大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化

1、8.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特 點(diǎn)，是分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程中的重要工具。因此熟練掌握并運(yùn)用大 腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本原理和常規(guī)操作是對(duì)每一個(gè)研究生來說是非常必要的。本章節(jié)介紹 了實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成特點(diǎn)，歸納了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)純化重組蛋 白的基本流程和詳細(xì)操作步驟，并且結(jié)合筆者的操作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了初學(xué)者在操作過程中可 能遇到的問題和解決策略。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建根據(jù)啟動(dòng)子的不同這些載體大致可以分為熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如入PL, cspA等和另外一類就是廣泛使用的 IPTG 誘導(dǎo)的

2、啟動(dòng)子，如 lac, trc , tac , T5/lac operator , T5/lac operator 等。根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的類型可分為單純表達(dá)載體和融合表達(dá)載體。融合表達(dá)是在目標(biāo)蛋白 的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促進(jìn)蛋白的正確折疊，實(shí)現(xiàn)目的蛋 白的快速親和純化，或者實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)定位。常用的用于親和純化融合標(biāo)簽包括 Poly-Arg , Poly-His, Strep-Tag , S-tag , MB昨其中 His-Tag 和 GST-Tag是目前 使用最多的。His Tag大多數(shù)是連續(xù)的六個(gè)His融合于目標(biāo)蛋白的N端或C端，通過His與 金屬離子：Cd

3、9;FS'Zd'Ni2+的螯合作用而實(shí)現(xiàn)親和純化，其中 Ni2+是目前使用最廣泛的。 His標(biāo)簽具有較小的分子量，融合于目標(biāo)蛋白的 N端和C端不影響目標(biāo)蛋白的活性，因此 純化過程中大多不需要去除。目前常使用的表達(dá)載體主要是由 Novagen提供的pET系列和 Qiagen公司提供的pQE系列。除了 His標(biāo)簽外，還原性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是另一種實(shí)驗(yàn)室常用的融合標(biāo)簽。它可以通過還原性谷胱甘肽瓊脂糖親和層析而快速純化。止匕外，與 His相比，GST很多時(shí)候能夠促進(jìn) 目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高目標(biāo)蛋白表達(dá)的可溶性，因此，對(duì)于那些用his標(biāo)簽表達(dá)易形成包涵體的蛋白，可以嘗試用GST融合表

4、達(dá)來改進(jìn)。當(dāng)然，GST具有較大的分子量（26kDa）, 可能對(duì)目的蛋白的活性有影響，因此很多時(shí)候切除GS說必須的。目前，GST融合表達(dá)系統(tǒng)主要是由GE Healthcare （原Amersham提供。重組質(zhì)粒的構(gòu)建一般選擇遺傳穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率高，質(zhì)粒產(chǎn)量高的菌株作為受體菌，常用的 有DH5a , JM 109 , DH 10B , NovaBl仙e等rec A和endA型細(xì)胞。作為表達(dá)宿主菌必 須具備幾個(gè)基本特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定，生長速度快，表達(dá)蛋白穩(wěn)定。具體操作過程中，根據(jù)所使用的表達(dá)載體的特點(diǎn)，目的基因密碼子的組成等選擇特定的表達(dá)宿主菌。以下是實(shí)驗(yàn)室 常用的幾種表達(dá)宿主：BL2: lon和ompT

5、蛋白酶缺陷型，避免了宿主對(duì)外源蛋白的降解。是經(jīng)典的使用最廣泛的 表達(dá)受體。適用于Tac, Trc , Lac, P PL, cspA等作為啟動(dòng)子的載體。BL21 （DE3 : DE3噬菌體溶源于BL21形成的帶有染色體T7 RNA聚合酶基因大腸桿菌。IPTG誘導(dǎo)的lac MV5啟動(dòng)子控制T7 RNA聚合酶基因表達(dá)T7 RNA聚合酶，進(jìn)而控制T7表 達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白。BL21 （DE3衍生系列：在經(jīng)典的 T7表達(dá)系統(tǒng)BL21 （ DE3的基石上，Novagen公司開發(fā)了一些特殊的表達(dá)宿主細(xì)胞。比如： Origami （ DE3 , Origami B （DE3 和 Rosetta-gami （

6、DE3菌株帶有trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具，trxB突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta?系列：是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。經(jīng) 提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表達(dá)效率（更多信息可參考相應(yīng)公司的資料）。BL21-Codon Plus 系歹 h 包括 BL21-CodonPlus? （ DE3 -RIPL, BL21-CodonPl 仙 s?-RIL , BL21-CodonPlpS? （DE3 -RIL, BL21-CodonPl 仙 s?-RP, BL21- CodonPlu

7、s? （DE3 -RP 等。這些受體菌添加了大腸桿菌中編碼精氨酸 （R）,亮氨酸（L）,異亮氨酸（I）和脯氨酸（P） 稀有密碼子的tRNA基因，更多用于表達(dá)一些真核生物的基因。 其中RIL系列常用于AT含 量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息參考Stratagene公司資料）。M15/SG13009自身表達(dá)T5 RNA polymerase,主要用于pQE系列載體的表達(dá)。另一個(gè)需要考慮的是大腸桿菌的密碼子及其偏愛性。表1大腸桿菌密碼子使用頻率統(tǒng)計(jì)T AAFRQC AAFRQA AAFRQG AAFRQTTTT FTTC F15TCT STCC STAT YTAC YTGT

