高效液相色譜法測定血漿中泮托拉唑濃度

1、    高效液相色譜法測定血漿中泮托拉唑濃度        摘要目的：建立用高效液相色譜法測定血漿中泮托拉唑濃度的方法，為進(jìn)行泮托拉唑的體內(nèi)藥物代謝、生物利用度研究提供基礎(chǔ)。方法：血漿用0.01mol.L-1磷酸氫二鈉做pH調(diào)節(jié)劑，二氯甲烷做提取溶劑，硝西泮作內(nèi)標(biāo)。采用Platinum C18(5u，250mm×4.6mm)柱，流動相：甲醇-水-醋酸鹽緩沖液(40605)，流速1.0ml.min-1，檢測波長286nm。結(jié)果：該法回收率平均在98.36%104.27

2、%，重現(xiàn)性高，RSD在4.693%9.12%范圍內(nèi)(n=5)，線性范圍：204000g.L-1，最低檢測濃度15g.L-1。結(jié)論：HPLC測定血漿中泮托拉唑的方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、專一，能滿足血藥濃度測定及藥代動力學(xué)研究的需要。關(guān)鍵詞泮托拉唑；高效液相色譜；血藥濃度Determination of pantoprazole in plasma by HPLCJiao Xiaolan(Jiao XL),Duan Jingli(Duan JL),Si Kaiying(Si KY),et al (Department of Pharmacy ,Third Hospital of Beijing Me

3、dical University, Beijing,100083)ABSTRACTOBJECTIVE:To establish an assay to determine pantoprazole in plasma by means of high-performance liquid chromatography for the pharmacokinetic study of pantoprazole.METHOD:The platinum C18 column(250mm×4.6mm,5u) was used as analytical column.The mobile p

4、hase consisted of methanol-water-acetate buffer(pH4.3)40605.The flow rate was 1.00mi.min-1.The blood samples were extracted by 0.01mol.L-1Na2HPO4 solution and dichloromethane,=286nm.RESULTS:The recovery of this method was 98.36%104.27% and the validation was RSD=4.69%9.12%(n=5).CONCLUSION:The method

5、 is simple, accurate and sensitive.It provides a suitable analytical method for its pharmacokinetic studies.KEYWORDSpantoprazole, HPLC,plasma concentration 第三代質(zhì)子泵抑制劑泮托拉唑?qū)俦讲⑦溥蝾愌苌?，化學(xué)名稱：5-(雙氟甲氧基)-2-(3，4-甲氧基-2-吡啶基)-甲基亞硫?；?1-H-苯并咪唑?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見1。1泮托拉唑結(jié)構(gòu)由于結(jié)構(gòu)中含有2個烷氧基，故該藥性質(zhì)比單烷氧基吡啶類藥物奧美拉唑等更穩(wěn)定，治療選擇性高，不良反應(yīng)少1。臨床用于治療胃

6、酸過多引起的消化道疾病。目前該藥在國內(nèi)尚未廣泛使用，亦未見有關(guān)測定其血藥濃度方法的報道；國外文獻(xiàn)報道中所采用的方法多為直接進(jìn)樣在線柱分離、自動柱切換、梯度洗脫方法24所需設(shè)備復(fù)雜、昂貴，國內(nèi)很難普及。為滿足對泮托拉唑血藥濃度測定及進(jìn)行藥物代謝研究的需要，筆者進(jìn)行了HPLC血漿藥物濃度測定的方法學(xué)研究，取得了較滿意的結(jié)果。1儀器與試藥1.1儀器SP8810高效液相色譜泵，Spectra UV2000型紫外檢測器，6UK進(jìn)樣閥，SP4290型積分儀，YKL-液體快速混合器，TGL-16C型超速離心機(jī)，1.2試藥甲醇，二氯甲烷，冰醋酸，醋酸鈉，磷酸氫二鈉均為AR級試劑(北京化工廠)，二氯甲烷經(jīng)重蒸后

