雜

23、交時的探針來源。目前常用的質(zhì)粒有PBR322， PUC 系列，以及由后者衍生而來的 PSP 和 PGEM 系列等。PBR322系列載體特點：帶有一個復(fù)制起始點具有二個抗生素抗性基因具有較小的分子量具有較高的拷貝數(shù) 2） PUC18、 PUC19 質(zhì)粒載體2）噬菌體載體：入噬菌體載體、 M13噬菌體噬菌體是指感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌性噬菌體和溶源性噬菌體1）入噬菌體包括插入型和置換型兩類，其主要用途：用 作一般的克隆載體；用于構(gòu)建一般的基因體或cDNA文湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！庫（小于22kb）;用于抗體庫或隨機肽庫的構(gòu)建；核 酸的序列分析。

24、3、表達(dá)載體和穿梭載體講的很少，了解它們的結(jié)構(gòu)便可 P39-41.62 .分子克隆的基本步驟:目的基因的制備載體的選擇和制備目的基因與載體的連接重組 DN礙入受體細(xì)胞 目的基因的篩選和鑒定63 . 目的基因的獲取制備方法：（ 1） 基因從文庫中獲取【基因文庫（G-文庫）：是指含有某種生物全部基因隨即片段的重組 DNAE：隆群。（C-文庫）：將細(xì)胞的全部mRNAS逆轉(zhuǎn)錄制備出 全套的cDNA隆群】（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）人工合成DNA 片段（100bp） （4） PCR合成（5）直接從染色體DNA中分離 目的基因2）載體的選擇：入噬菌體和黏性質(zhì)粒載體常用來構(gòu)建基因 組文庫，pUC系列常用于構(gòu)

25、建cDNAC庫和克隆較小DNAt 段，M13噬菌體則用于克隆一些待測的 DNA列3） 目的基因和載體的連接：平末端連接和黏性末端連接（容易些）黏性末端DN吩子連接（目的基因或 DNA甫入片段與適當(dāng)?shù)妮d體存在同源粘性末端）： 用牛小腸堿性磷酸酶去除載體的5'磷酸抑制DNA的自身環(huán)化，使它只能與未經(jīng)堿性 磷酸酶處理的外源DNM段連接平末端連接法（質(zhì)粒與目的基因無相同的酶切位點）有湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！以下幾種方法T4DNA連接酶連接人工頭連接通過同聚尾連接4）將重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞（ 1）重組 DNA 分子導(dǎo)入原核細(xì)胞目的基因與載體在體外連接

26、成重組體后，需先導(dǎo)入受體細(xì)胞，常用的受體細(xì)胞是大腸桿菌。轉(zhuǎn)化方法：Cacl2 處理法電擊法轉(zhuǎn)化作用：將重組的DNA 分子引入細(xì)菌（原核細(xì)胞），使其在細(xì)菌體內(nèi)擴增及表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)染：將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA 重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程（ 2）重組DNA 分子導(dǎo)入真核細(xì)胞Cacl2 處理法電擊法聚聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法磷酸鈣-DNA共沉淀法二乙胺乙基-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體融合脂質(zhì)體法細(xì)胞核的顯微注射法5）重組體的篩選和鑒定（1 ）根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選：篩選出轉(zhuǎn)化菌， 篩選帶重組體的克隆，對DNA重組體進(jìn)行鑒別。根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇

27、3 -半乳糖普酶系統(tǒng)根據(jù)插入的外源性DNA 片段的性狀進(jìn)行篩選（ 2）根據(jù)重組DNA 的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選重組子大小鑒別篩選限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行分析 PCR湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！擴增方法進(jìn)行鑒定核酸分子雜交方法進(jìn)行鑒定DNA 序列分析鑒定64 .插入失活效應(yīng)：選用含有兩個以上的抗藥基因的載體，外源 DNA 片段插入其中一個基因，并導(dǎo)致這個基因的失活，就可用兩個含不同藥物的平板，互相對照，篩選含重組DNA的菌落65 .核酸分子雜交基本原理：利用核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補配對原則形成異質(zhì)雙鏈的過程。(可發(fā)生

