平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)-文獻(xiàn)版

1、01年 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 貼壁法原代培養(yǎng)1.1 細(xì)胞培養(yǎng)1.3 培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定04協(xié)和 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志 胰酶消化法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞1.1 試劑和動(dòng)物胰酶購(gòu)自Sigma公司;-actin抗體購(gòu)自中山生物技術(shù)有限公司;PBS液各成分均為市售分析純;新生小牛血清購(gòu)自HyClone;DMEM為Gibco產(chǎn)品。雄性Wistar大鼠(2只,體重175±25 g)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2 胰酶消化法原代培養(yǎng)Wistar大鼠處死,迅速取出胸主動(dòng)脈,浸泡在含無(wú)菌PBS的表面皿中,轉(zhuǎn)移到無(wú)菌超凈臺(tái)。在表面皿中漂洗主動(dòng)脈去除殘留的血跡,縱向剪開(kāi)主動(dòng)脈,把主動(dòng)脈鋪平并使內(nèi)膜朝上,用鑷子來(lái)回刮除

2、內(nèi)膜層,剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎,碎片大小在1 mm×1 mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養(yǎng)瓶中于37條件下消化。當(dāng)在顯微鏡下觀察組織塊表面出現(xiàn)大量細(xì)胞時(shí)應(yīng)立即加入血清終止消化,一般消化的時(shí)間在3.5 h。終止消化后將玻璃培養(yǎng)瓶置于37空氣搖床振搖10 min,繼續(xù)用吹打的方法使組織塊表面的細(xì)胞盡可能脫落。待細(xì)胞從組織塊脫離后,120目細(xì)胞篩過(guò)濾,轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)離心,棄上清,用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞,最后接種于25 mL培養(yǎng)瓶,放入CO2孵箱培養(yǎng),48 h后換液。1.3 傳代培養(yǎng)細(xì)胞融合后,倒去舊的培養(yǎng)液,加入適量的0.25%胰酶,顯微鏡下觀察

3、,見(jiàn)細(xì)胞收縮后去除消化 液,加入適量培養(yǎng)液,吹打細(xì)胞,以12接種于新培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)足培養(yǎng)液,放入37、5%CO2孵箱培養(yǎng)。傳代細(xì)胞從第三代開(kāi)始可換用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。VSMC至少可以傳16代以上,并且從第二代開(kāi)始平滑肌細(xì)胞即可凍存。1.4 動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定相差顯微鏡下,細(xì)胞未匯合之前多數(shù)呈梭形,至匯合后,部分區(qū)域細(xì)胞束狀排列,呈典型的“峰和谷”狀態(tài)。將傳代獲得的平滑肌細(xì)胞接種于蓋玻片上,34天后至亞匯合狀態(tài),取出細(xì)胞爬片,PBS清洗后用4純丙酮固定1530 min,自然晾干。采用小鼠抗大鼠-肌動(dòng)蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定VSMC肌動(dòng)蛋白。根據(jù)S-P免疫組織化學(xué)染色的常規(guī)

4、方法,以平滑肌細(xì)胞胞漿棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。05重慶醫(yī)學(xué)/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床1 材料與方法1.1 材料 912d新生健康清潔級(jí)KM小鼠,雌雄不限,購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。RPMI-1640干粉培養(yǎng)基,D-Hanks粉,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,胰蛋白酶粉(1250)均購(gòu)自Hy-Clone公司;青霉素鈉、硫酸鏈霉素購(gòu)自華北制藥廠;鼠抗兔平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體,購(gòu)自Zymed公司;SP免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 斷頸處死小鼠,75%乙醇浸泡消毒2min,分離取出胸主動(dòng)脈,D-Hanks液清洗去除血污,獲干凈光滑的血管段,用眼科鑷固定血管段端,刀片輕刮去外膜結(jié)締組

