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文檔簡介
1、基于PCR信號放大的微量蛋白檢測技術主要內(nèi)容鄰位連接分析技術(proximity ligation assay)鄰位延伸分析技術(proximity extension assay)CytoploRare 技術一、PLA技術(鄰位連接分析技術)背景:瑞典ULF Landegren 研究小組2002年提出了一種新的蛋白體外分析方法-鄰位連接技術(proximity ligation assay , PLA),通過一對親和探針對目的分子雙識別,繼而產(chǎn)生可擴增的檢測信號,從而將對蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)變成為對DNA 的檢測,實現(xiàn)了微量蛋白的分析。是一種研究蛋白定量、定位、相互作用、修飾以及功能的新蛋白分析技
2、術。PLA反應原理1.當識別同一抗原上的兩個抗體結(jié)合到抗原,則抗體上偶聯(lián)寡核苷酸序列彼此靠近。2.溶液中可以與這兩個探針末端互補的連接片段的作用下,形成有一個斷裂點的dsDNA片段。3.在DNA連接酶的作用下形成完整的dsDNA。4.以連接完整的DNA作為模板,進行定量PCR的檢測;靶抗原的濃度與DNA模板的量成比例,進行蛋白定量轉(zhuǎn)化。PLA基本過程共分為3步:孵育:孵育:樣品與靶特異性抗體的一對鄰位探針共孵育連接:連接:結(jié)合到同一蛋白上的鄰位探針與連接片段雜交并發(fā)生鄰位連接反應,形成一個環(huán)狀的蛋白質(zhì)一蛋白識別分子一單鏈DNA復合物擴增:擴增:qPCR擴增復合物中的單鏈DNA部分PLA類型PL
3、A可分為三種:均相(液相)、固相和原位均相(液相)、固相和原位。 均相(液相)均相(液相),待測樣品、探針、熒光PCR引物以及連接試劑加入同一管中進行熒光定量PCR,適用于微量蛋白質(zhì)的快速檢測。 固相固相,待測蛋白預先固定于微孔板上,洗滌去除未結(jié)合分子,去除游離探針,檢測含量過低的蛋白。原位原位,鄰位探針與待測的2個具有相互作用的蛋白質(zhì)分子分別結(jié)合,反應體系中加入的DNA短序列與探針上的DNA鏈互補,在連接酶的作用下形成環(huán)狀DNA,RCA擴增。蛋白互作、細胞或組織內(nèi)定位的PLA方法。 PLAPLA類型根據(jù)抗體類型:直接直接PLA與間接間接PLAA圖直接PLA,B圖間接PLA,區(qū)別在于間接法用到
4、的探針為二抗連接的親和探針,一抗為捕獲抗體。PLA技術檢測蛋白的核心鄰位探針鄰位探針:不同的DNA單鏈與一對蛋白識別分子相結(jié)合形成,使其通過免疫吸附的方式結(jié)合到待測蛋白上。為什么說PLA的核心是一對鄰位探針?1.DNA與蛋白結(jié)合效率低。2.通過篩選(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術SELEX)技術,難以得到與蛋白分子高特異性、高親和力的核酸適體。3.核酸適體的種類有限,難以滿足PLA實驗要求。以上三個原因,限制了PLA的發(fā)展應用PLA探針的發(fā)展探針的發(fā)展: 核酸適體:從一個體外合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選出與靶分子特異性結(jié)合的小分子DNA。缺點:盲目、過程繁瑣,核酸適配體種類有限。 化學法:多功能交換
5、試劑SMPB:抗體與巰基修飾的單鏈DNA結(jié)合。 生物法:streptavidin與biotin高親和力。PLA探針已經(jīng)走向商業(yè)化,Solulink公司可定做抗體DNA復合探針,可直接用于PLA反應。PLA國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國外:國外:Olink公司在PLA方面做了較多基礎研究,并對PLA技術申請了專利。相關產(chǎn)品:Dolink(13000RMB)該技術平臺于2015年12月被sigma-Aldrich公司收購,目前該產(chǎn)品正是該公司網(wǎng)站上的主推產(chǎn)品。國內(nèi):國內(nèi):目前處于實驗室研究階段,無相關產(chǎn)品從2010年到2014年鄰位連接技術的文獻引用次數(shù)從41次到156次,到2015年關于PLA技術的報道為55
6、篇。Olink公司PLA技術Olink公司PLA技術應用領域蛋白質(zhì)互作及其修飾的檢測細胞蛋白定位分析數(shù)字化定量采用熒光染色,沒有復雜判讀標準,極有可能取代免疫組化Olink公司PLA 檢測原理蛋白In Situ (原位)檢測抗體偶聯(lián)親和探針為正負鏈,再加入與正負鏈兩端同時互補的寡核苷酸序列(a,b),而這兩條鏈在探針鏈上存在一個斷裂點,在連接酶的作用,連接成為一個環(huán)狀DNA。以正鏈探針為引物,以環(huán)狀DNA為模板,進行滾環(huán)擴增(RCA),得到單鏈的串聯(lián)PCR。定量方法Olink 采用了終點定量的方法,加入熒光雜交探針,在熒光顯微鏡下檢測。PLA的應用舉例1. 檢測穩(wěn)定、瞬時和微弱的蛋白互作(可視