28、在同源或異源的DNA 鏈與 DNA 鏈之間，也可在RNA 鏈與 DNA 鏈)66 .核酸變性(denaturation ) ：指維系核酸雙鏈互補堿基對之間的氫鏈斷裂變成單鏈的過程，并不涉及共價鍵的斷裂。(黏度減小， 浮力密度增大，260nm 處紫外吸收增加，活性降低)(熱變形，酸堿變性，化學(xué)變性)67 .Tm( melting temperature ) ：通常把熱變性過程中DNA變性一半所需要的溫度成為融解溫度。DNA 的 Tm 值在8295c之間 Tm影響因素：DNA的均一性堿基組成溶液的離子強度pH 變性劑68 .DNA 復(fù)性 ( renaturation ) ： 當(dāng)變性條件緩慢去除后，

29、兩條彼此分開的互補單鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。( 許多理化性質(zhì)恢復(fù)，但熱變性后驟然冷卻，DNA 則不可復(fù)性)退火(annealing):熱變性后，將溫度緩慢降低而使 DNA 逐漸冷卻即可復(fù)性的過程。湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！復(fù)性過程分兩步：成核作用( nucleation)和拉鏈作用( zippering )成核作用：兩條核酸單鏈隨機碰撞形成暫時局部雙鏈，如果局部雙鏈周圍堿基不能配對，則迅速解離，重新碰撞直到找到正確的互補序列，這個過程稱為成核作用。拉鏈作用：在成核的基礎(chǔ)上，兩條單鏈的其余部分堿基迅速互補配對，就像拉鏈那樣形成完整的雙鏈分子。復(fù)性速度

30、用Cot 1/2衡量，Co:單鏈DNA的起始濃度(mol/L), t為時間(s), Coti/2表示單鏈DNA的起始濃度與復(fù)性一半所需時間之積，與復(fù)性速度成反比，與DNA 復(fù)雜度有關(guān)影響因素：DNA 的分子大小和復(fù)雜度，離子強度，DNA 的濃度，溫度69 .探針(probe) ：廣義上指的是能特異性與特定靶分子發(fā)生相互作用，并能被某些方法所檢測的分子。70 理想探針的特點：高度特異性易于標(biāo)記和檢測靈敏度高穩(wěn)定且制備方便71 核酸探針：指能與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補結(jié)合，并可用特殊方法檢測的被標(biāo)記的已知核酸序列72 .核酸探針的種類：基因組DNA 探針、 cDNA 探針、 RNA探針、寡核苷

31、酸探針1)基因組DNA探針：制備方法：a.分子克隆b.采用聚合 酶鏈反應(yīng)擴增特定的基因組 DNA片段優(yōu)點：制備方法簡 便、省時、易得，穩(wěn)定不易降解，標(biāo)記方法多樣也較成熟73 cDNA 探針： cDNA( complementary DNA ) ： 指與 mRNA- 20 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！互補的 DNA 分子，它是以mRNA 為模板，遵循堿基互補配對原則，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成 優(yōu)點：具有基因組DNA優(yōu)點，且不存在內(nèi)含子和其他高度重復(fù)序列，尤其適用于基因表達(dá)研究（但制備困難）74 RNA 探針：雜交效率高，雜交分子穩(wěn)定，不存在高度重復(fù)序列，非特異性

32、雜交較少，不易標(biāo)記，易降解4）寡核音酸探針：特點：a根據(jù)實驗需要合成b.長度一般 為2050nt c.可以識別靶分子的單個堿基變化 d.特異性不 高，雜交信號不強 設(shè)計原則：a.探針長度一般2050nt b. 剪輯成分，Gtc含量在40%60%為宜c.不應(yīng)存在大于4bp 的互補序列d.避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)多于 4次e.同源性不 應(yīng)超過 70% 或有連續(xù)8 個上堿基同源73 核酸探針的標(biāo)記，兩大類（1）放射性核素：最常用，靈敏度和特異性極高，但半衰期短，檢測時間長，污染環(huán)境 （ 2）非放射性核素：穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟、檢測時間短，但靈敏度74 .理想探針標(biāo)記物特點：高靈敏度標(biāo)記物與探針結(jié)合后， 不影

33、響堿基對的特異性，雜交體的穩(wěn)定性及其Tm 值。檢測方法應(yīng)高靈敏度、特異、 假陽性率低標(biāo)記物與探針結(jié)合后穩(wěn)定，保存時間長 標(biāo)記物對環(huán)境無污染、對人體無損傷、價格低廉。75 放射性核素的標(biāo)記物類型常用32P35S 3H125I131I 其類型特點：32P:比放射活性3.4X 1014Bq/mmol.最常用。放射性強，釋- 22 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！放的6粒子能量高，穿透能力強，靈敏度高，半衰期僅14.4d,射線散射嚴(yán)重而影像分辨率，影響結(jié)果分析。35S:比放射活性5.55 x 1013Bq/mmol.釋放的3粒子較 32P稍低，半衰期 87.1d,靈

