流式細(xì)胞儀操作規(guī)程-SOP

1、流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄1:淋巴細(xì)胞亞群測定及絕對計數(shù)2：活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的檢測3： HLA-B27 測定4： CD55/CD59 測定5：干細(xì)胞檢測和絕對計數(shù)6：白血病免疫分型測定7：淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-y/IL-4測定38：細(xì)胞周期分析9：活化血小板檢測 10：血小板抗體測定11：紅細(xì)胞抗體測定12：粒細(xì)胞抗體測定淋巴細(xì)胞亞群測定（流式細(xì)胞儀）醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號：20。_年月一日起實(shí)施第1版（共3頁）本規(guī)程每2年復(fù)審一次復(fù)審日期：年月日復(fù)審人：規(guī)程編寫者：審批者：批準(zhǔn)日期：年月日文件分發(fā)部門和/或個人院檔案室保管者：檢驗(yàn)科主任：檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室：淋巴細(xì)胞亞群

2、測定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter, 貝克曼庫爾特）原理：雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中， 與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式 細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可 得出絕對計數(shù)。淋巴細(xì)胞表面抗原分布如下：T淋巴細(xì)胞：CD3+； B淋巴細(xì)胞: CD3-, CD19+；輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+； NK細(xì)胞：CD3-CD16+56+等。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上CD分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞 僅可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群，利用計算

3、機(jī)軟件計算出淋巴細(xì)胞 亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count組會自動得出絕對計數(shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量1mL2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。若X107L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若XIO'/L,應(yīng)分離單個核細(xì)胞。試劑品牌劑型 規(guī)格貝克曼庫爾特成分1:單克隆抗體液體（CD45/4/8/3CD45/56/19/3CD4/8/3 同型對照 IgGl/IgGl/IgGlCD3/19 CD3/16+56 CD19-PC5Flow-Count熒光

4、微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體貯存28A：甲酸液體70MLB：碳酸鈉等液體32MLC：多聚甲醛液體14ML（Optilyse C 液體室溫3:鞘液液體 20L室溫室溫 室溫 室溫4：清洗液液體5L室溫5：熒光微球 液體10ML2-8GC （Flow-Check）儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對照 2）分別向試管中加入混勻的lOOul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QP

5、REP制備系統(tǒng)開機(jī)-一顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-一取出試管 -一再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）上機(jī)測樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）6）需要做絕對計數(shù)的指標(biāo)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count （務(wù)必做 到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count, 而且加完即上機(jī)）報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)（和絕對值）操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CVK2%參考值（百分?jǐn)?shù)（絕對值）CD3+ CD4+Th/TsCD8+NK(175-567)臨床意義、B淋巴細(xì)胞亞群是重要的免疫狀態(tài)檢

6、測指標(biāo)，在腫瘤、免疫缺陷、病毒感染, 自身免疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具有臨床 診斷、病情判斷、治療等價值。臨床常用Th/Ts比值來判斷病人的免疫狀況。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢進(jìn)：見于自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力以及HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值減低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、腫瘤病人、慢活肝 和活動性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細(xì)胞減少患者。*2： NK細(xì)胞主要破壞各種腫瘤細(xì)胞和感染某些病毒、細(xì)菌的細(xì)胞，所以在抗腫瘤和 防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見于各種惡性腫瘤、自身免疫性疾病、 病毒

7、感染、應(yīng)用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人等，NK活性隨年齡增長而減退。NK細(xì)胞也參與第二型超敏反應(yīng)和移植物抗宿反應(yīng)，白介素-2治療后；外周血NK 細(xì)胞增加。方案(Protocol)1.選參數(shù)n ：(nxi2Aoc曲因Ae Gil 'i 勤外t * 心Rd后文C依Wng Mo以。 m | xj 二 ，匕.rn inu ' O J< 2TRe.uaw»c» tox rao 2«4xFS3，XP ZcrtrPW 朽”由rRRKP-J 4 cdcr F£$.>14J 4c而 SS.MF 皿 fkCstEd WF2CRJIFJK 皿 rkr

