豬CAST基因多態(tài)性與肌纖維組織學(xué)特性及屠宰性狀的相關(guān)性分析

1、HEREDITAS (Beijing)2007年1月, 29(1): 6569ISSN 0253-9772 研究報(bào)告 DOI: 10.1360/yc-007-0065豬CAST基因多態(tài)性與肌纖維組織學(xué)特性及屠宰性狀的相關(guān)性分析武艷群, 吳舊生, 趙曉楓, 郭曉令, 徐寧迎浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 杭州 310029摘要: 采用3種限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)45頭金皮(金華皮特蘭)F2代豬鈣蛋白酶抑制蛋白基因(CAST)的第6外顯子和第7外顯子之間的片段進(jìn)行了PCR-RFLP分析, 結(jié)果顯示在第6內(nèi)含子內(nèi)均檢測(cè)到Msp、Hinf和Rsa酶切多態(tài)性。根據(jù)酶切結(jié)果將CAST基因分為3種基因型(AACCEE、B

2、BDDFF、ABCDEF), 其基因型頻率分別為0.1778, 0.2222, 0.6000。對(duì)背最長(zhǎng)肌做連續(xù)性石蠟切片, 分別采用蘇木精-伊紅和肌球蛋白重鏈免疫組織化學(xué)方法染色并拍照, ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)肌纖維橫截面積、密度、直徑及MHC型肌纖維的比例。采用SPSS程序分析了CAST不同基因型對(duì)金皮F2代豬肌纖維組織學(xué)特性和屠宰性狀的影響。結(jié)果表明: BBDDFF基因型個(gè)體的肌纖維橫截面積和眼肌面積顯著地高于ABCDEF基因型個(gè)體的肌纖維橫截面積和眼肌面積(P 0.05)。關(guān)鍵詞: 金皮F2代豬; CAST基因; 肌纖維; 免疫組織化學(xué)Correlation between porcine

3、 CAST gene polymorphism with muscle fiber histological traits and carcass characteristicsWU Yan-Qun, WU Jiu-Sheng, ZHAO Xiao-Feng, GUO Xiao-Ling, XU Ning-YingCollege of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, ChinaAbstract: Three polymorphisms were identified in the sixth intron of the

4、 CAST gene by PCR-RFLP using enzymes Msp, Hinf and Rsa in 45 Jinpi F2 pigs. However, only three genotypes AACCEE, BBDDFF, and ABCDEF were detected in those pigs and the genotype frequencies were 0.1778, 0.2222 and 0.6000, respectively. Longissimus dorsi muscles were moved for paraffin serial section

5、s and stained with hematoxylin-eosin or myosin heavy chain (MHC) by immunohisto-chemistry respectively. Fiber cross-sectional area , fiber density, fiber diameter, the rate of MHC typefiber and the carcass characteristics were recorded. Correlation analysis showed that the skeletal muscle fiber area

6、 and the eye muscle area of the BBDDFF individual were significantly higher than those of the ABCDEF individual (P0.05).Keywords: Jinpi F2 pig; Calpastatin gene; muscle fiber; immunohistochemistry鈣蛋白酶(calpain-calpastatin)系統(tǒng)由幾種同型異構(gòu)的蛋白水解酶組成, 在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在, 該系統(tǒng)在肌原纖維蛋白的代謝更新及宰后肌肉嫩化過(guò)程中起著非常重要的作用。鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)是

7、鈣蛋白酶系統(tǒng)的主要成員之一, 是一種內(nèi)源性專一抑制鈣蛋白酶(calpain)活性的蛋白。它可以識(shí)別鈣蛋白酶與鈣離子結(jié)合而引起的構(gòu)象變化, 并與之特異性結(jié)合, 從而調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)蛋白的水解速率及種收稿日期: 2006-04-17; 修回日期: 2006-08-10基金項(xiàng)目: 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào): 2004AA213110)資助Supported by The National High Technology Research and DevelopmentProgram of China (No. 2004AA213110)作者簡(jiǎn)介: 武艷群(1982), 女, 碩士研究生, 專業(yè)方向

8、: 動(dòng)物遺傳育種, E-mail: wuyanqun19820117通訊作者: 徐寧迎(1956), 男, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向: 動(dòng)物遺傳育種, E-mail: nyxu66 HEREDITAS (Beijing) 2007 第29卷類。Barnoy等的研究表明,在胚胎期成肌細(xì)胞融合為多核細(xì)胞這一過(guò)程中CAST的表達(dá)量顯著降低。 Rettenberger等將CAST基因定位于豬2號(hào)染色體上。Ernst等5在豬2號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與CAST基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記, 進(jìn)一步將其精確定位于2q2.1 q2.4上, 并在擴(kuò)增的1.6 kb長(zhǎng)度的片段中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)酶切多態(tài)性(Msp, Hinf