34、敏度比32P低，散射作用弱，分辨率較高，適用于原 位雜交。3H:比放射活性1.07 xi012Bq/mmol,釋放的3粒子 能量較低，半衰期12.1 年，采用延長曝光時間的方法可產(chǎn)生本底低， 分辨率高的結(jié)果，金庸與細(xì)胞原位雜交，可反復(fù)使用，對環(huán)境影響大。125I、131I :釋放6粒子和丫射線，具有較高敏感性， 較強分辨率，危害性大。76放射性核素的標(biāo)記標(biāo)記法：采用體外標(biāo)記法，包括化學(xué)法和酶法1）化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子和探針分子上活性基團間的化 學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物結(jié)合到探針分子的標(biāo)記方法。2）酶法：預(yù)先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸分子上，經(jīng)過酶促反應(yīng)將標(biāo)記號的核苷酸分子或標(biāo)記基因摻入或交換到探針分子中的

35、方法，有切口平移法，隨機引物法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄法（ 1）切口平移法：DNaseI Mg2+ 隨機切割3 OH 加 dNTP（被標(biāo)記）E.coliDNA聚合酶I全酶切除5'端的核昔酸 合成互補單鏈，適用于任何形式的雙鏈DNA 但不適合單鏈DNA 和 RNA（ 2）隨機引物法：隨機引物是人工合成的由6個核苷酸殘基構(gòu)成的寡核苷酸片斷的混合物。模版DNA 變性，加入隨機引物在 Klenow酶催化加入d NTPs（一種被標(biāo) 記 ），變性形成標(biāo)記探針，適合單雙鏈DNA 和 RNA 探針標(biāo)湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！記3）末端標(biāo)記法：3

36、9;端標(biāo)記法：模版 DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶形成5端突出的DNA， klenow 酶 +d NTPs 變性得到3端標(biāo)記 DNA， 經(jīng)變性成3端標(biāo)記單鏈DNA 探針 5端標(biāo)記法；T4噬菌體多核昔酸激酶（PNK）標(biāo)記法、堿性磷性磷酸酶（ ALP ）切除 5端的磷酸基團PNK 作用轉(zhuǎn)移77 .非放射性核素標(biāo)記：生物素、地高辛、光敏生物素、熒光素、酶標(biāo)法ALP 和辣根過氧化酶（HRP） 核酸探針的純化：乙醇沉淀法凝膠過濾色譜法核酸探針 的檢測：（1）放射性：放射自顯影 液體閃爍計數(shù)法（2） 非放射性：偶聯(lián)反應(yīng)、顯色反應(yīng)（酶促顯色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法）78 .核酸分子雜交的類型：固相雜交和液相雜交兩大類1

37、） 液相雜交：將待測核酸樣品和核酸探針同時放入雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，然后分離雜交分子和過量的未雜交探針，再對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測固相雜交：預(yù)先將待測的靶核酸鏈固定在固相支持物上，然后與溶解于雜交液中的核酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去支持物上未參加反應(yīng)的游離核酸探針，再檢測雜交信號，分析結(jié)果。2）常用固相雜交：Southern 印跡雜交Northern 印跡雜交、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、原位雜交 Southern 印跡雜交:指經(jīng)凝膠電泳分離的待測DNA 片斷轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定固相支持物（尼龍膜或硝酸纖維素膜），然后用標(biāo)記的探針DNA 分子檢測靶DNA 的一種方法。湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分

38、隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！基本過程：限制性核酸內(nèi)切酶消化待測DNA一瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片斷-DNA變性并轉(zhuǎn)印到固相支持物上- 預(yù)雜交一與特異DNA探針雜交-雜交信號檢測及結(jié)果分析 （轉(zhuǎn)膜方法有毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移）Northern印記雜交：指待測 RNA （主要是mRNA）從 凝膠轉(zhuǎn)印到固相支持物上，與標(biāo)化的DNA 探針進(jìn)行雜交的印跡技術(shù)。與Southern 印跡雜交不同點：a . RNA 易被環(huán)境中存在的RNA 酶降解，應(yīng)避免RNA 酶污染b. RNA 需要在變性劑（甲醛、乙二醛、甲基氫氧化汞）存在下進(jìn)行電泳，保持其單鏈狀態(tài)，防止RNA 分子形成二級結(jié)構(gòu)，不能用堿變性 c.