8、CTGC C8TTALTCASTAAstopTGA stop1TTGLTCGS8TAGstop0TGGWCTTL12CCTPCATHCGTRCTCL11CCCPCACHCGCR26CCTALCCAPCAAQCGARCTGLCCGPCAGQCGGRATTIACTT8AATNAGTSATCIACCTAACNAGCSAATAIACATAAAKAGARATGMACGTAAGKAGGRGIIVGCTAGATDGGTGGTCVGCCAGACDGGCGGGTAVGCAAGAAEGGAGGTGVGCG AGAGEGGGG表達(dá)條件的建立為了方便后續(xù)的純化操作，保持目標(biāo)蛋白的活性，提高蛋白的得率，我們?cè)谶M(jìn)行蛋白的

9、大量 制備之前應(yīng)該首先確定目標(biāo)蛋白的最佳表達(dá)條件。首先，保證表達(dá)蛋白穩(wěn)定，盡量避免蛋 白酶的降解，我們可以通過使用一些蛋白酶缺陷性的表達(dá)宿主，其次在表達(dá)的過程中可以 在培養(yǎng)體系中添加一些蛋白酶抑制劑等來解決。與實(shí)現(xiàn)外源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)相比，更多時(shí) 候保證目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)，是建立表達(dá)條件的主要工作。很多外源基因在大腸桿菌表 達(dá)時(shí)很容易形成不可容的包涵體，其原因可能有：表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少 形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體；蛋白合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間 進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。目前對(duì)包涵體的形成和復(fù)性過程

10、中發(fā)生聚集的機(jī)制尚不清楚，但已經(jīng)報(bào)道了很多用于優(yōu)化表達(dá)以增加目標(biāo)蛋白可溶性的方法。轉(zhuǎn)化構(gòu)建好的質(zhì)粒至表達(dá)宿主感受細(xì)胞，挑取單克隆子至 5ml含有相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基 中，37C, 200 rpm,培養(yǎng)至。展0=左右，加入IPTG至終濃度，轉(zhuǎn)移至 28C, 200 rpm 繼 續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以在2h, 4h, 6h分別取樣以分析表達(dá)狀況。將取出的1ml菌液12000 rpm離心1min,收集菌體，加入1ml PBS緩沖液重懸沉淀，同 樣離心1min。再加入300500ml PBS重懸細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞（具體見操作細(xì)胞破碎）將破碎液體4C, 12000 rpm離心10min,分離上清和沉淀。SDS

11、-PAG。析上清和沉淀的蛋白分布（具體操作參考SDS-PAGE。若在上清中有明顯的目的蛋白的條帶，即可以放大培養(yǎng)進(jìn)而純化目標(biāo)蛋白。若目標(biāo)蛋白的 表達(dá)主要分布于沉淀，則可以嘗試一下幾種方法來改善表達(dá)。改變表達(dá)載體下手，像 GST NMS, MBP,TrxA等融合標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣吆芏嗟鞍自诖竽c桿菌中 表達(dá)的可溶性，此外一些分泌標(biāo)簽如 ompA,Pet-22b上的pelB也能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白運(yùn)輸至細(xì) 胞的周質(zhì)空間，從而提高目標(biāo)蛋白的可溶性。降低表達(dá)速度，可采取低溫誘導(dǎo)，如 15c誘導(dǎo)過夜，或者采用弱啟動(dòng)子表達(dá)載體。嘗試一些特殊設(shè)計(jì)的表達(dá)宿主 Origami： thioredoxin red 仙 ctase/

12、gl ptathione red 仙 ctase雙突變適合帶thioredoxin red 仙ctase的融合表達(dá)載體，幫助形成更多的二硫鍵。對(duì)于一些蛋白可能無法實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，這時(shí)候溶解包涵體后再純化是唯一的解決辦法。大腸桿菌表達(dá)純化外源蛋白，SDS-PAGEI必不可少的操作?？梢杂脕頇z測(cè)蛋白的表達(dá)情況 （表達(dá)量，表達(dá)分布等），用來分析純化的目的蛋白的純度。本小節(jié)列出 SDS-PAG暇作中 一些試劑的配置及其基本的操作過程。（1） 30%5烯酰胺貯存液：29g丙烯酰胺和1g N,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于100ml熱水中, 驗(yàn)證其pH值不大于。置棕色瓶中，4c保存。丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神

13、經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，具作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞 甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。建議實(shí)驗(yàn)室劃出專門的臺(tái)面，設(shè)置單獨(dú)的配置器皿進(jìn)行SDS-PAGE勺相關(guān)實(shí)驗(yàn)。（ 2） L Tris （）溶液。（ 3） 10% SDSS液：SDS 加入 ddH2O ToTolOd（ 4） 10%過硫酸銨：新鮮配制。（ 5） TEME臍液：4c保存。（ 6） mol/L Tris （）溶液。（7） 2X樣品溶解液：2%SDS5喻基乙醇，10%t油，哪酚藍(lán)，L Tris-HCl （）緩沖液。（8） 5X Tris-甘氨酸電極緩沖液：Tr

