心肌肌鈣蛋白I異常病人血清結(jié)締組織生長因子表達的研究

1、心肌肌鈣蛋白I異常病人血清結(jié)締組織生長因子表達的研究                                        作者：趙桂琴，吳國球，劉乃豐    【摘要】&#

2、160; 目的:檢測心肌肌鈣蛋白I（cTn I）異常病人血清中結(jié)締組織生長因子（CTGF）水平的變化，探討CTGF在心肌損傷病人血清中表達的意義。方法:化學(xué)發(fā)光法檢測血清中cTn I水平，并根據(jù)cTn I水平分組；利用生物素親和素EIA分析法檢測各組病人血清中CTGF水平。結(jié)果:80例病人血清標本按cTn I水平分為、 3組，CTGF平均水平依次為（13.04±685）、（21.67±8.35）及（35.06±24.12）ng·ml1。其中，、組血清CTGF水平明顯高于正常對照組（均P<0.05），組與正常對照組比較差異不顯著（P>0.05）

3、，、組與組比較差異顯著（均P<0.05），組與組比較差異顯著（P<0.05）。結(jié)論:CTGF在心肌損傷以及心肌梗死后表達上調(diào)，可能與心肌纖維化關(guān)系密切。 【關(guān)鍵詞】  心肌肌鈣蛋白I；結(jié)締組織生長因子；心肌損傷；心肌梗死；心肌纖維化結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是近來發(fā)現(xiàn)的一種重要的細胞因子，主要由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等合成分泌，成年哺乳動物心、腦、腎、肺、肝以及胎盤中均有表達，它與動脈粥樣硬化，心、肝、肺、腎等器官的纖維化以及創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān)15。人心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，

4、cTn）包括C、T、I 3個亞單位，其中I亞單位（cTn I）在心肌損傷后46h釋放入血，1436h達到峰值，是一個十分敏感的特異性心肌損傷標志物，在診斷急性心肌梗死（簡稱心梗）、判斷梗死面積、評價容栓效果等方面具有重要意義。本研究調(diào)查不同cTn I水平病人血清中CTGF水平的變化，探索其在心梗后心肌纖維化中的意義。1  材料與方法1.1  實驗材料CTGF單克隆抗體、多克隆抗體及CTGF標準品（作者所在實驗室制備），水溶性生物素(SulfoNHSLCBiotin)、親和素(Avidin)和BiotinHRP(Pierce公司，美國)，化學(xué)發(fā)光cTn I檢測試劑盒(Beck

5、man公司,美國)，高吸附96孔板(Biomat，上海晶美公司),全自動洗板機(BioRad公司，美國)，全自動酶聯(lián)儀(ALISEI，意大利)，全自動化學(xué)發(fā)光儀(Access，美國)。80例病人血清標本來自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院臨床檢驗中心，10例正常人血清標本來自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院體檢中心。1.2  實驗方法1.2.1  cTn I的檢測及分組所有血清標本采用雙盲方式根據(jù)cTn I檢測試劑盒、全自動化學(xué)發(fā)光儀操作說明及規(guī)程檢測cTn I水平。并根據(jù)試劑盒診斷標準和ACC/AHA對于心梗的診斷標準，將病人分成排除心肌損傷組（組）、心肌損傷組(未發(fā)生心梗，組）及心梗組（組）3

6、組。10例正常人血清標本設(shè)為正常對照組。1.2.2  CTGF的檢測  包被  CTGF單抗用0.05mol·L1 NaHCO3緩沖液（pH 9.6）配制成2g·ml1，以100l·孔1包被96孔板酶標板，4過夜。用含0.5%Tween80 0.1mol·L1的PBS(pH 7.4)洗滌3次后加入150l含2%酪蛋白的0.1mol·L1 PBS(pH 7.4),37孵育2h，洗滌5次后4密封保存。  生物素標記CTGF多克隆抗體  取10mg CTGF多克隆抗體，用1

7、ml0.1mol·L1 PBS(pH 7.4)溶解，加入16l(28mg·ml1)水溶性生物素，混勻，室溫放置30min后，將混合物轉(zhuǎn)入透析袋，置于1 L含0.01mol·L1PBS(pH 7.4)的透析液中，4過夜，除去未反應(yīng)的生物素。  ABC復(fù)合物的制備  取5ml0.1mol·L1的PBS(pH 7.4)，加入45l Avidin和45l BiotinHRP，混勻，室溫反應(yīng)30min。  檢測  取50l待測樣品及系列稀釋的CTGF標準品（01 000ng·ml1）樣品

8、加入已包被CTGF單抗的酶標板中，37 1h，洗板6次后加入1300 稀釋的BiotinCTGF多抗，37孵育1h，洗板6次后各孔加入50l ABC酶復(fù)合物，室溫30min后加入顯色液A和B各50l，室溫20min，加入50l 2mol·L1 H2SO4終止反應(yīng)，在全自動酶標儀上測定A450值。根據(jù)標準曲線計算標本中CTGF的濃度。1.3  統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果用x-±s表示，采用單變量SNK法q檢驗，P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)果80例病人血清標本CTGF平均水平為（25.79±19.71）ng·ml1,組(n=15)、組

9、(n=28)、組(n=37)和正常對照組(n=10)血清CTGF平均水平依次為（13.04±6.85）、（21.67±8.35）、（35.06±2412）及（14.80±7.13）ng·ml1，、組明顯高于正常對照組（均P<0.05），組與正常對照組比較差異不顯著（P>0.05）。、組與組比較差異顯著（均P<0.05），組與組比較差異顯著（P<0.05），見圖1。、組與正常對照組比較，均P<0.05；組與正常對照組比較，P>0.05；、組與組比較，均P<0.05；組與組比較，P<0.05圖1