5、織,再用眼科剪小心剖開(kāi)血管,刮去內(nèi)膜層細(xì)胞,將血管段剪成1mm×1mm大小的組織塊,均勻貼放于25ml培養(yǎng)瓶底面,組織塊間隙約23mm,加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液23ml,輕晃培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液掠過(guò)組織塊,翻轉(zhuǎn)靜置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中34h,再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊浸沒(méi)于培養(yǎng)液中,半開(kāi)放式絕對(duì)靜置培養(yǎng)3d,45d時(shí)首次換液。當(dāng)組織塊周圍外長(zhǎng)的細(xì)胞相互匯合,逐漸鋪滿整個(gè)瓶底時(shí),需進(jìn)行首次傳代:吸棄舊培養(yǎng)液,D-Hanks液2ml清洗后吸棄,加0.25%(g/L)胰酶液2ml在37下消化,25min后鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞回縮、間隙增大時(shí),吸棄胰酶液,加入含10%胎牛血清的1640培

6、養(yǎng)液46ml終止消化,反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,形成的細(xì)胞懸液按12接種(消化后脫落的組織塊可一并傳入新培養(yǎng)瓶中)。以后的傳代方法相同,傳代周期為57d。1.3 細(xì)胞純化1.4 細(xì)胞鑒定細(xì)胞培養(yǎng)的幾點(diǎn)技巧:相同條件下,小齡動(dòng)物較大齡動(dòng)物的組織塊有更好的增殖潛能,但動(dòng)物體積過(guò)小又存在取材困難,組織量少的問(wèn)題,采用912 d新生小鼠取材,既能對(duì)血管進(jìn)行順利操作,又能保證約90%的組織塊有細(xì)胞外長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)具有接觸抑制和密度依賴性,一般取23只小鼠的胸主動(dòng)脈組織塊均勻接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,間隙約23 mm。當(dāng)部分組織塊周圍細(xì)胞密集、重疊,停止增殖時(shí),即使整瓶細(xì)胞未達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn),仍可用酶消化,吹散密集細(xì)胞

7、,11方式傳代生長(zhǎng)。原代培養(yǎng)初期,當(dāng)部分組織塊漂浮未貼壁,可將其重新擺放至瓶底,翻轉(zhuǎn)干涸23 h后,再浸沒(méi)于培養(yǎng)液中,使其重新貼壁。該法不會(huì)影響同瓶中其他已萌出細(xì)胞的生長(zhǎng)。小鼠主動(dòng)脈極細(xì),操作時(shí)動(dòng)作一定要輕柔,避免對(duì)血管的過(guò)度損傷。一般受牽拉少,剪切時(shí)邊緣整齊圓滑的組織塊萌出細(xì)胞的概率較大。細(xì)胞傳代時(shí),酶消化時(shí)間不應(yīng)固定或硬搬他人經(jīng)驗(yàn),應(yīng)在鏡下觀察,至胞質(zhì)回縮,間隙增大時(shí)及時(shí)終止消化。細(xì)胞原代培養(yǎng)的常用方法有酶消化法和組織塊法,酶消化法培養(yǎng)周期短,但酶作用時(shí)間不易掌握,且消化酶本身對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞有毒性作用,可致培養(yǎng)失敗;組織塊法雖培養(yǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng),但操作簡(jiǎn)便,污染機(jī)會(huì)小,培養(yǎng)效率高3,4。本研究中

8、由于新生小鼠主動(dòng)脈細(xì)小,可供培養(yǎng)的組織量少,于是采用了組織塊培養(yǎng)法。07濱州醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào) 改進(jìn)的臍動(dòng)脈血管平滑肌貼塊培養(yǎng)法用DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗,以去掉血管內(nèi)外的血跡,用眼科鑷小心分離下動(dòng)脈外的結(jié)締組織及血管外膜,然后用眼科剪縱向剪開(kāi)血管,再用眼科剪將中膜和內(nèi)膜剪成約12 mm2大小的組織塊,用彎頭吸管將血管小塊移入25 cm2塑料培養(yǎng)瓶,并以47塊/cm2的密度均勻排列于 培養(yǎng)瓶底(培養(yǎng)瓶底提前用培養(yǎng)液濕潤(rùn)),翻轉(zhuǎn)后加入含有青霉素和鏈霉素及20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液約35 m,l放入37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(濕度100% ),貼壁23 h后再輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使組織塊浸入到培養(yǎng)液中,開(kāi)放式培