9、和 Rsa)位點(diǎn)。孫立彬等采用PCR-RFLP方法研究了豬CAST基因的多態(tài)性與肉質(zhì)性狀及背膘厚之間的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)了不同基因型之間的肌內(nèi)脂肪和背膘厚差異顯著。程豐等分析了豬種與CAST基因多態(tài)性的關(guān)系, 結(jié)果表明, 不同的豬種之間CAST基因型頻率存在著顯著的差異。本實(shí)驗(yàn)采用具有優(yōu)良肉質(zhì)的本地金華豬與肉質(zhì)相對(duì)較差的引進(jìn)品種皮特蘭豬雜交所產(chǎn)的金皮F2代豬為研究對(duì)象, 利用PCR-RFLP的方法檢測(cè)金皮F2代豬CAST基因型的頻率, 并采用肌球蛋白重鏈(MHC)單克隆抗體及蘇木精-伊紅染色劑, 分別對(duì)豬背最長(zhǎng)肌連續(xù)性石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和常規(guī)染色。采用SPSS程序分析了CAST基因的不同基

10、因型對(duì)金皮F2代豬肌纖維組織學(xué)特性及屠宰性狀的影響, 為CAST基因作為豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇分子的可行性提供參考依據(jù)。1 材料和方法1.1 材 料實(shí)驗(yàn)豬來(lái)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)。所有的豬在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下, 按正常營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng), 生長(zhǎng)至90 kg左右時(shí)采用頸動(dòng)脈放血致死法, 取血樣迅速置72冰箱中冷凍保存, 背最長(zhǎng)肌置入4%甲醛溶液中固定保存。1.2 方 法 1.2.1 試劑與引物蛋白酶K、Msp、Hinf、Rsa、Taq酶和dNTP均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司; MHC-Slow和MHC-Fast單克隆抗體購(gòu)自晶美生物工程有限公司。引物序列參照Ernst等并根據(jù)CAST DNA序列(

11、GenBank登陸號(hào): AY594692), 利用Primer 5.0自行設(shè)計(jì)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR引物序列如下: 上游引物5-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3; 下游引物5- TGCTACACCAGTAACAG-3。1.2.2 DNA的提取和純度測(cè)定參照現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)提取豬基因組DNA。用分光光度計(jì)測(cè)定OD值, 根據(jù)OD 260/OD280判斷DNA純度, 并稀釋至50 mg/L。 1.2.3 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序PCR反應(yīng)體系: 10PCR緩沖液(含MgCl2 15 mmol/L)2.5 L; dNTP (2.5 mmol/L)2.0 L

12、; 上下游引物(10 pmol/L )各0.75 L; 模板DNA1.0 L; Taq DNA酶(5 U/L)0.4 L; 加滅菌雙蒸水至總反應(yīng)體積25 L。PCR反應(yīng)條件: 預(yù)變性94 5 min, 進(jìn)入循環(huán): 94 40 s、56 40 s、72 1 min, 34個(gè)循環(huán), 72延伸7 min、4保存, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。1.2.4 PCR-RFLP分析酶切反應(yīng)體系20 L, 其中10 L PCR產(chǎn)物, Msp、Hinf和Rsa 3種限制性內(nèi)切酶的添加量分別為1.5、0.5和1 U, 37水浴 5 h。3%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果, 凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄。 1.2.5 切

13、片的制作及蘇木精-伊紅染色將4%甲醛固定的豬背最長(zhǎng)肌樣品修塊后經(jīng)常規(guī)脫水浸臘、石蠟包埋、切片機(jī)8 m厚度連續(xù)切片、60烤片8 h至干燥常溫保存。切片采用常規(guī)HE染色, 顯微鏡觀察拍片。 1.2.6 免疫組織化學(xué)染色(1) 切片經(jīng)二甲苯溶液脫蠟6 min2次, 無(wú)水乙醇4 min2次, 90%酒精3 min, 80%酒精3 min, 70%酒精3 min,蒸餾水3 min脫蠟、浸水。(2) 0.5% H2O2溶液中浸泡10 min, 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性; 在10 mmol/L檸檬酸緩沖液中放入水浴鍋中加熱至97煮沸作用20 min, 自然冷卻至室溫。(3) 滴加10%正常兔血清作用10 m