8、vzgj, 必如必然， 際 rhXyE AWF Wltn JUXirynniCI AIKF"JR?也 布對臣二ri TtwZADCM力u AX'皿 cws UlInctM*J兇 aT如9ia |點(diǎn)擊 _j 6 rt|£><ome<u, £32lOwSwcdM 外 119172P ScgHM r jjgcr”I的加eQtxdShkjiIL 士二 IiK *4| | Deiscwry ； C<xip-” Nq 第，s InhA£QJS I心 JGw.二坦倒123BQ icaw.0 2。而咨6少，心 2ccto?M 3cc*xF

9、5S-.HP Jw*r力曲HA 4a*»F£-S£->14f icc*ir SS-15-jHP 皿田5和壯 wr：tn.iiriK A£<F&RJ(Pe). 物F比供"為.皿 F 2rMvoriA£<F3xBHll口對83 W GMLM>dC>U«Mtsr "gNofc «iy«vi9 OJ3a 103 9frt»IT司X 、ZWE §wd 81 3d § uteu.E$ 5SU.rnn iiLLrn-H9MFla JI L d

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14、MU«PJUl，gfUl8X，結(jié)果Odor C03 CM.lMO|F1£A)2 Cdc< CO3 CW LMD FL< LOO產(chǎn)”出2 8"3 GC4 IMO HI LOGfflZlOG(F1：(AJ 2 Cd" CCX3 COT.IMO ： FH L0G?H2 LOG|F "N 2 Color CD3 COl91.r4D FL< LOG>Fl2 100CD3 rirc此圖為CD45圈門如果做絕對計數(shù)，則PRDTOCOL1PRDQ0« ICO*Min二o三J囪回到12幺的。 l'：Ol WO=3&quo

15、t;*1 Tro32 AoeFia Cdl >Mtt T<xl> Mota |KoM>AQSMrakw *CytcceJ tlWuiflcmGaiLMDFiZEjtFRO 3ct*xP5S5-4hP 3ctlxSS45.<MP-J 4CC*»FS-SS14J a”S5T5川 P 可工廣2tlMc吐 必 F2CFII 舊” Accrztrizatr ArcrztrbM-5*.MJ<F2tV.r-4r. AMF3t£3SettT.MF 次E3FU年i AKU>£3R2N.|I '(mx>32 ADC活化淋巴細(xì)胞亞

16、群、記憶T及純真T的測定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter, 貝克曼庫爾特）原理：雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白 細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞 儀上進(jìn)行分析，從而得到相應(yīng)各亞群的百分?jǐn)?shù)。活化淋巴細(xì)胞表面抗原為 CD3+/CD25+和 CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+是記憶型 T 細(xì)胞。CD3+/CD45RA+ 是純真型T細(xì)胞。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量Imlo2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血

17、的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若XIO'/L,應(yīng)分離單個核細(xì)胞。試劑品牌貝克曼庫爾特 成分1:單克隆抗體劑型 規(guī)格 貯存液體28（CD3/HLA-DR CD25-PC5 CD3-FITCCD45RA-PECD45R0-PE CD4-PC5 ）2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體A：甲酸B：碳酸鈉等 C：多聚甲醛 （Optilyse C 液體 3:鞘液液體20L4:清洗液液體5L5:熒光微球液體 1OML體體體液液液L L L M M M0 2 47 3 1室溫室溫室溫2-8(Flow-Check)儀器BeckmanCoulter

18、 EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對照 2）分別向試管中加入混勻的lOOul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-一顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-一取出試管 -一再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）上機(jī)測樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CVK

19、2%參考值（百分?jǐn)?shù)）CD3+/HLA-DR+ ±%CD3+/CD25+ ±%CD3+/CD45R0+ ±%CD3+/CD45RA+/CD4+ ±%臨床意義、CD25、CD69是T細(xì)胞活化各個時期表達(dá)的標(biāo)志性抗原，對其進(jìn)行檢測可以判斷出疾病 的進(jìn)程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預(yù)后和治療。如活化狀態(tài)的監(jiān)測是對機(jī)體移植 免疫狀況判斷的最主要依據(jù)，有助于臨床選擇治療方案，CD25+/CD3+ >5-10*提示排斥、 持續(xù)增加提示應(yīng)作病理活檢；CD3+/HLA-DR+增加570%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常機(jī)體內(nèi)各種T細(xì)胞之間以及與其他免疫細(xì)胞