7、化)Fig. 1 培養(yǎng)48 h的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元,原位顯示ER (雌激素受體)與DYX1C1在神經(jīng)突觸中的互作。紅色:ER alpha/DYX1C1復合物;綠色:actin蛋白;藍色:細胞核PLA的應用舉例2.檢測蛋白的翻譯后修飾Fig. 2 EGF(表皮細胞生長因子)刺激前后,用免疫熒光染色和PLA方法檢測U343細胞中EGFR磷酸化水平的變化。PLA方法可以檢測到EGFR的激活,而IF方法則不能。紅色:磷酸化的EGFR蛋白;藍色:細胞核傳統(tǒng)分析方法需要:凝膠電泳、質(zhì)譜、高效液相色譜法和免疫組化結(jié)合。PLA的應用舉例3.高靈敏度的檢測低豐度蛋白的表達Fig. 3 分別用免疫熒光和PLA方法
8、檢測A431細胞中EGFR的表達。與IF方法相比,PLA方法的信噪比高出100倍。紅色:EGFR蛋白;藍色:細胞核如果需要在天然狀態(tài)下對蛋白質(zhì)進行研究,必需對目的蛋白質(zhì)進行過表達、標記或遺傳修飾。PLA的應用舉例4.數(shù)字化定量 在定量過程中,可以對細胞和組織的圖像進行分析。通過細胞核的自動檢測,以及細胞質(zhì)大小的估算,研究者能夠?qū)M織或細胞群中的蛋白質(zhì)表達水平進行單細胞統(tǒng)計學分析。Stadler, Charlotte, et al. (2012) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation fo
9、r protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377二、PEA(鄰位延伸技術) 鄰位延伸分析技術(PEA), 不需要額外的寡核苷酸將探針拉近連接,其兩條探針末端含有5bp配對堿基,在延伸酶的作用下形成雙鏈模板,利用qPCR進行檢測,有效的避免探針的損失。PEA相關的產(chǎn)品國外:國外:Olink擁有該技術的相關專利,并推出了相關產(chǎn)品 產(chǎn)品品牌:Proseek Multiplex 蛋白高通量檢測國內(nèi):國內(nèi):未見相關報道左圖:抗體識別正確且鄰位探針可以形成互補結(jié)構(gòu) 中圖:抗體交叉反應,但鄰位探針無法形成互補結(jié)
10、構(gòu) 右圖:PEA反應過程,采用微流控芯片qPCR系統(tǒng)檢測Olink公司PEA技術特點Olink 公司 PEA 特點:1.qPCR定量采用微流控芯片,實現(xiàn)了蛋白高通量的定量檢測(96樣本x96種抗體探針對):可以同時檢測96個樣本,和96組引物(探針);實現(xiàn)了多個指標的高通量檢測。2.樣本加樣可實現(xiàn)自動化3.樣本加樣量少:體積1uL、血清、血漿等4.檢測靈敏度 優(yōu)于ELSA ,檢測濃度可到達fg/mL(10-15),較寬檢測線性范圍(105)反應區(qū)引物(探針)孔引物(探針)孔樣本孔樣本孔PEA技術的應用左圖:PEA 檢測IL-18線性范圍:0.24-31250pg/mL右圖:ELISA 檢測IL
11、-18 線性范圍:78-5000pg/mL細胞因子IL-18的檢測Olink公司基于PLA與PEA的服務Olink 公司提供下面幾個方面的服務: 心血管疾病標志物物的檢測 神經(jīng)疾病方面標志物物的檢測 腫瘤相關標志物(92種腫瘤相關蛋白)的研究服務 主要是用于科研服務,尚未發(fā)現(xiàn)臨床試驗報道三、國內(nèi)基于PCR信號放大技術-CytoploRare CFDA 2016年01月11日批準了國內(nèi)首個通過PCR信號放大檢測肺癌循環(huán)腫瘤細胞試劑盒-CytoploRare (靶向PCR CTC)格諾思博生物科技有限公司(南通)格諾思博生物科技有限公司(南通)用途:定量檢測肺癌血清中葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細胞,用于
12、肺癌的輔助診斷與療效評估。CytoploRare 技術特點1. 免疫磁珠反向富集循環(huán)細胞2. 循環(huán)細胞與偶聯(lián)寡核苷酸探針的葉酸分子結(jié)合;3.洗滌;4.將與細胞結(jié)合的葉酸-寡核苷酸探針從細胞上解離下來;5.含有寡核苷酸探針的洗脫液加入25uL的PCR mix 溶液中;6. 進行qPCR (Taqman 探針法),計算樣本中寡核苷酸的濃度;并依據(jù)標準曲線轉(zhuǎn)換為CTC units相對單位。免疫磁珠反向富集CTC檢測示意圖CytoploRare 用于臨床上圖:肺癌CTC 檢測在臨床應用方面,靈敏度73.2%、特異性84.1%,優(yōu)于其他常用標志物。不同檢測技術的比較優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點PLA高靈敏度探針存在損失PEA高靈敏度探針不存在損失免疫PCR高靈敏度非特異性吸附、檢測背景信號高ELISA技術平臺成熟樣品量大、手工操作,干擾因素多WB技術平臺成熟操作復雜,難以做成商品化總結(jié)基于PCR信號放大檢測方法,
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