14、in, 甩去血清后滴加肌球蛋白重鏈慢型單克隆抗體或快型單克隆抗體, 于4冰箱過(guò)夜。(4) TBS洗10 min3次; 滴加生物素標(biāo)記的二抗, 37濕盒孵育1 h。(5) TBS洗10 min3次, 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗生物素蛋白, 37濕盒孵育1 h。(6) TBS洗5 min3次, DAB顯色5 10 min, 顯微鏡下觀察, 雙蒸餾水浸泡3 min2次終止顯色。第1期武艷群等: 豬CAST基因多態(tài)性與肌纖維組織學(xué)特性及屠宰性狀的相關(guān)性分析 67(7) 蘇木精復(fù)染核, 常規(guī)水洗、脫水、透明、封片。顯微鏡觀察, 拍照。別為0.1778, 0.2222, 0.6000。1.3 統(tǒng)計(jì)分

15、析1.3.1 豬群各基因型的頻率及基因頻率的計(jì)算豬群各基因型的頻率及基因頻率的計(jì)算方法參 見(jiàn)文獻(xiàn), 采用以下線性模型分析各種基因型的效應(yīng):yij=+gi+eij上式中yij為基因型i, 第j個(gè)觀察值, gi為基因 型i的遺傳效應(yīng)值, eij為隨機(jī)誤差。 1.3.2 肌纖維組織學(xué)性狀的統(tǒng)計(jì)分析采用Image J軟件對(duì)HE染色拍照結(jié)果進(jìn)行肌纖維密度肌纖維橫截面積、肌纖維直徑統(tǒng)計(jì); 并對(duì)免疫組織化學(xué)染色拍照結(jié)果進(jìn)行MHC型肌纖維比例統(tǒng)計(jì)。圖1 CAST基因Msp酶切后圖譜1、2、4、5、7 12: AB基因型; 3: AA基因型; 6: BB基因型; M: Marker為500 bp。Fig. 1

16、Profile of CAST gene digested by Msp1, 2, 4, 5, 712: AB genotype; 3: AA genotype;6: BB genotype; M: DNA marker (500 bp).2 結(jié) 果2.1 基因型檢測(cè)CAST基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Msp限制性內(nèi)切酶 酶切, 3%瓊脂糖凝膠電泳后, 共檢測(cè)出275、502、 370、276 bp 4條帶。定義等位基因A(275+502+646 bp) 和B(275+502+370+276 bp)(如圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinf限制性內(nèi)切酶酶切, 3%瓊脂 糖凝膠電泳后, 共檢測(cè)出163、503、17

17、4、372、211 bp 5條帶。定義等位基因C(666+372+174+211 bp) 和D(163+503+372+174+211 bp)(圖2)。CAST基因產(chǎn)物經(jīng)Rsa限制性內(nèi)切酶酶切, 3% 瓊脂糖凝膠電泳后, 共檢測(cè)出649、340 、162 、183、 89 bp 5條帶。定義等位基因A(649+340+162+272 bp) 和B(649+340+162+183+89 bp)(圖3)。圖2 CAST基因Hinf酶切后圖譜2 7、12: CD基因型; 9 11: CC基因型; 1和8: DD基因型; M: 基因marker為500 bp。Fig. 2 Profile of CAS

18、T gene digested by Hinf27, 12: CD genotype; 911: CC genotype; 1, 8: DD genotype; M:DNA marker (500 bp).2.2 基因型頻率金皮F2代CAST基因 經(jīng)Msp、Hinf和Rsa 酶切后, 如果每種酶切有3種基因型, 那么可能存在 27種基因型, 但在本實(shí)驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)了AACCEE、 ABCDEF等3種基因型, 其基因型頻率分BBDDFF、圖3 CAST基因Rsa酶切后圖譜2、6 8: EF基因型; 3、10 12: EE基因型; 1、4和9: FF基因型; M: 基因marker為2,000 bp。

19、Fig. 3 Profile of CAST gene digested by Rsa2, 68: EF genotype; 3, 1012: EE genotype;1, 4, 9: FF genotype; M: DNA marker (2,000 bp).表1 金皮F2豬CAST基因的基因型分布及基因頻率Table 1 The genotype of CAST gene and the gene frequency品種(頭數(shù)) Breed (number) 金皮F2 (45)PCR-RFLP基因型分布及基因頻率The genotype of CAST gene and the gene