20、之間在數(shù)量上保持一定比例，如果它 們之間比例失調(diào)就會引起免疫功能紊亂，將導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降和感染性疾病、自身 免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生，檢測淋巴細(xì)胞各種亞群有助于疾病的診斷、預(yù)后和治療。 CD45RA. CD45R0均為T細(xì)胞的輔助分子，CD45RA+純真型T細(xì)胞當(dāng)免疫力下降時減少; CD45R0+記憶型T細(xì)胞對第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢 性感染疾病中減少。方案(Protocol)同淋巴細(xì)胞亞群檢測 結(jié)果(Result)HLA-B27 測定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCou 1 ter,貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/ HLA-

21、B7-PE單克隆抗體加入到全血中, 與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式 細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測定HLA-B7陰性而HLA-B27陽性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和 所占的百分比。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量Imlo2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。若Xl（r/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X107L,應(yīng)分離單個核 細(xì) 胞。4 .溶血樣本不能用。試劑品牌劑型 規(guī)格 貯存貝克曼庫爾特成分1：單克隆抗體液體 1ML28（HLA-B27/HLA

22、-B7 同型對照 IgGl / IgG2a ）2：全血溶血試劑日皿日皿日皿日皿日皿室室室室室L L L Lal 11A IA 1A Lo 2 4 o L o7 3 1 2 5 1A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛3:鞘液4：清洗液5：熒光微球質(zhì)控品BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8匕保存，可在有效期內(nèi)保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情 況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對照 （IgG2a-FITC/ IgGl-PE

23、）2）分別向試管中加入混勻的100ul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-一顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-一自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-一取出試管 -一再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）洗、離心、上機(jī)測樣（備注：測B27一定要至少洗一遍方可上機(jī)檢測）報告結(jié)果報告陰陽性操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)3K2%參考值陽性：HLA-B27陽性而HLA-B7陰性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度在以上，陽性 率90%。HLA復(fù)合體

24、位于第6號染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長度約3000-4000KB, 占人體整個基因的1/3000, HLA-B27是HLAT類基因中B位點(diǎn)上的一個等位基 因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎。HLA-B27基因?qū)儆贗型 MHC基因，所有有核細(xì)胞上均有表達(dá)，尤其是淋巴細(xì)胞表面含量豐富，人們發(fā) 現(xiàn)HLA-B27抗原表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎有高度的相關(guān)性，超過90%的強(qiáng)直性脊柱 炎患者HLA-B27抗原表達(dá)陽性，而正常人群中僅5-10%的認(rèn)為陽性。由于強(qiáng)直 性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測在疾病 的診斷中具有重要意義，HLA-B27的檢測是該疾病診斷和鑒別診

25、斷中的一個重 要指標(biāo)。方案(Protocol)L選參數(shù):ri tuzAcc(t»g AA4,y HW>A2 :M3百 Q I y 二 / Ia . ：i ji- i_i r a 3 2r，“ I3 a阮Q £" I Dc*sc*x; C8pd»!AxgJs Irtj fSgnh) 35-P(o5) CKwcdNBl 115724"，s rM1”j3r 5dM1H 必 r accw rb加eQ%4SUhi12aBQ IGXFR.0 2cmr朽雙MP iCCtaPM3«*x陟59XQ J心力將小2 ，ctr FSS J 婕” icc

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29、。血細(xì)胞 （紅細(xì)胞和白細(xì)胞）通過膜上的抗原分子與熒光素標(biāo)記的CD55或CD59的多克隆 抗體結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測CD55或CD59表達(dá)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量Imlo2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。3 .溶血樣本不能用。試劑品牌貝克曼庫爾特劑型 規(guī)格 貯存成分1：單克隆抗體 液體 1ML(CD59-FITC CD55-PE2：全血溶血試劑A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛3:鞘液4：清洗液5：熒光微球281L M O 7L L Lal 1 4A IA L2 4 o L

