基于PCR信號放大的微量蛋白檢測技術-鄰位連接延伸分析

1、基于PCR信號放大的微量蛋白檢測技術主要內(nèi)容鄰位連接分析技術（proximity ligation assay）鄰位延伸分析技術（proximity extension assay）CytoploRare 技術一、PLA技術（鄰位連接分析技術）背景：瑞典ULF Landegren 研究小組2002年提出了一種新的蛋白體外分析方法-鄰位連接技術(proximity ligation assay , PLA），通過一對親和探針對目的分子雙識別，繼而產(chǎn)生可擴增的檢測信號，從而將對蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)變成為對DNA 的檢測，實現(xiàn)了微量蛋白的分析。是一種研究蛋白定量、定位、相互作用、修飾以及功能的新蛋白分析技

2、術。PLA反應原理1.當識別同一抗原上的兩個抗體結(jié)合到抗原，則抗體上偶聯(lián)寡核苷酸序列彼此靠近。2.溶液中可以與這兩個探針末端互補的連接片段的作用下，形成有一個斷裂點的dsDNA片段。3.在DNA連接酶的作用下形成完整的dsDNA。4.以連接完整的DNA作為模板，進行定量PCR的檢測；靶抗原的濃度與DNA模板的量成比例，進行蛋白定量轉(zhuǎn)化。PLA基本過程共分為3步：孵育：孵育：樣品與靶特異性抗體的一對鄰位探針共孵育連接：連接：結(jié)合到同一蛋白上的鄰位探針與連接片段雜交并發(fā)生鄰位連接反應，形成一個環(huán)狀的蛋白質(zhì)一蛋白識別分子一單鏈DNA復合物擴增：擴增：qPCR擴增復合物中的單鏈DNA部分PLA類型PL

3、A可分為三種：均相（液相）、固相和原位均相（液相）、固相和原位。 均相（液相）均相（液相），待測樣品、探針、熒光PCR引物以及連接試劑加入同一管中進行熒光定量PCR，適用于微量蛋白質(zhì)的快速檢測。 固相固相，待測蛋白預先固定于微孔板上，洗滌去除未結(jié)合分子，去除游離探針，檢測含量過低的蛋白。原位原位，鄰位探針與待測的2個具有相互作用的蛋白質(zhì)分子分別結(jié)合，反應體系中加入的DNA短序列與探針上的DNA鏈互補，在連接酶的作用下形成環(huán)狀DNA，RCA擴增。蛋白互作、細胞或組織內(nèi)定位的PLA方法。 PLAPLA類型根據(jù)抗體類型：直接直接PLA與間接間接PLAA圖直接PLA，B圖間接PLA，區(qū)別在于間接法用到

4、的探針為二抗連接的親和探針，一抗為捕獲抗體。PLA技術檢測蛋白的核心鄰位探針鄰位探針：不同的DNA單鏈與一對蛋白識別分子相結(jié)合形成，使其通過免疫吸附的方式結(jié)合到待測蛋白上。為什么說PLA的核心是一對鄰位探針？1.DNA與蛋白結(jié)合效率低。2.通過篩選（指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術SELEX）技術，難以得到與蛋白分子高特異性、高親和力的核酸適體。3.核酸適體的種類有限，難以滿足PLA實驗要求。以上三個原因，限制了PLA的發(fā)展應用PLA探針的發(fā)展探針的發(fā)展： 核酸適體：從一個體外合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選出與靶分子特異性結(jié)合的小分子DNA。缺點：盲目、過程繁瑣，核酸適配體種類有限。 化學法：多功能交換

5、試劑SMPB：抗體與巰基修飾的單鏈DNA結(jié)合。 生物法：streptavidin與biotin高親和力。PLA探針已經(jīng)走向商業(yè)化，Solulink公司可定做抗體DNA復合探針，可直接用于PLA反應。PLA國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國外：國外：Olink公司在PLA方面做了較多基礎研究，并對PLA技術申請了專利。相關產(chǎn)品：Dolink（13000RMB）該技術平臺于2015年12月被sigma-Aldrich公司收購，目前該產(chǎn)品正是該公司網(wǎng)站上的主推產(chǎn)品。國內(nèi)：國內(nèi)：目前處于實驗室研究階段，無相關產(chǎn)品從2010年到2014年鄰位連接技術的文獻引用次數(shù)從41次到156次，到2015年關于PLA技術的報道為55

6、篇。Olink公司PLA技術Olink公司PLA技術應用領域蛋白質(zhì)互作及其修飾的檢測細胞蛋白定位分析數(shù)字化定量采用熒光染色，沒有復雜判讀標準，極有可能取代免疫組化Olink公司PLA 檢測原理蛋白In Situ （原位）檢測抗體偶聯(lián)親和探針為正負鏈，再加入與正負鏈兩端同時互補的寡核苷酸序列（a，b），而這兩條鏈在探針鏈上存在一個斷裂點，在連接酶的作用，連接成為一個環(huán)狀DNA。以正鏈探針為引物，以環(huán)狀DNA為模板，進行滾環(huán)擴增(RCA)，得到單鏈的串聯(lián)PCR。定量方法Olink 采用了終點定量的方法，加入熒光雜交探針，在熒光顯微鏡下檢測。PLA的應用舉例1. 檢測穩(wěn)定、瞬時和微弱的蛋白互作（可視