20、frequencyAACCEE BBDDFF ABCDEF A/C/E B/D/F 0.177 8 (8)0.2222 (10)0.6000 (27)0.66800.332068 HEREDITAS (Beijing) 2007第29卷2.3 背最長(zhǎng)肌肌纖維染色結(jié)果蘇木精-伊紅染色法(HE染色)是最為常用的組2.4 CAST基因?qū)鹌2代豬肉質(zhì)性狀的效應(yīng) 2.4.1 CAST基因?qū)鹌2代豬肌纖維性狀的效應(yīng) 采用獨(dú)立效應(yīng)線性模型分析了CAST基因的不同基因型對(duì)金皮F2代豬肌纖維特性(包括肌纖維橫截面積、肌纖維直徑、肌纖維密度和慢肌比例)的效應(yīng), 結(jié)果表明(表2)CAST基因的BBDDFF和

21、ABCDEF基因型對(duì)肌纖維橫截面積有顯著的不同影響(P 0.05), ABCDEF基因型個(gè)體比BBDDFF基因型個(gè)體肌纖維橫截面積小13.43%; 對(duì)其余性狀的影響均不顯著?？椙衅旧椒? 也是適合研究肌纖維的一種染色方法, 蘇木精將肌纖維細(xì)胞核染成藍(lán)紫色, 伊紅將肌纖維細(xì)胞質(zhì)染成桃紅色, 兩種組織對(duì)比十分明顯, (圖4: A)。免疫組織化學(xué)染色是一種根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合并顯色的方法來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)是否存在的一種化學(xué)染色技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌球蛋白重鏈單克隆抗體與肌球蛋白重鏈特異性結(jié)合反應(yīng), 運(yùn)用酶標(biāo)顯色方法來(lái)檢測(cè)肌纖維類型組成。MHC-Slow單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)黃棕色, 屬型肌纖維(圖4:

22、 B); MHC-Fast單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞, 呈現(xiàn)黃棕色, 屬型肌纖維(圖4: C)。2.4.2 CAST基因?qū)鹌2代豬屠宰性狀的效應(yīng)CAST基因的不同基因型對(duì)金皮F2代豬屠宰性狀(包括眼肌面積、眼肌系水力、眼肌pH45m值和眼肌導(dǎo)電率)的效應(yīng)列在表3。由表3可以看出, CAST圖4 背最長(zhǎng)肌肌纖維橫切面石蠟切片染色結(jié)果觀察圖(100)Fig. 4 Staining of paraffin cross-sections of longissimus dorsi muscle. Magnification, (100)表2 CAST基因?qū)鹌2代豬肌纖維性狀的效應(yīng)Table 2 The

23、effect of the CAST gene on muscle fiber characteristics of Jinpi F2 pigs肌纖維橫截面積(m) 肌纖維直徑(m) CAST型 樣本數(shù) 肌纖維密度 (mm) MHC I型肌纖維 (%)22Genotype N Fiber density (mm) Rate of MHCI fiber (%) Fiber cross-sectional area (m) Fiber diameter (m)2335.0294.09 69.541.69 343.9613.30 5.630.86 AACCEE 8 BBDDFF 10 ABCDEF

24、272514.9486.57a2177.1664.86b69.951.48 345.0621.82 6.301.65 67.821.45 334.2612.54 5.890.43注: 肩標(biāo)a與b之間表示差異顯著。Note: Superscripts a and b indicate significant differences between the means (P0.05).表3 CAST基因?qū)鹌2代豬屠宰性狀的效應(yīng)Table 3 The effect of the CAST gene on carcass characteristics of Jinpi F2 pigsCAST型

25、樣本數(shù) 眼肌面積 眼肌系水力 眼肌pH45m值 眼肌導(dǎo)電率 Genotype N Eye muscle area Water Holding capacity pH45m value Conductance AACCEE 8 32.631.20 1.650.23 6.280.08 2.990.28a1.500.29 6.200.04 2.620.11 BBDDFF 10 34.761.54bABCDEF 27 30.920.891.410.09 6.200.04 2.81 0.07注: 肩標(biāo)a與b之間表示差異顯著。Note: Superscripts a and b indicate sign

26、ificant differences between the means (P 0.05).第1期武艷群等: 豬CAST基因多態(tài)性與肌纖維組織學(xué)特性及屠宰性狀的相關(guān)性分析 69基因的BBDDFF和ABCDEF基因型對(duì)眼肌面積有顯著的不同影響(P0.05), ABCDEF基因型個(gè)體比BBDDFF基因型個(gè)體眼肌面積小12.42%; 對(duì)其余性狀的影響均不顯著。3 討 論3.1 CAST基因的多態(tài)性本實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP技術(shù), 對(duì)CAST基因第六外顯子到第七外顯子之間的區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增, 得到了1,423 bp長(zhǎng)度的DNA片段。采用Msp、Hinf和Rsa3種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切, 在Msp酶