30、 O3 12 5 1質(zhì)控品BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-81保存，可在有效期內(nèi)保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情 況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：（一）白細(xì)胞CD55 / CD59檢測1 .準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記。分別向二管中加入樣品lOOul。2 .溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-一顯示READY燈亮一-選擇35SEC燈亮-一開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試

31、管 -一再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）3 .離心后分別加入CD55/CD59 10ul和相應(yīng)的同型對照10ulo避光20-30分鐘。4 .洗滌離心5 .上機(jī)測樣（二）紅細(xì)胞CD55 / CD59檢測1 .準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記2 .分別加入CD55/CD59 10ul和相應(yīng)的同型對照10ul。3 .向二管中加入1: 200稀釋的樣品100。（可根據(jù)紅細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整），避 光20-30分鐘。4 .洗滌離心。5 .混勻、上機(jī)測樣。報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值CD55>97%CD59>97%PNH 的

32、臨界值：RBC CD59>95%WBC CD59>90%PNH的診斷值：RBC CD59>91%大部分>80%中性粒細(xì)胞CD5984%臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時CD55和CD59明顯減低和缺如。方案(Protocol)(同 HLA-B27)N FL1 L835UnCO5$FITCW F12 L09A FL4 logJFLZ LugCDWFITCcws-pe結(jié)果：normal1|E| RP&xdSS汩 LM。PMT2 La9RP8c55».LKD . PVT1 Uri'FS Un1023$S lln(F1|E| RFBcd

33、55.LMD PMT2 LajyPMT310,1usQ7.映CDMabnormalWPWT3：U：7PE LogW莒。IN PI.1T3 LcqPMX2 logCDSS.干細(xì)胞檢測和絕對計數(shù)方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與干細(xì)胞 膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌（和固定）等步喋后，在流式細(xì)胞儀上 進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血a 抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量Imlo2 .樣本

34、應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。若X107L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若Xl（r/L,應(yīng)分離單個核細(xì)胞。試劑品牌貝克曼庫爾特成分1:單克隆抗體（CD34 No. IM1871劑型 規(guī)格 貯存液體 CD45-PC528IM2652液體70ML室溫液體32ML室溫液體14ML室溫室溫室溫室溫2-8GC (Flow-Check)液洗光鞘清熒3 4 5體體體液液液Flow-Count熒光微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛 （Optilyse C 液體儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/A

35、ltra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10 U1單克隆抗體和同型對照2）分別向試管中加入混勻的lOOul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-一顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管 關(guān)門-自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-一取出試管 -一再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5）需要做絕對計數(shù)時，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count （務(wù)必做到三 同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count,而且加

36、完即上機(jī)）6）上機(jī)測樣報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)（和絕對值）操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CVK2%參考值（百分?jǐn)?shù)（絕對值）CD34+/CD45+ ±%臨床意義目前把CD34作為造血干細(xì)胞的主要標(biāo)志，CD34陽性細(xì)胞計數(shù)作為造血干 細(xì)胞水平定量的檢測方法。方案(Protocol)同淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果(Result)PMT1 LirUFS LmSSLin102?CD34白血病免疫分型測定方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter, 貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與細(xì)胞膜 上或膜內(nèi)相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞 儀

37、上進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位骨髓采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝要求 1.樣本量lmlo2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。若X1（）9/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X1（）9/L,應(yīng)分離單個核細(xì)胞。試劑品牌貝克曼庫爾特劑型 規(guī)格 貯存成分1:單克隆抗體液體(CD34 No. IM1871CD45-PC528IM2652Flow-Count熒光微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛（Optilyse C 液體3：鞘液液體20L4:清洗液液體5L5：