14、is , 94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml （建議每次電泳用新稀釋的緩沖液）。（9）考馬斯亮藍(lán)R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2 ）中，溶解考馬斯 亮藍(lán)R,攪拌溶解。（ 10）脫色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建議不要使用甲醇）。1、凝膠制備（ 1）安裝洗滌干凈的玻璃板、板條，并將玻璃板固定在電泳槽中。（ 2）配制10%的分離膠（具體參考表2）：迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，直至剩余的板寬比梳子長度多1cmI小心在膠上覆蓋一薄層異丙醇或水。（3）在分離膠聚合白過程（可置于37C,約10min）中，配制5%勺積層膠（參考表格3）（ 4）分離膠聚合完全后，倒去異

15、丙醇或水，用濾紙吸干膠面上的殘余。（ 5）灌注積層膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。（ 6）積層膠聚合完全后，小心拔出梳子，撥去封膠用的塑料條，固定于電泳槽。（7）在上下電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液。2、樣品的制備在蛋白溶液中加入等體積的2X樣品溶解液，混合液在沸水浴中加熱 5min,冷卻后即可上 樣。3、上樣用微量移液器上樣，每加入一種樣品，上樣量根據(jù)根據(jù)具體的樣品濃度確定，未知濃度一股用10微升。4、電泳對(duì)于一塊膠，在濃縮膠中電流設(shè)置在 1520mA,”染料進(jìn)入分離膠后可設(shè)置電壓至電流約 為2530mA繼續(xù)電泳直至染料到達(dá)離凝膠底部 1cm處。5、后處理（1）染色：加入染色液（用量同上

16、），室溫染色 30min1h。Tip：染色前可將染色液在微波爐里加熱至沸，然后搖床震蕩染色約10min即可。（2）脫色：將染色后的膠塊用水洗滌三次去除表面染料，然后加入脫色液脫色，具間更換 脫色液34次至條帶清晰。Tip : 10min快速脫色：將脫色液置于微波爐煮沸，更換三次脫色液。表2.配制SDS-PAG環(huán)同濃度分離膠的配置不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）所需要各成份體積（ml）Gel%組成 510152025306%水30%5烯酰胺溶液12345LTris510%SDS10%t硫酸氨TEMED水30%5烯酰胺溶液4LTris58%10%SDS10%±硫酸氨TEME

17、D水430沏烯酰胺溶液5LTris510%10%SDS10%±硫酸氨TEMED水30沏烯酰胺溶液246810LTris512%10%SDS10%±硫酸氨TEMED1012水51015530%5烯酰胺溶液LTris15%10%SDS10%t硫酸氨TEMED表5%濃縮膠的配置所需要各成份體積（ml）Gel%組成 123456水30沏烯酰胺溶液LTris5%10%SDS10%±硫酸氨TEMED細(xì)胞破碎獲取蛋白質(zhì) 大腸桿菌細(xì)胞破碎有很多方法，譬如反復(fù)凍融法，滲透沖擊，超聲破碎，壓力破碎等。其 中超聲破碎和壓力破碎破碎是我室常用方法。在建立表達(dá)條件過程中，小量制備樣品可用小

18、型超聲細(xì)胞粉碎儀。 離心 誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，然后視菌體的量加入 300500仙l的緩沖液重懸細(xì)胞，然后置于冰上超聲破碎。因很多實(shí)驗(yàn)室有自己的小型超聲粉碎器，各個(gè)操作不盡相同，具體操作參考儀器說明書。常 規(guī)操作步驟如下（以100ml培養(yǎng)液為例）：（1） 100 ml誘導(dǎo)后的菌液（OD00=左右），12000 rpm, 4c離心2min,收集菌體。(2)加入預(yù)冷的緩沖液50ml,重懸細(xì)胞洗滌菌體一次，12000 rpm, 4c離心2min,收集 菌體；常規(guī)的操作所使用的緩沖液多為 PBS或者Tris-NaCl ,針對(duì)不同的載體和純化方法， 選擇相應(yīng)的緩沖液。對(duì)于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在

19、整個(gè)操作過程中加入一些蛋 白酶抑制劑。(3)向沉淀中加入15ml的緩沖液同上(若菌體太濃，可加倍)，充分懸浮，將菌懸液裝 在一個(gè)玻璃小燒杯中，置于冰水混合物中。(4)破碎：將用緩沖液洗滌過的超聲探頭伸入到菌液中，不要接觸燒杯底部，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為56,頻率為6070%。(5)分離上清和沉淀：12000 rpm, 4c離心20min,分離上清和沉淀。（9） SDS-PAG分析蛋白表達(dá)情況。(7)準(zhǔn)備純化蛋白。超聲破碎注意事項(xiàng)與一些小的改進(jìn)：(1)破碎完全的判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。(2)如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說明超聲功率太強(qiáng)。(3)

20、超聲時(shí)間太長、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。(4)盡量防止泡沫的產(chǎn)生。(5)大量破碎時(shí)將菌液置于一玻璃器皿中，破碎時(shí)放在冰水混合物中，以增加散熱，減小 對(duì)蛋白的破壞作用。(6)破碎前的預(yù)處理，在破碎前可用溶菌酶(100 n g/ml )處理破環(huán)細(xì)胞壁(10min, 30C), 增加細(xì)胞的通透性。高壓破碎是大量的破碎提取細(xì)胞內(nèi)成份的首先方法，相對(duì)于超聲破碎，它具有過程溫和， 操作迅速等優(yōu)點(diǎn)，具體使用需要根據(jù)具體的儀器使用說明。FRENCHPRESS細(xì)胞破碎儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（ 1）使用前將高壓腔、底座、活塞桿在4冰箱中預(yù)冷30min。（2）將三腳固定器置于水平桌面上，將高壓腔正放在固定器器上；在活塞