7、化）Fig. 1 培養(yǎng)48 h的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元，原位顯示ER （雌激素受體）與DYX1C1在神經(jīng)突觸中的互作。紅色：ER alpha/DYX1C1復合物；綠色：actin蛋白；藍色：細胞核PLA的應用舉例2.檢測蛋白的翻譯后修飾Fig. 2 EGF（表皮細胞生長因子）刺激前后，用免疫熒光染色和PLA方法檢測U343細胞中EGFR磷酸化水平的變化。PLA方法可以檢測到EGFR的激活，而IF方法則不能。紅色：磷酸化的EGFR蛋白；藍色：細胞核傳統(tǒng)分析方法需要：凝膠電泳、質(zhì)譜、高效液相色譜法和免疫組化結(jié)合。PLA的應用舉例3.高靈敏度的檢測低豐度蛋白的表達Fig. 3 分別用免疫熒光和PLA方法

8、檢測A431細胞中EGFR的表達。與IF方法相比，PLA方法的信噪比高出100倍。紅色：EGFR蛋白；藍色：細胞核如果需要在天然狀態(tài)下對蛋白質(zhì)進行研究，必需對目的蛋白質(zhì)進行過表達、標記或遺傳修飾。PLA的應用舉例4.數(shù)字化定量 在定量過程中，可以對細胞和組織的圖像進行分析。通過細胞核的自動檢測，以及細胞質(zhì)大小的估算，研究者能夠?qū)M織或細胞群中的蛋白質(zhì)表達水平進行單細胞統(tǒng)計學分析。Stadler, Charlotte, et al. (2012) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation fo

9、r protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377二、PEA（鄰位延伸技術） 鄰位延伸分析技術（PEA）， 不需要額外的寡核苷酸將探針拉近連接，其兩條探針末端含有5bp配對堿基，在延伸酶的作用下形成雙鏈模板，利用qPCR進行檢測，有效的避免探針的損失。PEA相關的產(chǎn)品國外：國外：Olink擁有該技術的相關專利，并推出了相關產(chǎn)品 產(chǎn)品品牌：Proseek Multiplex 蛋白高通量檢測國內(nèi)：國內(nèi)：未見相關報道左圖：抗體識別正確且鄰位探針可以形成互補結(jié)構(gòu) 中圖：抗體交叉反應，但鄰位探針無法形成互補結(jié)

10、構(gòu) 右圖：PEA反應過程，采用微流控芯片qPCR系統(tǒng)檢測Olink公司PEA技術特點Olink 公司 PEA 特點：1.qPCR定量采用微流控芯片，實現(xiàn)了蛋白高通量的定量檢測（96樣本x96種抗體探針對）：可以同時檢測96個樣本，和96組引物(探針)；實現(xiàn)了多個指標的高通量檢測。2.樣本加樣可實現(xiàn)自動化3.樣本加樣量少：體積1uL、血清、血漿等4.檢測靈敏度 優(yōu)于ELSA ，檢測濃度可到達fg/mL（10-15），較寬檢測線性范圍（105）反應區(qū)引物（探針）孔引物（探針）孔樣本孔樣本孔PEA技術的應用左圖：PEA 檢測IL-18線性范圍：0.24-31250pg/mL右圖：ELISA 檢測IL

11、-18 線性范圍：78-5000pg/mL細胞因子IL-18的檢測Olink公司基于PLA與PEA的服務Olink 公司提供下面幾個方面的服務： 心血管疾病標志物物的檢測 神經(jīng)疾病方面標志物物的檢測 腫瘤相關標志物（92種腫瘤相關蛋白）的研究服務 主要是用于科研服務，尚未發(fā)現(xiàn)臨床試驗報道三、國內(nèi)基于PCR信號放大技術-CytoploRare CFDA 2016年01月11日批準了國內(nèi)首個通過PCR信號放大檢測肺癌循環(huán)腫瘤細胞試劑盒-CytoploRare （靶向PCR CTC）格諾思博生物科技有限公司（南通）格諾思博生物科技有限公司（南通）用途：定量檢測肺癌血清中葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞，用于

12、肺癌的輔助診斷與療效評估。CytoploRare 技術特點1. 免疫磁珠反向富集循環(huán)細胞2. 循環(huán)細胞與偶聯(lián)寡核苷酸探針的葉酸分子結(jié)合；3.洗滌；4.將與細胞結(jié)合的葉酸-寡核苷酸探針從細胞上解離下來；5.含有寡核苷酸探針的洗脫液加入25uL的PCR mix 溶液中；6. 進行qPCR （Taqman 探針法），計算樣本中寡核苷酸的濃度；并依據(jù)標準曲線轉(zhuǎn)換為CTC units相對單位。免疫磁珠反向富集CTC檢測示意圖CytoploRare 用于臨床上圖：肺癌CTC 檢測在臨床應用方面，靈敏度73.2%、特異性84.1%，優(yōu)于其他常用標志物。不同檢測技術的比較優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點PLA高靈敏度探針存在損失PEA高靈敏度探針不存在損失免疫PCR高靈敏度非特異性吸附、檢測背景信號高ELISA技術平臺成熟樣品量大、手工操作，干擾因素多WB技術平臺成熟操作復雜，難以做成商品化總結(jié)基于PCR信號放大檢測方法，