38、熒光微球液體 1OML體體體體液液液液室溫室溫 室溫2-8 (Flow-Check)儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作-樣本制備：細(xì)胞膜表面抗原1 .首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體。2 .首先每管中加入5ul CD45-PC5抗體。3 .然后，按管上的標(biāo)記，加入相應(yīng)抗體各10ul（注意：必須是FITC和PE標(biāo) 記的抗體搭配）4 .各管中加入標(biāo)本（骨籟或外周血）30lOOul（根據(jù)細(xì)胞的多少決定），振蕩混 勻，室溫避光2030分鐘。5 .溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-一

39、顯示READY燈亮一-選擇35SEC燈亮一一開門-一放入試管 關(guān)門-一自動進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮一一開門-一取出試管 -一再進(jìn)行下一個樣品測定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）細(xì)胞漿和核抗原1 .準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。2 .首先每管中加入標(biāo)本（骨髓或外周血）100ul （根據(jù)細(xì)胞的多少決定）， 5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3 .每管中加入固定液lOOul,劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4 .各管中加入PBS4ml。5 . 300g離心5分鐘后,棄去上清液,振蕩混勻。（1500r/min*5min）6 .各管中加入透

40、膜劑lOOul,輕輕混勻，室溫避光5分鐘。7 .加抗體，陰性對照管中加入10ul,其余各管加入相應(yīng)抗體各10ul,室溫避 光15分鐘。8 .各管中加入4mlPBS,振蕩混勻。9 . 300g離心5分鐘后，棄去上清液。10 .各管中加入PBS500ul,振蕩混勻。11 .上機(jī)測樣報告結(jié)果（報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%參考值CD34+<5%MP0+<5%粒系<20%淋系<30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案(Protocol)T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN- Y /IL-4檢測方法）流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：

41、直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在PMA, lonomycin和Monensin存在下短期 培養(yǎng)（輔助性T細(xì)胞通過細(xì)胞因子IFN-y、IL-4的產(chǎn)生分為Thl、Th2兩個亞 群。淋巴細(xì)胞活化以后才分洪細(xì)胞因子，且迅速分泌到細(xì)胞外。因此，利用刺 激劑PMA+lonomycin體外激活淋巴細(xì)胞，然后用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Monensin阻 止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)滯留到一定的量），然后進(jìn)行 細(xì)胞膜表面抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，使用流式細(xì)胞儀對CD4+細(xì)胞內(nèi)的 IFN-Y和IL-4進(jìn)行測定。標(biāo)本采集與處理受檢者的準(zhǔn)備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑肝素抗凝血要求 1.樣

42、本量至少link2 .樣本應(yīng)在采集后6小時內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。3 .樣本白細(xì)胞計數(shù)應(yīng)在之間。若X107L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若XIO'/L,應(yīng)分離單個核 細(xì) 胞。4 .溶血樣本不能用。試劑淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系（自配）成分：剌激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。選白美國SIGMA公司。單克隆抗體（BeckmanCoulter公司）CD4-PC5, IL-4-PE. IFN-y-FITCo質(zhì)控品BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-保存，可在有效期內(nèi)保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8C可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情 況隨時進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器Beckm

43、anCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：細(xì)胞培養(yǎng)與染色取200ul抗凝血加入10ul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMI1640 洗滌一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中，5 % CO, 371孵育18小時，取出后以PBS 洗一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分成兩管，其一 為測定管加入10ul抗人IL-4-PE和IFN-Y-FITC,另一管加入同型對照，室溫 避光20分鐘，PBS洗滌一次，待測。流式細(xì)胞儀測定打開流式細(xì)胞儀及氫激光光源（488nm）預(yù)熱20min,同時儀器自動初始化； 用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測標(biāo)本，每份標(biāo)本檢