39、印跡前將含有變性劑的凝膠用水浸泡除去。79 . 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR ）技術(shù)是指生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項技術(shù)之一（細(xì)胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基因擴增技術(shù)）特異，敏感，高效，簡便，重復(fù)性，移易化等優(yōu)點。80 .PCR 的原理： 模擬體內(nèi)DNA 半保留復(fù)制過程，通過變性，退火，延伸，三步反應(yīng)的循環(huán)完成，靶基因的雙鏈DNA 通過變性解鏈為單鏈，特異的引物通過退火與單鏈DNA 模版結(jié)合，在靶DNA 的指導(dǎo)下引物的3端延伸靶DNA 的互補鏈完成一個循環(huán)，理論上每次循環(huán)結(jié)束后靶DNA 擴增一倍，即靶 DNA 數(shù)目以 2? 幾何級數(shù)方法。

40、（1）反應(yīng)體系：模版 DNA,四種dNTP,引物，TaqDNA聚合酶、緩沖液（含Mg2+）湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！（ 2）變性（denaturation ） :模版 DNA 經(jīng)加熱至95左右一定時間后，使模版DNA 雙鏈或經(jīng)PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈。退火（annealling） :將下降至適宜溫度（一般較Tm 低5）引物與變性的DNA 單鏈在堿基互補的基礎(chǔ)上形成引物，模版雜交雙鏈。延伸（exension） :將溫度上升至在70左右時，TapDNA 聚合酶催化以引物為起點的從5 3 端 DNA鏈延伸反應(yīng)，隨著4 種 dNTP 的

41、摻入，合成新的DNA互補鏈。（ 3） 動力學(xué)： y=A（1+R） ?估算 PCR 產(chǎn)量， A 為起始模板量，R 為擴增效率，有平臺期81 常見問題原因分析和處理（1）假陽性。靶DNA 和非靶DNA的污染（2）假陰性標(biāo)本處理的原因PCR試劑問題 PCR 擴增儀故障或擴增過程中的其他PCR 產(chǎn)物鑒定的問題（3）引物二聚體兩引物分子間有較多的堿基配對， 特別是引物3'端有互補區(qū)引物模版比例太高，可增加模版 用量退火溫度過低循環(huán)次數(shù)過多（4）非特異性PCR產(chǎn) 物（5） PCR 污染與預(yù)防（6） RNA 酶的污染與預(yù)防去除外源RNase污染抑制內(nèi)源性RNase的活性82 .擴增產(chǎn)物的檢測與分析（

42、1）凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。（ 2） PCR 產(chǎn)物的酶切技術(shù)：PCR 限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP ） （ 3） PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR-SSCP（ 4） 核酸探針雜交分析點雜交反湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！向點雜交微孔板雜交RNA 探針雜交酶免疫分析Southern印跡雜交（5） PCR-酶聯(lián)免疫吸附法（6） PCR產(chǎn) 物測序（雙脫氧核苷酸鏈末端終止法、化學(xué)裂解法）83 .PCR衍生技術(shù)：巢式 PCR,逆轉(zhuǎn)錄PCR,多重PCR,錨 定PCR,反向PCR,免疫PCR,原位PCR,定量（QPCR） 巢式PCR是一

43、種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,使用兩對（而 非一對）PCR 引物擴增完整的片段。第一對PCR 引物擴增片段和普通PCR 相似。 第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR 擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR 擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR 的擴增非常特異。84 .熒光定量PCR 技術(shù)： 1）基本原理：基于熒光能量傳遞技術(shù)， 通過對 PCR 擴增反應(yīng)每個循環(huán)結(jié)束時產(chǎn)物熒光信號的檢測，對起始模版進(jìn)行定量分析。85 .實時熒光定量PCR（ real ti

44、me FQ-PCR ） ： 在熒光定量PCR反應(yīng)中，引物的熒光化學(xué)物質(zhì)，在每經(jīng)過一個循環(huán)后，產(chǎn)生 一個熒光強度信號，利用熒光信號累積及熒光強度變化實現(xiàn)對整個PCR 過程實現(xiàn)監(jiān)測。熒光閾值: 設(shè)定在熒光擴增曲線上處于熒光信號指數(shù)擴增階段是的任意一個值，一般熒光閾值設(shè)置在3-15 個循環(huán)內(nèi)- 28 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！Ct 值： 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系86 .熒光定量PCR 技術(shù)： 熒光染料法（常用染料：SYBBGreenI）和熒光探針法探針法： TaqMan 技術(shù)， LightCy