21、桿的O型環(huán)、底座的。型環(huán)和針形閥的。型環(huán)上均勻涂上少量凡士林。（ 3） ?把活塞桿正向插入高壓腔至最大加樣線，將整個(gè)腔體連同活塞桿一起倒轉(zhuǎn)固定在固定器上。（4） ?將菌液倒入腔體，最大處理量為 35ml,最小為5ml。視樣品體積，大致估計(jì)并調(diào)整活塞桿的位置。（ 5）將針形閥和樣品噴射管裝配于底座上，針形閥擰到輕輕不能擰動(dòng)為止，并向反方向稍微松動(dòng)，保證閥門處于開啟狀態(tài)（注意：務(wù)必不能用力擰緊，否則會(huì)降低其密封性）。把底座倒扣于腔體上，向上調(diào)整活塞桿的位置，直至腔內(nèi)空氣完全排出，流出一滴樣品為止， 輕輕旋緊針形閥。（ 6）雙手托起整個(gè)高壓腔組件，翻轉(zhuǎn)至正向位置，將其置于升降臺(tái)上（事先要確保操作臺(tái)足

22、夠的低，以容的下整個(gè)組件），向后推動(dòng)底座，使底座固定于三個(gè)位置校準(zhǔn)針之間，并調(diào)整腔體使針形閥朝向正面。將固定夾固定于支持桿上，擰緊固定夾上的兩個(gè)螺絲以固定腔體。將活塞桿上的手柄轉(zhuǎn)至與固定夾垂直的方向。（7） ?打開電源，將本3位手柄轉(zhuǎn)至 HIGH檔，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)壓力控制閥至 50psi,升降臺(tái)開始上升， 當(dāng)活塞桿接觸上頂臺(tái)后，繼續(xù)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)壓力控制閥，直至壓力達(dá)到需要的壓力（大腸桿菌的破碎壓力一半設(shè)定為12000psi ，芽孢桿菌設(shè)定為2000psi ）。（ 7）取一冰預(yù)冷的離心管（或者將離心管至于冰中）置于樣品噴射管出口處，輕輕逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)針形閥，小心控制樣品的流出速度，根據(jù)破碎程度決定流速（建

23、議在噴射管出口處接一個(gè)1cm長的透明的塑料管如輸液管，通過觀察塑料管流出樣品的透明度來判斷破碎是否完全）。當(dāng)活塞桿上的安全指示線（Stop Line ）降至腔體上表面時(shí)，迅速關(guān)緊針形閥（不要過緊），旋轉(zhuǎn)檔位手柄至 DOW位置。待升降臺(tái)完全下降后，繼續(xù)降低壓力至零，關(guān)閉電源。（ 8）松開固定夾，取出高壓腔，重新倒置于三腳固定器上，取出底座。將各部分拆開，徹 底清洗。底座及噴射管的內(nèi)壁要重點(diǎn)沖洗，涂有凡士林處要用洗潔精徹底洗凈?！咀⒁馐马?xiàng)】（ 1）儀器最大承受壓力為4000psi （指示針2500）。（2）各O形環(huán)處（包括樣高壓腔，底座，活塞桿和針形閥）一定要涂凡士林潤滑，以降低 磨損，防止損傷。

24、（ 3） 壓力的升高或降低速度要控制在一定范圍內(nèi)。升高壓力前務(wù)必保證整個(gè)組件固定于升降臺(tái)上 , 任何的松動(dòng)可能導(dǎo)致事故。（ 4）活塞桿的手柄要與固定夾垂直，否則會(huì)發(fā)生危險(xiǎn)。（ 5）嚴(yán)禁將出樣閥過分?jǐn)Q緊，否則會(huì)損壞內(nèi)部撞針，以不流出液體為準(zhǔn)。（ 6）嚴(yán)禁使活塞桿下至安全線以下，否則會(huì)導(dǎo)致活塞桿與底座損壞。（ 7）使用完畢要將壓力控制閥轉(zhuǎn)至壓力為零。（ 8）各部件清洗要徹底，否則底座小孔容易堵死，活塞桿上殘留的菌體會(huì)在未洗凈的凡士 林上滋生。（ 9）長期不用應(yīng)保存在干燥的環(huán)境中，必要時(shí)可涂凡士林防止生銹。（ 10）壓力腔的空氣一定要完全排出，否則當(dāng)樣品完全排出時(shí)，造成活塞與壓力池底座直接接觸，造成

25、損傷，由于壓力非常大，有可能導(dǎo)致活塞或壓力池底座變形，造成永久性損傷?。?11）在搬動(dòng)裝好的樣品池時(shí)，一定要雙手，一手扶住住高壓腔，一手托住底座，防止底座脫落而造成事故。（12）。型環(huán)若老化則及時(shí)更換。（ 13）操作過程中禁止將液體濺入機(jī)箱內(nèi)部。(14)儀器使用過程中出現(xiàn)故障應(yīng)及時(shí)與負(fù)責(zé)人聯(lián)系。目的蛋白的純化His Tag純化操作實(shí)例本實(shí)驗(yàn)室中所用的表達(dá)載體 pET28a (+)中含有一個(gè)編碼多聚組氨酸的序列，即 His-Tag , 因此會(huì)獲得帶有His-Tag的重組目標(biāo)蛋白。His-Tag可與金屬Ni2+離子結(jié)合，從而有利于目 標(biāo)蛋白的純化。加上了 His-Tag的蛋白在非變性的條件下可用