44、測50000以 上細(xì)胞，在前向散射光（FS）和測向散射光（SSC）散點(diǎn)圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然 后分析CD4陽性細(xì)胞中IL-4-PE和IFN-Y-FITC的表達(dá)。淋巴細(xì)胞在FS/SSC散點(diǎn)圖中位置，即A門內(nèi)細(xì)胞；A門內(nèi)CD4陽性細(xì)胞，即B門內(nèi)細(xì)胞； B門內(nèi)TH細(xì)胞亞群分布：1區(qū)數(shù)值-Th 1細(xì)胞（酚4區(qū)數(shù)值-Th 2細(xì)胞（%）2區(qū)數(shù)值-ThO細(xì)胞（盼報告結(jié)果報告百分?jǐn)?shù)操作性能精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2%正常參考值Thl(IFN-Y)： ±%Th2(IL-4)： ±%ThO : ±%臨床意義淋巴細(xì)胞均分雙'多種細(xì)胞因子:Thl細(xì)胞主要分泌IL-2,IL

45、-12,IFN-Y和TNF-b /a等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4. IL-5. IL-6, IFN-y為Thl最特異分泌的細(xì) 胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來 區(qū)分Thl與Th2。Thl為IFN-y+, Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)(人的正常生理狀 態(tài)、即未受到任何刺激下ThO分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅 含有極少量的Thl和Th2細(xì)胞，這時我們所能檢測的胞內(nèi)的IFN-y和IL-4 也微乎其微。當(dāng)Th細(xì)胞受到外界因素，如剌激素、病原體等剌激，其中ThO 即會向Thl或Th2大量分化，此時我們檢測到的IFN-Y和IL-4也較多。本實(shí) 驗(yàn)

46、的檢測實(shí)際上是檢測Th細(xì)胞對刺激素刺激的反應(yīng)能力。方案(Protocol)鄉(xiāng)鄉(xiāng) Un回Fia logS$ unCg心(AftNDEjFL?LaFL1 Log細(xì)胞周期分析方法流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：利用特殊的熒光染料（PI、EB、AO等）與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染 色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀 通過測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量標(biāo)本采集與處理檢測對象實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細(xì)胞要求 1.實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液和培養(yǎng)細(xì)胞如果不能立即做應(yīng)用 冷乙醇固定，一20（可保存2 3個月，一70

47、C可保存半年以 上。2.樣本計數(shù)應(yīng)在XlO'/mi試劑品牌劑型 規(guī)格 貯存貝克曼庫爾特成分1： DNA-Prep試劑系統(tǒng) 液體28七（） （包括 DNA-Prep LPR 和 DNA-Prep 染料）2：鞘液液體20L室溫3：清洗液液體5L室溫4：熒光微球液體1OML2-8(Flow-Check)儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：灌洗液或培養(yǎng)細(xì)胞1 . PBS洗，稀釋為XlO/ml,取lOOul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep染料1ml,室溫避光15分鐘。2 .過300目濾網(wǎng)，上機(jī)檢測。實(shí)體（腫瘤）組織1

48、.單細(xì)胞懸液制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平 皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑲子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽 水沖洗，直至將組織搓完為止。（如果是淋巴瘤只需用生理鹽水沖即可）。 將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，以500 800轉(zhuǎn)離心沉淀2分鐘。2 .染色：同上3.,4上機(jī)檢測石蠟塊1 .脫蠟水化：石蠟塊切成50um厚，35片，放入二甲苯中室溫放置24小時, 更換二甲苯室溫再置24小時。取出加無水乙醇10分鐘，依次加95%乙醇、 70%乙醇、50%乙醇及雙蒸水各10分鐘。2 .單細(xì)胞懸液制備及染色：同上3 .上機(jī)檢測報告結(jié)果報告各期的百分?jǐn)?shù)

49、操作性能精密度批內(nèi)五次重復(fù)CVK2%參考值臨床意義DNA倍體分析用于腫瘤早期診斷、良惡性腫瘤判斷、腫瘤預(yù)后、治療方案的選擇，正常組 織和良性腫痛DNA均為二倍體，惡性腫瘤時則出現(xiàn)異倍體。方案(Protocol)1.選參數(shù)選擇Cytometer Control點(diǎn)擊Parameters后M T"O32AWud£J*jfip QQ a *，.-« lA I - - I jl| r U « -T 'rj J . II rI陶 A、”川i；II 1% IImilllilgl幅df雹Ixl可加融9| ConwNin |Urai«l二r $4*wp&

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