27、切結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)酶切位點(diǎn), 分別將PCR產(chǎn)物切為275、502、370和276 bp 4個(gè)長(zhǎng)度的片段, 其中370和276 bp之間酶切位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn); 在Hinf酶切結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)酶切位點(diǎn), 分別將PCR產(chǎn)物切為163、503、174、372和211 bp 5個(gè)長(zhǎng)度的片段, 其中163和503 bp之間酶切位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn); 在Rsa酶切結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)酶切位點(diǎn), 分別將PCR產(chǎn)物切為649、340、162、183和89 bp 5個(gè)長(zhǎng)度的片段, 其中183和89 bp之間酶切位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn)。酶切結(jié)果中只發(fā)現(xiàn)了AACCEE、BBDDFF和ABCDEF 3種基因型, 在Ernst和程豐的研究中

28、也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象, 具體的原因還沒(méi)有分析出來(lái), 本實(shí)驗(yàn)也可能與實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量太少有關(guān)。AACCEE、BBDDFF和ABCDEF 3種基因型頻率分別為0.1778, 0.2222和0.6000。3.2 CAST基因?qū)鹌2代豬肉質(zhì)性狀的效應(yīng) Lonergan等研究了牛的CAST基因RFLP多態(tài)性對(duì)肌肉嫩度的影響, 結(jié)果顯示影響不顯著, 但其選擇研究的位點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)不同。Pringle等11以雜交牛為對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAST與-calpain的活性比值與肌肉的嫩度高度相關(guān)。孫立彬等采用PCR-RFLP方法研究了CAST基因的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪、肌內(nèi)蛋白、眼肌肉色、嫩度及背膘厚之間的關(guān)系, 而

29、本實(shí)驗(yàn)研究了CAST基因的多態(tài)性與眼肌面積、眼肌系水力、眼肌pH45m值及眼肌導(dǎo)電率等屠宰性狀的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)分析了CAST基因RFLP多態(tài)性與金皮F2代豬背最長(zhǎng)肌肌纖維橫截面積, 密度, 直徑及MHC型肌纖維比例等肌纖維組織學(xué)特性的相關(guān)性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABCDEF基因型個(gè)體比BBDDFF基因型個(gè)體肌纖維橫截面積小13.43%。根據(jù)陳潤(rùn)生等的研究結(jié)果可知肌纖維橫截面積越小, 肌間脂肪面積越大則肌肉的系水力越強(qiáng), 肉質(zhì)越好。因而我們可以將ABCDEF作為肉質(zhì)性狀的優(yōu)勢(shì)基因型。此外, 本實(shí)驗(yàn)還研究了CAST基因RFLP多態(tài)性與金皮F2代豬眼肌面積、眼肌系水力、眼肌pH45m值和眼肌導(dǎo)電率等屠宰性狀的

30、關(guān)系。結(jié)果顯示ABCDEF基因型個(gè)體比BBDDFF基因型個(gè)體眼肌面積小12.42%, 從而進(jìn)一步證明了CAST基因是一個(gè)對(duì)肉質(zhì)相關(guān)性狀非常有關(guān)的候選基因。參考文獻(xiàn)(References):1 Taylor RC, Geesink GH, Thompson M, Koohmaraie, GollDE. Is Z-disk degradation responsible for postmortem ten-derization? J Animal Sci, 1995, 73: 13511367.2 Geert H, Geesink GH, Koohmaraie M. Effect of calp

31、as-tatin on degradation of myofibrillar proteins by -calpain under postmortem conditions. J Animal Sci, 1999, 77: 26852692.3 Barnoy S, Glaser T, Kosower NS. The role of calpastatin (thespecific calpain inhibitor) in myoblast differentiation and fu-sion. Biochem Biophys Res Comm, 1996, 220: 993998.4

32、Rettenberger G, Bruch J, Fries R. Assignment of 19 por-cine typeloci by somatic cell hybrid analysis detects new regions of conserved synteny between human and pig. Mammalian Genome, 1996, 7: 275279.5 Ernst CW, Robic A, Yerle M, Wang L, Rothschild MF.Mapping of calpastatin and three microsatellites to porcine chromosome 2q2.1-q2.4. Animal Genetics, 1998, 29: 212215.6 SUN Li-Bin, MENG-He, LI-Jing, BAI Chun-Yan, PANYu-Chun. Polymorphism analysis of porcine calpastatin gene by PCR-RFLP and its association with pork qualities and thickness of back fat. Journal of Shanghai Jiaotong University, 20