26、Ni2+親和層析柱純化。純化 蛋白的原理是：當(dāng)親和層析柱負(fù)載了Ni2+后，可以選擇性吸附暴露在蛋白表面具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基(特別是組氨酸殘基)。蛋白質(zhì)中含有的組氨酸越多，與Ni2+結(jié)合的特異性就越高，則將其洗脫下來會(huì)需要更高的咪唾濃度。含有組氨酸標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白與細(xì)胞中 的總蛋白相比，具有更高的Ni2+結(jié)合特異性。為了得到具有較高純度的目標(biāo)蛋白，必須找 到一個(gè)合適咪睡濃度的洗脫液(結(jié)合緩沖液)，在此濃度下非特異性的雜蛋白能從柱上洗 脫下來，而與Ni2+特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白不會(huì)被洗脫。最后用更高咪唾濃度的緩沖液(洗 脫緩沖液)將目標(biāo)蛋白洗脫下來，此時(shí)目標(biāo)蛋白特異性的存在于該咪睡濃度的洗脫液中，

27、 從而得到純化了的目標(biāo)蛋白質(zhì)。(1)載體構(gòu)建：本實(shí)驗(yàn)采用pET-28a (+)表達(dá)載體，克隆受體菌為 DH5a,表達(dá)宿主為 BL21(DE3)。具體操作參考基因克隆與轉(zhuǎn)化部分。(2)挑一個(gè)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的 單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中(含100仙g/m卡那霉素和)， 于37 c過夜培養(yǎng)。(3)取1ml過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于100ml含100Ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37c 培養(yǎng)2小時(shí)至對(duì)數(shù)生長期。(4)在培養(yǎng)物中加入異丙基硫代半乳糖甘(IPTG)至終濃度為mM按照預(yù)先建立的最佳 表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。(5) 1200 rpm,離心2min,收集菌體。(6)棄上清，向沉淀中加入 5

28、00ml Starting buffer (20mMft酸緩沖液(NaHPO?口 NaHPO), 200mM NaQ 10%甘油，pH ),充分懸浮洗滌菌體。(7) 12000 rpm,離心2min,收集菌體。(8)向沉淀中加入15ml的starting buffer ,重懸菌體。(9)冰浴條件下超聲波處理3min,每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為56, 頻率為6070%,處理時(shí)以不發(fā)生氣泡，不過熱為準(zhǔn)，以菌液變清晰為終止標(biāo)準(zhǔn)。(10) 12000 rpm, 4c離心20min,將上清移到干凈滅過菌的 50ml離心管。SDS-PAG分析蛋白的表達(dá)情況。若目的蛋白分布在上清中，

29、繼續(xù)進(jìn)行下面的純化操作。(1)灌制好Ni2+-NTA親和層析柱(Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱？)，用去離子水進(jìn)行緩慢 洗脫，避免在柱床中引入氣泡。(2)用10倍柱床體積的starting buffer進(jìn)行預(yù)平衡，上樣，將細(xì)胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA親和層析柱中。(3)用10倍ml的starting buffer 進(jìn)行漂洗，收集濾過液。(4)開始用5倍柱床體積的含20 mM坐的starting buffer進(jìn)行洗脫，并對(duì)洗脫液進(jìn)行 收集。(5)依次用 5 倍柱床體積的含 40 mM 60 mM 80 mM 100 mM 200 mM 300 mMf口 500 mM 咪坐的startin

30、g buffer進(jìn)行洗脫，分別對(duì)洗脫液進(jìn)行收集。(6)通過SDS-PAGE測(cè)回收的效果，確定咪睡最合適洗脫濃度。(7)從每管收集白濾出液取出10口 的樣品，加入10仙l的2X SDS凝膠加樣緩沖液，搖 勻。(8)沸水浴處理3min。(9)取出樣品，將10仙l樣品全部上樣于適當(dāng)濃度的SD瞇丙烯酰胺凝膠上電泳。【注意事項(xiàng)】(1)樣品可貯存于4C,以備在聚丙烯酰胺凝膠上加樣。(2)用考馬斯亮藍(lán)或銀染液進(jìn)行染色，檢測(cè)重組蛋白的純化程度，并找到咪睡最合適洗脫 濃度，也就是純化蛋白含量最多的一管洗脫液所對(duì)應(yīng)的濃度；并將該純化出來的蛋白質(zhì)經(jīng) 過PD-10柱子以去掉溶液中的咪坐。(3)蛋白質(zhì)被洗脫完成之后，要

31、及時(shí)地清洗柱子，使柱子能重復(fù)使用。(4)在下次對(duì)同一蛋白的純化過程中，即可根據(jù)膠圖所顯示的個(gè)洗脫液中蛋白濃度的情況 來優(yōu)化整個(gè)洗脫過程。蛋白質(zhì)溶液的去鹽處理 (使用PD-10去鹽柱)(1)用 10ml 的 starting buffer 平衡 PD-10去鹽柱。(2)上樣：往PD-10去鹽柱中加入的蛋白質(zhì)溶液。(3)用10ml的starting buffer去洗PD-10去鹽柱，開始收集濾出液，每 1ml收集一管。 離心管應(yīng)該先在冰上預(yù)冷。(4)電泳檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的純化程度。(5)具體方法和過程與上面步驟一致。(6)選擇合適的純化蛋白樣品，加入1倍體積的預(yù)冷甘油。接著將蛋白質(zhì)樣品置于80c 保