10、60; 各組cTn I和CTGF水平（略）Fig 1  The levels of cTn I and CTGF in all groups  CTGF levels of group and group significantly increased as compared with control group and group (all P<005).Grouphad no significance as compared with control group(P>0.05).There was a statistical significance bet

11、ween group and group (P<005)                             3  討論CTGF是高度保守的CCN多肽家族成員之一，該家族包括CTGF、CYR61、Nov以及最新發(fā)現(xiàn)的WISP1/elm1、WISP2/rCop1、WISP3（WISP，Wntinduc

12、ible secreted protein），由349個氨基酸組成，富含半胱氨酸，相對分子質(zhì)量36 00038 000，包含4個主要的蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白區(qū)、von Willebrand因子C型重復(fù)區(qū)、血小板反應(yīng)蛋白（thrombospOndin）1型重復(fù)區(qū)以及生長因子半胱氨酸群，這些區(qū)域都由獨立的外顯子編碼1。CTGF可誘導(dǎo)成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細胞增生分化、胚胎發(fā)育以及傷口愈合68。CTGF是促進心肌纖維化的重要細胞因子。CTGF的N端調(diào)節(jié)肌成纖維細胞分化和膠原合成，C端調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖9。本實驗心肌損傷組CTGF平均水平明顯高于排除心肌損傷組和正常對照

13、組，這與Chen等10在有心肌缺血病人心臟標本中檢測到的CTGF表達增加一致。心肌損傷作為一種炎癥反應(yīng)，能釋放包括CTGF在內(nèi)的多種炎癥細胞因子，而TGF、PDGF、FGF、VEGF等細胞因子能刺激CTGF表達上調(diào)11；同時CTGF參與組織的損傷修復(fù)過程，所以在心肌損傷后表達也會增加。心衰致心肌受損，功能下降，又加重心衰，形成惡性循環(huán)，腎上腺素、內(nèi)皮素大量釋放可以引起CTGF持續(xù)表達增加，同時氧化應(yīng)激、機械刺激狀態(tài)的持續(xù)存在也能刺激CTGF表達升高。Ahmed等12實驗顯示實驗誘導(dǎo)的心衰豬3周后心肌CTGF mRNA水平增加5倍。急性肺栓塞引起心肌損傷造成心肌缺血缺氧，可誘導(dǎo)心臟成纖維細胞CT

14、GF表達增加，預(yù)示著CTGF與心肌損傷后的心肌纖維化關(guān)系密切。急性心梗是心肌損傷的嚴重階段，心梗后壞死的心肌纖維被溶解吸收，纖維肉芽組織形成，梗死區(qū)膠原纖維組織增加，同時伴纖維化反應(yīng)，最終形成纖維疤痕組織。而間質(zhì)成纖維細胞是正常心肌膠原合成的主要來源，肌成纖維細胞是心梗后心室重構(gòu)的重要原因。CTGF可以促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，離體實驗中，CTGF能刺激成纖維細胞增殖。而CTGF能誘導(dǎo)心臟成纖維細胞分泌表達膠原和纖黏蛋白13，并能增加心梗部位膠原和纖黏蛋白的表達量10,14。  本實驗心梗組的CTGF 平均水平明顯高于其他組，提示心梗后的心肌纖維化可能與CTGF的表達密切

15、相關(guān)。心梗后RAS系統(tǒng)興奮，Ang可以刺激CTGF的表達，大鼠心臟成纖維細胞用Ang刺激后能經(jīng)AT1R途徑引起CTGF mRNA和蛋白質(zhì)表達增加，此作用可以被AT1R拮抗劑losartan抑制15，醛固酮也可以通過MAPK通路和鹽皮質(zhì)激素受體刺激CTGF的表達16。Ohnishi等14在心梗大鼠的實驗研究中發(fā)現(xiàn)CTGF在梗死區(qū)肉芽組織中的成纖維細胞中高表達，而在其他大鼠的心梗實驗中發(fā)現(xiàn)左右心室的非缺血區(qū)都有CTGF的表達，在心梗后2 d心肌CTGF mRNA水平增加，一直持續(xù)到心梗后42 d，這些實驗說明CTGF mRNA的誘導(dǎo)高表達從心梗后持續(xù)到心梗后較晚的重構(gòu)階段。Dean等17實驗顯示在

16、心肌梗死后180 d CTGF mRNA和蛋白仍有大量表達，提示了CTGF與心梗后心肌纖維化密切相關(guān)心肌損傷后，無論有無發(fā)生心梗，都伴有神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活，Kemp等18研究顯示用100mol·L1去氧腎上腺素作用新生兔的心肌1h 或24h，CTGF mRNA最多增加了2.5倍，作用424h，CTGF蛋白質(zhì)最多增加了5倍，在培養(yǎng)的血管平滑肌細胞ET1通過ETA受體上調(diào)CTGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達19，因此神經(jīng)內(nèi)分泌因素都會增加心肌損傷后CTGF的表達。心肌纖維化是心室重構(gòu)的重要組成部分20，心肌損傷后的心室重構(gòu)、左心室擴張、心臟功能下降和死亡率的增加相關(guān)。本實驗心肌損傷組和心梗

17、組CTGF水平明顯升高，提示CTGF的表達與心肌損傷后的心肌纖維化相關(guān)，心梗組的CTGF平均水平明顯高于心肌損傷組，且兩組有統(tǒng)計學(xué)差異，提示CTGF與心梗后心肌纖維化的關(guān)系更為密切。【參考文獻】  1LAU L F，LAM S C.The CCN family of angiogenic regulators: the integrin connectionJ.Exp Cell Res，2000,248:4457.2BORK P.The architecture of a new family of growth regulators related to connective ti

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