9、養(yǎng),一周后取出觀察并換液。1.2. 2 胎兒臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的傳代培養(yǎng):細(xì)胞生長(zhǎng)融合后,用0. 125%的胰蛋白酶消化傳代。先將胰蛋白酶放入37水浴箱預(yù)熱。用吸管將組織塊從培養(yǎng)瓶底輕輕吹打下來(lái),可以將組織塊重新移入另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)貼塊法培養(yǎng)。用無(wú)血清的培養(yǎng)液將培養(yǎng)瓶底沖洗兩遍,洗掉殘留的血清,然后迅速加入預(yù)熱的胰蛋白酶,放回培養(yǎng)箱,每隔2 min觀察一次,并輕輕拍打培養(yǎng)瓶壁,使細(xì)胞從瓶底脫落下來(lái),待鏡下觀察多數(shù)細(xì)胞收縮變圓后,向培養(yǎng)瓶中加入含血清的培養(yǎng)液,終止胰蛋白酶的作用,再用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶底,使細(xì)胞脫落,然后將培養(yǎng)瓶中的 液體移入離心管, 500 r/min,離心10 min后,棄上

10、清液,然后加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液將沉淀制成均勻的細(xì)胞懸液,按12的比例將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。1. 2. 3 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定:取常規(guī)傳代的細(xì)胞,制成均勻的細(xì)胞懸液后,移入放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁伸展,生長(zhǎng)良好后取出蓋玻片,用PBS沖洗2遍,涼干,放入4%的多聚甲醛中固定, 30% H2O21份+純甲醇50份混合,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,然后熱修復(fù)抗原,再分別滴加5%BSA封閉液、一抗即抗平滑肌-肌動(dòng)蛋白(-actin)的單克隆抗體、生物素化山羊抗小鼠IgG、試劑SABC,最后DAB顯色,蘇木素復(fù)染,酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察。

11、2 結(jié)果2. 1 體外培養(yǎng)的胎兒臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)中觀察到臍動(dòng)脈組織塊貼壁后57d可見(jiàn)有細(xì)胞以垂直方向從組織塊周圍游走出來(lái)(見(jiàn)圖1),但并不是所有的組織塊周圍都有細(xì)胞游出,離組織塊較遠(yuǎn)的區(qū)域也可以看到細(xì)胞,此為平滑肌細(xì)胞的漂移性生長(zhǎng)特性(見(jiàn)圖2),細(xì)胞形態(tài)多樣,大小不一,多為長(zhǎng)梭形、菱形或星形; 911 d細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞生長(zhǎng)加速,部分區(qū)域可見(jiàn)“峰-谷”樣生長(zhǎng)(見(jiàn)圖3);約2周左右細(xì)胞融合成片,甚至相互交叉生長(zhǎng)形成多層可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化后呈圓形,傳代接種于培養(yǎng)瓶4 h就有細(xì)胞貼壁, 24 h后細(xì)胞伸展,細(xì)胞形態(tài)多樣,胞漿豐富,仍然呈“峰-谷”樣生長(zhǎng)特

12、性,細(xì)胞生長(zhǎng)較快, 57 d長(zhǎng)滿瓶底,可以進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)取材于臍動(dòng)脈,采用貼塊法成功培養(yǎng)出平滑肌細(xì)胞。臍動(dòng)脈是中動(dòng)脈,中膜中唯一的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞,內(nèi)膜中唯一細(xì)胞的是內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)中只去除血管外膜,保留中膜和內(nèi)膜,將中膜和內(nèi)膜一起培養(yǎng),摒棄了傳統(tǒng)平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中單純培養(yǎng)動(dòng)脈中膜的模式,將平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng),不但節(jié)約了接種時(shí)間,而且減輕了對(duì)平滑肌細(xì)胞的機(jī)械損傷,更有利于原代細(xì)胞的游出。本實(shí)驗(yàn)將去掉內(nèi)膜的組織塊與未去掉內(nèi)膜的組織塊同時(shí)培養(yǎng),比較發(fā)現(xiàn),未去掉內(nèi)膜的組織塊首先游走出細(xì)胞,而去掉內(nèi)膜的組織塊生長(zhǎng)周期很長(zhǎng),甚至組織塊死亡,沒(méi)有細(xì)胞游出。在原代培養(yǎng)時(shí),可以看到內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊

13、中游走出來(lái),但隨著原代培養(yǎng)的進(jìn)行,內(nèi)皮細(xì)胞不斷的被平滑肌細(xì)胞所覆蓋,又因在傳代過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞處于最底層而不易被消化下來(lái),所以內(nèi)皮細(xì)胞被淘汰,平滑肌細(xì)胞得到純化。另外,臍動(dòng)脈為中動(dòng)脈,內(nèi)膜中的內(nèi)皮是單層扁平上皮,很薄,只由一層內(nèi)皮細(xì)胞組成,而中膜較厚,由1040層環(huán)行排列的平滑肌細(xì)胞組成,顯然,平滑肌細(xì)胞的數(shù)量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì);而且參考相關(guān)資料和文獻(xiàn)6, 7,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)大多數(shù)用酶解法,沒(méi)有用貼法的,因此,不用擔(dān)心此方法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞會(huì)被內(nèi)皮細(xì)胞污染。6鄂征.組織培養(yǎng)M.北京:北京出版社, 2001: 29-30.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),平滑肌細(xì)胞對(duì)溫度要求特別嚴(yán)格,培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度必須為(37±

14、;0. 5),而成纖維細(xì)胞在(35±0. 5)就可以生長(zhǎng)。另外,在原代培養(yǎng)中組織塊的密度要盡量大,因?yàn)榻M織塊之間可以產(chǎn)生微量的相互作用;而且所用的眼科剪必須鋒利,以減少對(duì)組織塊的機(jī)械損傷,還可以保持組織塊周圍的整齊,利于細(xì)胞游走出來(lái)。在原代培養(yǎng)換液時(shí),為避免將組織塊晃動(dòng)下來(lái),可以先將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái),換液完成后再將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)。在傳代時(shí),必須把胰蛋白酶的溫度控制在37,使其活性最大,保證最大程度地把細(xì)胞消化下來(lái)。06江西醫(yī)藥 平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的綜述2.1平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2.2平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性酶消化法培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞,培養(yǎng)1d后,大部分細(xì)胞已貼壁,換液后繼續(xù)培養(yǎng)3d,貼壁細(xì)胞完全伸展

15、,多數(shù)呈長(zhǎng)梭型,細(xì)胞伸出較長(zhǎng)的突起相互接觸,部分區(qū)域可見(jiàn)典型的“峰-谷”結(jié)構(gòu),培養(yǎng)79d細(xì)胞鋪滿瓶底。培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)鋪滿狀態(tài)所需時(shí)間與細(xì)胞活力和細(xì)胞接種密度有關(guān),細(xì)胞活力愈大,接種密度愈大,達(dá)到鋪滿狀態(tài)所需時(shí)間愈短78。02 動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的幾個(gè)問(wèn)題組織塊大小邊緣密度翻面時(shí)間觀察時(shí)間對(duì)原代細(xì)胞萌發(fā)的影響對(duì)于貼塊法的原代培養(yǎng)來(lái)源,由于細(xì)胞并非直接獲得,而是從組織塊邊緣長(zhǎng)出,其中有一“突破過(guò)程”,且細(xì)胞萌發(fā)后尚需一定的細(xì)胞密度才能使其存活、增殖,故組織塊大小、邊緣、密度均影響細(xì)胞萌出與否及細(xì)胞存活、增殖。公認(rèn)的方法是將血管剪成1 mm2大小組織塊13。張映娜等認(rèn)為組織塊0.52 mm2范圍內(nèi),大小

16、影響不大(可調(diào)整翻瓶時(shí)間以保證組織塊貼壁)4。但如組織塊超過(guò)2 mm2將增加細(xì)胞萌出的阻力。而組織塊邊緣整齊、光滑、密度 亦對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起著重要作用。組織塊邊緣過(guò)度受損或毛糙不平及組織塊密度過(guò)稀或重疊將使細(xì)胞很難萌出。作者認(rèn)為剝除內(nèi)膜、外膜時(shí)用力適中,避免機(jī)械拉傷,將鑷子夾過(guò)處切去,剪切時(shí)力求一次剪斷。切組織塊時(shí)不要離開(kāi)培養(yǎng)液操作,保持邊緣濕潤(rùn),組織塊密度以中瓶(100 ml)鋪放取自68只150250 g大鼠胸主動(dòng)脈剪碎組織為宜,而小瓶(70 ml)則以34只為佳,且相同重量的大鼠,以月齡較小者為優(yōu)。翻面時(shí)間一般認(rèn)為36 h,具體時(shí)間應(yīng)根據(jù)上述影響因素摸索而定。一般57 d后觀察可見(jiàn)細(xì)胞從組織