7、使用，水為新鮮去離子蒸餾水。泮托拉唑鈉標(biāo)準(zhǔn)品(沈陽東宇制藥有限公司，純度99.8%以上)，硝西泮純粉(北京第三制藥廠，純度99.5%)。2實驗方法與結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取干燥至恒重的泮托拉唑鈉100mg,置于100ml棕色量瓶中，以雙蒸水溶解成為1g.L-1儲備液。分別精密吸取0.1，0.25，0.5，1.0，2.0，3.0ml置于25ml量瓶中以雙蒸水定容至刻度，配成濃度為4，10，20，40，80，120g.L-1的標(biāo)準(zhǔn)液，于4冰箱保存?zhèn)溆?。另精密稱取硝西泮適量，以甲醇溶解配成10g.ml-1溶液，冰箱冷藏備用。2.2色譜條件色譜柱:Platinum C18100A 5u分析柱2

8、50mm×4.6mm(美國Alltech產(chǎn)品)，流動相：甲醇-水-醋酸鹽緩沖液(pH=4.3)40605，經(jīng)4.6m微孔濾膜過濾，超聲脫氣后使用。內(nèi)標(biāo)：硝西泮，流速：1ml.min-1，檢測波長286nm，數(shù)據(jù)處理機(jī)參數(shù)：衰減8，紙速0.1mm.min-1，溫度：室溫，進(jìn)樣量：20l。在本實驗條件下，兩種物質(zhì)的色譜峰分離良好，與血漿內(nèi)源性物質(zhì)峰無干擾。內(nèi)標(biāo)峰保留時間為10.74min，泮托拉唑峰保留時間為13.04min。見2。2高效液相色譜測定泮托拉唑血藥濃度色譜A-空白人血漿；B-泮托拉唑與內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)譜；C-含藥血漿；a-泮托拉唑tR=13.04min;b-內(nèi)標(biāo)硝基安定tR=10

9、.76min2.3血漿樣品的制備與處理分析用血漿樣品液：精密量取空白血漿0.5ml，加入一定量泮托拉唑 (或取含藥血漿0.5ml)，置10ml具塞離心管中，加入10g.L-1硝西泮甲醇溶液20l，混勻后再加入0.01mol.L-1磷酸氫二鈉0.5ml，混勻30s再加入二氯甲烷3ml，渦旋振蕩5min，放置-20冰箱凍存10h(過夜)，自然解凍后3000r.min-1離心5min，棄上層，取有機(jī)相2.5ml置塑料試管中，室溫下氮氣吹干，殘留物以100l甲醇溶解，12000r.min-1離心5min，取上清液20l進(jìn)樣。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、最低檢測限取空白血漿每管0.5ml共7管，分別精確加

10、入一定量泮托拉唑標(biāo)準(zhǔn)液，使成系列濃度20，50，100，500，1000，2000，4000g.L-1，按照血漿樣品制備與處理項下所述方法處理，經(jīng)HPLC測定，以血漿中藥物濃度對泮托拉唑與內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行線性回歸：結(jié)果在204000g.L-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=-0.0016+0.0017X,r=0.9996。本法最低檢測濃度為15g.L-1。2.5精密度、回收率及專一性考察分別于同一日內(nèi)不同時間及不同日間按上法提取處理樣品，高(2000g.L-1)、中(500g.L-1)、低(50g.L-1)3種濃度各5管，并測定藥物濃度，計算日內(nèi)、日間精密度及標(biāo)準(zhǔn)差，以考察方法的準(zhǔn)確度及相對回

11、收率。結(jié)果見表1。表1方法精密度及回收率實驗結(jié)果加入濃度/g.L-1日內(nèi)(n=5)日間(n=5)實測濃度回收率RSD實測濃度回收率RSD/g.L-1/%/%/g.L-1/%/%5055.1±3.15110.25.7352.21±3.85103.77.37500470.31±22.9793.634.69521.33±47.99104.279.212000875.91±101.293.815.411867.22±130.0698.366.61另取相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)液，直接進(jìn)樣測定峰面積，將血漿樣品處理后測定的峰面積與之相比，計算萃取回