32、存，以備使用?！咀⒁狻縋D-10去鹽柱可以多次反復(fù)使用，但是不能使柱子變干，保存時(shí)應(yīng)該用相應(yīng)的緩 沖液浸泡，并且置于4C。圖1 : PD-10去鹽柱除去鹽離子示意圖(載自 Amersham Biosciences產(chǎn)品說明)(1)若His標(biāo)簽蛋白沒有結(jié)合，請(qǐng)依次檢查：可能原因1:樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確。策略：檢測(cè) pH及樣品和結(jié)合緩沖液的組 成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唾的濃度不是太高?？赡茉?:組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露策略：在變性條件下（用48 M月尿，或46 M鹽酸月瓜）進(jìn)行純化?？赡茉?: HIS標(biāo)簽丟失。策略1： WBgc者anti-his 的抗體檢查His是否

33、表達(dá)，上 游構(gòu)建，改變his-tag 的位置（C-terminal or N-terminal），必要時(shí)增加his個(gè)數(shù)（常用6 10個(gè)）；策略2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間；策略 3:改變螯合的金屬 離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。（1） 若沒有洗脫下來，請(qǐng)依次檢查：可能原因1:洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）。策略：用增加咪睡的梯度洗脫或降低 pH來找出最佳的洗脫條件?？赡茉?:降低PH的方法洗脫的，因?yàn)槿鬚H低于，會(huì)導(dǎo)致鍥離子脫落。策略：改變 洗脫辦法，咪唾競(jìng)爭性洗脫?？赡茉?:蛋白已沉淀在柱上。策略：減少上樣量，或使用咪唾的線性梯度而不是分

34、 步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫 （用48 MW,或46 M鹽酸11）?？赡茉?:非特異性疏水或其他相互反應(yīng)。策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如, 2%Triton X-100 ）或增加 NaCl 的濃度。（3） HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多，什么原因？如何優(yōu)化？高純度的蛋白是純化工作者的追求， 但是由于很多天然的蛋白也會(huì)帶有 HIS,所以經(jīng)常 會(huì)出現(xiàn)HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優(yōu)化的方法如下：可能原因1:蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白。策略：請(qǐng)?zhí)砑拥鞍酌敢种苿ㄉ饔肊DTA。可能原因2:雜質(zhì)對(duì)鍥離子有更高的親和性。策略 1

35、:咪唾濃度必須優(yōu)化，以確保高純 度（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合）和高產(chǎn)率（組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合）之間的最 佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優(yōu)的咪唾結(jié)合和清洗濃度；在樣品中加入與結(jié)合緩沖 液同樣濃度的咪陛；咪睡的梯度不大（20個(gè)或更多的柱床體積），可能分離出有相似結(jié)合 強(qiáng)度的蛋白。策略2:篩選最適合的緩沖液條件，NaCl濃度，PH的范圍都需要進(jìn)行篩選，以便決定最適的結(jié)合和洗脫條件。對(duì)于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時(shí)，將緩沖液、鹽、 甘油和還原劑設(shè)計(jì)成幾個(gè)不同的混合配方?？赡茉?：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起。策略：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，（2 %Triton

36、 X-100 or 2 %Tween20）；或者在 wash buffer中增加甘油的濃度（50%）減少非特異性的相互反應(yīng)；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子可能原因4：洗滌不充分。策略：增加洗滌的次數(shù), 使洗滌充分。NTA樹脂在使用若干次數(shù)（35次）后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高 樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。注意：NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計(jì)出NTA的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦辉偕芤?流干后，再加下一再生溶解。用戶需要自行準(zhǔn)備25%， 50%， 75%， 100%（ v/v ）乙醇和去離子水。NTA再生步驟：（1）從層析

37、柱下端流干所有溶液，用2倍NTAW脂體積的Acetic Acid/6M g仙anidine HCl 洗。（2）用2 倍體積的去離子水洗。（3）用3倍體積的2% SDSt（4）用1 倍體積的25%乙醇洗。（5）用1 倍體積的50%乙醇洗。（6）用1 倍體積的75%乙醇洗。（7）用5 倍體積的100%乙醇洗。（8）用1 倍體積的75%乙醇洗。（9）用1 倍體積的50%乙醇洗。10）用1 倍體積的25%乙醇洗。（11）用1 倍體積的去離子水洗。（12）用5 倍體積的EDTA洗。（13）用3 倍體積的去離子水洗。（14）如果立即使用，用5倍體積的100mM洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0buf

38、fer 或 Gn NTA-0 buffer ）洗。（ 15）如果想長期儲(chǔ)存，加入1 倍體積的20%乙醇，4 度保存，使用前需要執(zhí)行步驟14。GST 親和標(biāo)簽的純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST是繼組氨酸之后的第二個(gè)應(yīng)用最多的重組蛋白標(biāo)記。GST融合于目標(biāo)蛋白的N端，可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。由于 GST對(duì)底物還原 性谷胱甘肽的親和力是亞摩爾級(jí)的，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對(duì)GST及其融合蛋白的純化效率很高。用1ml 的樹脂純化1L 的大腸桿菌培養(yǎng)物可得到的目的蛋白產(chǎn)率為mg。GST親和純化融合蛋白主要包括結(jié)合，洗滌，洗脫三個(gè)步驟，全過程只需要一到兩種緩沖液，可以大量