17、塊邊緣呈放射狀長(zhǎng)出,但5 d內(nèi)不宜移動(dòng),以免貼壁的組織塊脫落,脫落的組織塊很難有細(xì)胞的萌出。適宜的消化一般認(rèn)為細(xì)胞傳代消化以細(xì)胞成片收縮,變圓變亮,細(xì)胞間隙增大時(shí)為宜。它主要取決于胰蛋白酶的濃度,pH值、溫度、作用時(shí)間,而各實(shí)驗(yàn)室報(bào)道不一57。過(guò)高濃度的胰蛋白酶達(dá)到適宜標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間短,僅數(shù)十秒,不易控制,易使消化過(guò)度,濃度過(guò)低達(dá)到適宜標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),易嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜,細(xì)胞難以貼壁。通過(guò)實(shí)踐摸索,作者認(rèn)為加入0.05%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液在溫箱內(nèi)孵育23 min即可達(dá)到合適的消化度,0.03%的胰酶和0.02%的EDTA混合液亦可達(dá)到同樣效果,需及時(shí)取出觀察,終止消化。實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)根

18、據(jù)傳代后死細(xì)胞多少而做適當(dāng)調(diào)整。作者通過(guò)對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的長(zhǎng)期摸索與實(shí)踐,優(yōu)化培養(yǎng)方法,使組織貼塊法更經(jīng)濟(jì)實(shí)用,為研究提供大量遺傳性質(zhì)均一、功能狀態(tài)良好的細(xì)胞。第一次傳代時(shí)機(jī)一般的培養(yǎng)方法是選取細(xì)胞達(dá)亞融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代13。但貼塊法原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)往往不均勻,經(jīng)常是一些區(qū)域已長(zhǎng)成致密細(xì)胞層,一些區(qū)域仍未見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng),這種情況下,當(dāng)整瓶細(xì)胞達(dá)亞融合時(shí),致密細(xì)胞層已老化。作者通過(guò)摸索,認(rèn)為當(dāng)原代培養(yǎng)57 d后可移出孵箱觀察,如培養(yǎng)液變黃可部分換藥繼續(xù)培養(yǎng),每隔2 d觀察一次。瓶中若有部分區(qū)域達(dá)到亞融合狀態(tài)即可傳代,或到10 d左右仍未達(dá)到亞融合狀態(tài),但達(dá)到50%左右融合亦可進(jìn)行傳代,為

19、保證傳代細(xì)胞密度可將細(xì)胞傳至小體積培養(yǎng)與封閉培養(yǎng)相結(jié)合。07 中醫(yī)兒科雜志1.2細(xì)胞培養(yǎng)方法Wistar大鼠20只,斷頸處死后,浸泡在75%酒精中5 min,移入超凈工作臺(tái),在無(wú)菌盒蓋上迅速取 出心肺組織與胸主動(dòng)脈,在含青霉素100 U/mL、鏈霉素100g/mL的無(wú)菌PBS液的培養(yǎng)皿中,沖洗2次,迅速分離出主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈,并仔細(xì)剝除纖維層和外膜。更換培養(yǎng)皿,用眼科剪沿縱行剖開(kāi),內(nèi)膜面向上,用眼科彎剪自上而下輕刮23遍,以去除內(nèi)皮細(xì)胞。然后再換培養(yǎng)皿,加1滴DMEM,反復(fù)剪切成1 mm3小塊(剪切10 min左右)。每只大鼠血管組織塊可接種3個(gè)25 mL培養(yǎng)瓶,瓶?jī)?nèi)加入3 mL含20%新生牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100g/mL的DMEM培養(yǎng)液,翻轉(zhuǎn)濕潤(rùn)瓶底,然后瓶底向上,用尖吸管從培養(yǎng)皿粘吸出小組織塊,擺放在培養(yǎng)瓶底,小塊相互間距離以0.5 cm為宜。輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,令瓶底向上,置于37、5%CO2培養(yǎng)箱35 h,使小塊微干涸;然后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,令瓶底向下,讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋于瓶底上的組織小塊,置培養(yǎng)箱中靜置