12、收率。泮托拉唑平均萃取回收率為(82.6±4.6)%(n=4)。內(nèi)標(biāo)物硝西泮的平均萃取回收率為(89.4±5.9)%(n=4)。為考察方法的專一性，對臨床常用的一些藥物在本實驗條件下同時進(jìn)行了外加入法測定：地西泮、苯巴比妥、普魯卡因胺、馬來酸氯苯那敏、茶堿、鹽酸噻氯匹啶、瑞巴比特等在本條件下不被檢出或出峰相距很遠(yuǎn)，對內(nèi)標(biāo)及泮托拉唑測定無干擾。2.6應(yīng)用實例對10名健康志愿者進(jìn)行了po泮托拉唑藥代動力學(xué)研究。受試者服藥后不同時間采靜脈血，分離血漿，再用本方法進(jìn)行血藥濃度測定，經(jīng)3P87程序處理后得到各藥代動力學(xué)參數(shù)值。得藥-時數(shù)據(jù)，繪制藥-時曲線，平均藥-時曲線見3，藥代動力

13、學(xué)參數(shù)見表2。 表210名健康志愿者單次口服泮托拉唑40mg后主要藥代動力學(xué)參數(shù)藥代參數(shù)實驗結(jié)果Lag time/h2.46±0.58V/F(c)L×1030.14±0.14t1/2/h1.18±1.06t1/2Ka/h0.44±0.25tmax/h3.35±0.63cmax/g.L-12493±1272AUC/g.h.L-15858.13±5176Cl(s)L/h×1030.011±0.006310名健康志愿者單次口服泮托拉唑腸溶片40mg后平均藥物濃度-時間曲線3討論3.1泮托拉唑?qū)賶A性藥物

14、，酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，易降解，故在提取過程中要注意提取液pH不能太低，以避免降解。所以采用偏堿性條件以抑制藥物解離，經(jīng)反復(fù)試驗以0.01mol.L-1Na2HPO4做pH調(diào)節(jié)劑，可使藥物及內(nèi)標(biāo)萃取率提高。3.2萃取溶劑分別考察了乙酸乙酯、二氯甲烷及二氯甲烷與正庚烷或異丙醇的混合液，乙酸乙酯對泮托拉唑萃取率不高。二氯甲烷效果較理想，只是與血漿等含蛋白較多的物質(zhì)混合時，極易發(fā)生乳化；雖然減低振蕩速度或采用搖床振蕩提取可使乳化現(xiàn)象稍有改善，仍難以徹底避免，且提取效率降低；試驗中發(fā)現(xiàn)發(fā)生乳化時將其置于-20冰箱中冷凍數(shù)小時，自然解凍即可破乳，離心后兩相分離良好，且冷凍并未影響提取效果；同時采用內(nèi)標(biāo)可以避

15、免在操作過程中的一些人為因素影響提取測定精確度。3.3流動相中加入醋酸鹽緩沖液，使其pH在6.5時泮托拉唑及內(nèi)標(biāo)分離度增加，以甲醇-水-醋酸鹽緩沖液(pH=4.5)40605作流動相，分離效果較理想。3.4本法靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性及專一性符合測試要求，血漿樣本中藥物提取方法簡便易行。通過對10名健康志愿者單次po泮托拉唑腸溶片后血藥濃度的測定及藥代動力學(xué)研究結(jié)果可以看出，本法適用于泮托拉唑的藥代動力學(xué)研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測工作。作者單位：黃小芳劉東麟嚴(yán)寶霞 (北京100083北京醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院藥劑科；焦效蘭段京莉司凱英原北京醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院藥劑科進(jìn)修生)參考文獻(xiàn)1Simon

16、 WA,Keeing DJ,Laing SM,et al.Biochemistry of a novel(H+/K+AT) pase inhibitor.Biochem Pharmacol,1990,39(1):1799.2Tanaka M,Yamazaki H,Ryokawa Y,et al.Pharmacokinetics and tolerance of pantoprazole,a proton pump inhibitor after single and multiple oral doses in healthy Japanese volunteers.Int J Clin Pharmacol Ther,1996,34(10):415.3Huber R,Muller W.Hig