39、純化，也可以小量的實(shí)現(xiàn)快速純化。非常適合實(shí)驗(yàn)室小量制備大腸桿菌重組蛋白。下面以克隆到表達(dá)載體 pGEX-6p-1上的GFP表達(dá)純化為例，介紹一種小量快速的純 化方法，供大家參考。蛋白的誘導(dǎo)與樣品的制備方法基本同上。（1）從4c冷柜中取出Glutathione Sepharose 4B （本產(chǎn)品購置 G玄司，儲(chǔ)存于20%.醇，樹脂的量和20%乙醇1： 1），輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻樹脂懸濁液。（2）用寬嘴吸頭吸取1ml的脂漿，加入到裝有40ml的PBS整個(gè)操作過程所有的PB均需 預(yù)冷）V型離心管中，輕柔顛倒數(shù)次，洗滌除去殘留的20%J2000 rpm,離心5min,小心傾倒出PBS。（ 3）將破碎后的

40、上清加入平衡上一步驟中的樹脂中，輕輕混勻，4振蕩溫育，500 rpm ，1h,期間不斷混勻，防止樹脂沉淀，保 GST-GF吩分結(jié)合于樹脂上。（4） 2000 rpm,離心5min,小心傾倒出上清。（5）向沉淀中加入約 40ml的PBS輕柔混勻，振蕩溫育10 min, 2000 rpm,離心5min, 小心傾倒出上清。（6）重復(fù)步驟（5） 一次，然后向沉淀中加入5ml的PBS懸浮樹脂，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè) 10ml 的塑料層析柱，并打開閥門放掉PBS。（ 7）洗脫收集目的蛋白。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要不同有兩種方法來收集目的蛋白。方法一：是不切除GST-tag,可以向（6）中的樹脂中加入12ml的洗脫緩沖液

41、（50 mM Tris-HCl , 10 mM還原性谷胱甘肽（GSH , pH ）,輕輕混勻然后4c溫育10min,收集流 出液，即為GST-GFP勺純化產(chǎn)物。方法二：是純化不含GST-tag 的蛋白，按照說明書將蛋白酶PreScission Protease （ GE公司）用PBS稀釋到到1ml,加入到（6）中的樹脂中，輕輕混勻然后 4c溫育12h,收集 流出液，即為GFP的純化產(chǎn)物。（8） SDS-PAG分析純化的蛋白?？梢詫?duì)操作過程中的每一步取樣進(jìn)行SDS-PAG分析。n tathione Sepharose 4B 再生GST?Bind樹脂可以重復(fù)使用數(shù)次而無需再生。但隨著非特異性結(jié)合的

42、蛋白的增多和蛋白的聚集，往往會(huì)造成流速和結(jié)合載量都下降。為了去除結(jié)合在樹脂上的蛋白，可以用10 倍體積的50mMTris-HCl , NaCl,洗樹脂，接著用10倍體積的100mM昔酸鈉，NaCl再洗一次。其它可以選用做去除污染蛋白的緩沖液還包括： 6M尿素，6M鹽酸月瓜或低極性溶劑，如50 70%乙醇或50%乙二醇。任何上述處理后應(yīng)該立即用10 倍柱體積1X GST Bind/Wash buffer平衡。樹脂可以在4下，20%乙醇 /80%水中長時(shí)間存放。（ 1）目標(biāo)蛋白結(jié)合效率低結(jié)合條件不對(duì)：仔細(xì)核對(duì)各種溶液、緩沖液的成分和pHo低于或高于pH8時(shí)，融合蛋白與GST?Bind樹脂會(huì)結(jié)合不充

43、分。確保樹脂在與細(xì)胞裂解液結(jié)合前經(jīng)過緩沖液（如 1X GST Bind/Wash buffer , PBS的平衡細(xì)胞裂解前加入 DTT會(huì)顯著改善某些GST8合蛋白與 GSTBind樹脂的結(jié)合GST融合蛋白被超聲打斷降解：過度超聲會(huì)破壞帶標(biāo)簽的蛋白而減少其與樹脂的結(jié)合。采用溫和的超聲條件或改用其它的破碎方法。蛋白的折疊問題：GST標(biāo)簽不能夠正確的折疊難以結(jié)合 GSH勺底物。( 2)蛋白難以洗脫洗脫體積太少：有時(shí)需要使用更多的緩沖液洗脫目的蛋白。洗脫緩沖液不新鮮：10XGST洗脫緩沖液-20c下可以加I定存放6個(gè)月，最多耐受5次凍融。每次在臨純化前新鮮配制1X洗脫緩沖液洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低

44、：GST?BindW脂的還原型谷胱甘肽濃度達(dá)到 10mMK夠了。但是洗脫時(shí)需要的還原型谷胱甘肽的濃度需要達(dá)到75mM。( 3)純化的蛋白雜質(zhì)很多表達(dá)的蛋白不完整：再遇到一些稀有密碼子或者特殊的RNA勺二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可能使得目標(biāo)蛋白截短表達(dá)，可采用一些特殊的表達(dá)宿主，如Rosetta 系列。洗滌體積不夠：增加洗脫量。洗脫條件：可已在洗脫緩沖液中加入一定量的非離子去污劑，如%的 Triton-100 或 NP-40等。也可以嘗試提高洗脫時(shí)NaCl 的濃度，以降低非特一性的結(jié)合。操作過程中目標(biāo)蛋白降解：控制操作條件，比如嚴(yán)格4操作，緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，超聲處理過度：減少超聲，避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白變性