45、cler 探針技術(shù)，分子信標(biāo)技術(shù)，復(fù)合探針法 TaqMan 技術(shù) :3 端的熒光Q 分子吸收5端熒光 R 分子的熒光信號/探針5端連接的熒光R 分子被 Taq 酶切割下來 /熒光R 分子發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR 數(shù)量成比例 LightCycler 探針技術(shù)：有R 發(fā)光探針和Q 淬滅探針熒光淬滅的程度與起始模版數(shù)的量成正比分子信標(biāo)技術(shù)：分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導(dǎo)致熒光淬滅/單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補而與之雜交/探針5端和3端分離，淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消失，產(chǎn)生熒光復(fù)合探針法：有R發(fā)光探針和Q淬滅探針 當(dāng)PCR擴增溶液無模版時，兩探針特異性結(jié)

46、合，無熒光；有模版，熒光探針與模版結(jié)合，兩探針分離，有熒光87 .實驗區(qū)分為四個獨立的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴增區(qū)，擴增產(chǎn)物分析區(qū)四個基本原則：1.四個區(qū)域必須是相互獨立的，2.各區(qū)的儀器設(shè)備及物品必須是專用的，3.各區(qū)不能直通，應(yīng)設(shè)有緩沖間，4.產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)安裝排風(fēng)扇或其他抽風(fēng)裝置十六字口訣：各區(qū)獨立，注意風(fēng)向，因地制宜，方便工作。還應(yīng)設(shè)立臨床標(biāo)本接收區(qū)88 .室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC ）包括測定前的質(zhì)量控制，統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制，質(zhì)量控制的評價等89 DNA 序列測定：即DNA 一級結(jié)構(gòu)的測定，指用人工的方法測定并分析核酸的堿基組成及排列順序。它是研究基因結(jié)構(gòu)， 功能及其關(guān)系的前提

47、，是臨床疾病的分子診斷最為精確的判定依據(jù)四 種 常 用 方 法 ： Sanger 雙 脫 氧 鏈 末 端 終 止 法 ， Manxam-Glibert 化學(xué)降解法，焦磷酸測序技術(shù)，雜交測序法（1） Sanger雙脫氧鏈末端終止法原理：利用 DNA聚合酶， 以單或雙鏈DNA為模版以d NTPs （一種被標(biāo)記）為底 物，在四組互相獨立的反應(yīng)體系中分別加入不同的2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP ）作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對原則，在測序引物引導(dǎo)下，合成四組有序列梯度的互補 DNA 鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙稀酰胺凝 膠電泳分離，放射自顯影檢測后識度待測DNA 的互補序列（ 2） Manxa

48、m-Glibert 化學(xué)降解法原理：首先對待測單或雙鏈 DNA 作末端 （ 5端或 3端） 放射性標(biāo)記，標(biāo)記后的DNA分四組， 分別用不同的化學(xué)試劑對不同的堿基進(jìn)行特異性- 31 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！的化學(xué)切割，通過控制化學(xué)反應(yīng)條件，使堿基斷裂只隨機發(fā)生在某一個特定的位點，由此各組均產(chǎn)生不同長度的DNA 片段，通過（同上）90.自動化測序與傳統(tǒng)方法比較1 標(biāo) 化 物 不 同 ：熒 光 染 料 （ 自 動 ）放射性核素（傳統(tǒng)）2 監(jiān)測手段不同：掃描儀 /PCR 循環(huán)測序反應(yīng)方法/集束話的毛細(xì)管電泳放射自顯影/酶反應(yīng)方法/凝膠電泳特點：簡便，快速，結(jié)

49、果準(zhǔn)確可靠，安全無污染，測序能力增強91、生物芯片技術(shù)：指通過微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成了成千上萬密集排列的分子微陣列，以實現(xiàn)對組織、細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物分子進(jìn)行高效、準(zhǔn)確、高通量檢測（微陣列芯片、微流體芯片）常用：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片、液相芯片、縮微芯片實驗室等。92 、 基因芯片 （ Gene Chip） ： 又稱 DNA 芯片， DNA 微陣列；將大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在載體上制成點陣，稱之為芯片。其原理：經(jīng)過標(biāo)記的待測樣品DNA 通過與芯片上特定位置的探針按堿基配對原理雜交后，經(jīng)激光聚集熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過檢測雜交信號強度來獲