45、。過度超聲還會(huì)增加宿主內(nèi)源蛋白與GST融合目的蛋白共純化共價(jià)共純化：膠上有些多出來的條帶是共純化的促進(jìn)蛋白正確折疊的分子伴侶，如：DnaK(70kDaj) , DnaJ (37kDa) , GrpE (40kDa) , GroEL (57kDaj),和 GroES (10kDaj),再進(jìn)行一次純化可以改善。親和標(biāo)簽的純化原理：pMAL系統(tǒng)是一種高效的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)。pMALB體含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose Binding Protein, MBP )的大腸桿菌 malE基因，其下游的多克隆位點(diǎn)便于 目的基因插入，表達(dá)N端帶有MBP勺融合蛋白。通過“ tac”強(qiáng)啟動(dòng)子和malE

46、翻譯起始信 號(hào)使克隆基因獲得高效表達(dá)，并進(jìn)一步利用MBP寸麥芽糖的親和性達(dá)到用Amylose柱對(duì)融合蛋白的一步親和純化。此系統(tǒng)的pMALt體含有LacZa基因，目的基因的插入導(dǎo)致其失活，通過 X-gal平板可進(jìn) 行藍(lán)白斑篩選。pMAL載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通 過 Factor Xa (X) , Enterokinase (E)或 GenenaseTM (G)可將目白蛋白與 MBPH割分 離。pMALTM-c2系列載體缺失malE信號(hào)序列，導(dǎo)致融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。pMAL-p2系列載 體含有 malE 信號(hào)序列，它可引導(dǎo)融合蛋白穿過胞質(zhì)膜，進(jìn)入周質(zhì)。所有這些

47、載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過Factor Xa ( X)，Enterokinase(E)或GenenaseTM I (G)可將目白蛋白與 MBPU割分離。Amylose 樹脂預(yù)裝柱是一親和基質(zhì)，用來分離與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的目的蛋白。結(jié)合容量：每毫升柱床體積可結(jié)合mg MBP-Paramyosin 融合蛋白。貯存：本品預(yù)膨脹在20%勺乙醇中，4° C貯存。過柱緩沖液：20 mM Tris-HCl ， 200 mM NaC，l 1 mM EDTA。添加劑：1 mM sodi 仙 m azide ； 10 mM 0 mercaptoethanol 或 1

48、mM DTT洗脫緩沖液：過柱緩沖液+10 mM麥芽糖實(shí)驗(yàn)步驟：( 1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和細(xì)胞破碎同上。( 2)融合蛋白的親和純化：預(yù)裝柱用812倍柱床體積的雙蒸水沖洗;預(yù)裝柱用9 倍柱床體積過柱緩沖液平衡；將上述實(shí)驗(yàn)步驟三的上清液加入到柱床內(nèi)，控制流速1 ml/min （建議每次上樣24ml）用12倍柱床體積的過柱緩沖液淋洗未結(jié)合蛋白，每次用6ml,共4次。用4倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫與 Amylose樹脂結(jié)合的MBP蟲合蛋白，控制流速約1 ml/min。收集35管樣品洗脫液，收集體積為1 ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白 在一個(gè)柱床體積內(nèi)將被洗脫下來，可以通過

49、波長為 280 nm的紫外吸收光或考馬斯亮藍(lán)蛋白 檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PAG檢測(cè)洗月羊品*。再生。每次純化蛋白完畢后，需要及時(shí)對(duì) Amylose樹脂進(jìn)行再生。Amylose樹脂可以采用 下述清洗步驟進(jìn)行再生水3倍柱床體積% SDS3倍柱床體積水1倍柱床體積過柱緩沖液3倍柱床體積【注意事項(xiàng)】（ 1）每次使用時(shí)，請(qǐng)先打開頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進(jìn)入到預(yù)裝柱內(nèi)。（ 2）在使用本預(yù)裝柱時(shí)，請(qǐng)使用經(jīng)過脫氣后的緩沖液，以避免產(chǎn)生氣泡。（3）預(yù)裝柱在每次使用完畢后，在柱床上方加入24 ml緩沖液或水，蓋上頂端的帽子后，隨即蓋上底部的帽子，豎立放置于4貯存。（ 4）長期貯存時(shí)應(yīng)貯存在含疊氮鈉

50、的緩沖液中或20乙醇中，以避免染菌?！緋MALK統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)】1） 75%的蛋白可獲得高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)量可達(dá)100 mg/L（2）與其他幾種常用表達(dá)系統(tǒng)研究比較，與 MBP蟲合表達(dá)更能提高E. coli表達(dá)蛋白的可 溶性。（ 3）采用麥芽糖溫和洗脫：無去污劑或變性劑對(duì)蛋白活性的影響。（4）可在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)（pMAL-p2X載體）：周質(zhì)表達(dá)可提高二硫鍵的形成，促進(jìn)蛋白折疊的形成。目的蛋白的后處理目的蛋白的濃縮蛋白的濃縮液是蛋白純化過程中常用的操作，常用的方法有：（ 1）透析袋濃縮法利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無透析袋可用玻璃紙代替），結(jié)扎，把高分子（6 00012 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚 乙烯叱咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成 3040%濃度的溶液，將 裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。（ 2）