50、取樣品分子的數(shù)量和序列信息，用計算機軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和分析，從而對基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量- 33 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！研究。主要包括四個基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品制備及標(biāo)記、樣品與基因芯片的雜交、信號的檢測及 分析。93、蛋白質(zhì)芯片：指固定于支持節(jié)制上的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的陣列。據(jù)用途分：蛋白質(zhì)功能芯片、蛋白質(zhì)檢測芯片。據(jù)載體分：蛋白質(zhì)微陣列、微孔板蛋白芯片、三位凝膠塊芯片。還可分：抗體芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、適配體芯片。94、組織芯片：也稱組織微陣列（TMA ） ，將成百上千個不同組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順序排列固定在一

51、張載玻片上所成的微陣列。95、 液相芯片：又稱懸浮陣列，流式熒光技術(shù)，是基于 XMAP技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺。其核心技術(shù)是把微小的聚苯乙烯微球用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，然后將每種顏色的熒光編碼微球共價交聯(lián)上針對特定檢測物的寡核苷酸或蛋白質(zhì)探針。優(yōu)點：僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中 的多種不同目的分子一一最突出優(yōu)點高通量、高效率靈 敏度高線性范圍寬重復(fù)性好操作簡單靈活性好96、縮微芯片實驗室：又稱微型生物全分析系統(tǒng)（ TAS）把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所（波or 譜：不認(rèn)識）及的樣品制備，生物化學(xué)反應(yīng)和檢測分析的整個過程集成化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成所謂的微型全分析系統(tǒng)。97

52、、分子診斷法：（目的物：病原微生物的DNA 或 RNA）對病原體特異性核酸序列的雜交，對病原體基因序列的限制性內(nèi)切酶酶譜分析，限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析，對病原體基因保守序列的擴增檢測基因芯片技術(shù)，支鏈DNA 技術(shù)依賴核酸序列的擴增，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。乙型肝炎病毒：PCR 臨床意義：HBV 感染的早期診斷，監(jiān)測治療效果，判斷病情，指導(dǎo)制訂合理的治療方案。結(jié)核分枝桿菌TB ： TB DNA 檢測可采用PCR， FQ PCR，競爭性PCR,免疫雜交PCR等，PCRSSCP血紅蛋白病兩類：由于珠蛋白一級結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異 常血紅蛋白??；由于珠蛋白多肽鏈的組成比例改 變和珠蛋白含量降低所導(dǎo)致的地中

53、海貧血鐮狀細(xì)胞貧血：0珠蛋白基因中第六位密碼子的序列由原來的 GAC 改變?yōu)?GTG ，使對應(yīng)的氨基酸由原來的谷氨酸一繳氨酸用RE酶切法診斷地中海貧血：分為a地貧，3地貧，Y地貧，s地貧，S3 地貧，丫 3地貧等（一）核酸的分離純化與鑒定：1、 核酸分離制備總原則：保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性盡量排除其他的污染，保證核酸的純度核酸提純的主要步驟細(xì)胞裂解抽提分離核酸純化核酸鑒定- 37 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！2、完整性鑒定：可采用凝膠電泳法，DNA 看是否拖尾，RNA 為 2:1 的關(guān)系3、核酸的保存：雙蒸水及 TE緩沖液儲存DNA,醋酸鈉溶液或三蒸水、RNA 酶儲存 RNA4、抑制劑：抑制DNase: A、檸檬酸、EDTA等金屬螯合劑B、 加去污劑SDS C、 加蛋白變性劑抑制RNase：A、高溫高壓滅菌或用 DEPC處理 B、加強的蛋白變性劑 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白真核細(xì)胞的破碎方法有超聲波破碎法、勻漿法、液氮破碎法、低滲等物理法和蛋白酶K 和去污劑溫和處理法DNA 分離純化的方法：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法5、技術(shù)路線的設(shè)計：（1）核酸的釋放 目的：裂解細(xì)胞、 釋放核酸物理方法：物理干燥法、凍融法、滲透壓 調(diào)節(jié)法化學(xué)法：酶解法（2）核酸分離純化：除去非核酸類大分子污染物不需要的核酸溶劑等（ 3）核酸