維拉帕米在應(yīng)力對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期反應(yīng)基因蛋白表達(dá)中作用的研究

1、維拉帕米在應(yīng)力對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期反應(yīng)基因蛋白表達(dá)中作用的研究         10-05-03 14:34:00     編輯：studa20             作者：黎潤(rùn)光，邵景范，魏明發(fā)，趙東明，王鋼陳濱，任高宏 【摘要】  目的研究維拉帕米(Verapamil)在周期性牽張應(yīng)力對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs

2、)早期反應(yīng)基因蛋白表達(dá)中的作用，從而進(jìn)一步推斷出Ca2+ 通道在細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用。方法分離并培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用體外細(xì)胞牽張應(yīng)力裝置對(duì)第36代細(xì)胞加載力學(xué)信號(hào)，在應(yīng)力干預(yù)細(xì)胞前加及不加鈣離子拮抗劑（維拉帕米），受力結(jié)束后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，用RTPCR以及免疫組化的方法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)cfos、cjun和cmyc基因蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果加載力學(xué)信號(hào)后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生改變，cfos、cjun和cmyc基因蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，經(jīng)維拉帕米預(yù)處理后，以上生物學(xué)效應(yīng)受到抑制(P<0.01)。結(jié)論在牽張應(yīng)力作用下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Ca

3、2+內(nèi)流發(fā)生了變化，并且這種變化在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)周期性牽張應(yīng)力的早期應(yīng)答反應(yīng)中起到了部分作用,可能依賴(lài)鈣離子通道的活化來(lái)調(diào)控。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 牽張應(yīng)力； cfos； cjun； cmyc； 維拉帕米    Abstract：ObjectiveTo study the effects of verapamil on the immediateearly gene(IEGs) expression of bone marrow mesenchymal stimulated by mechanical strain,and deduce

4、 the effects of calcium ion channel on the early responses of children bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs)to mechanical strain in vitro.MethodMSCs were isolated and cultured.The 3-6th generational MSCs were stimulated in different time by mechanical and (or) verapamil（20mol/l）.Flow cytometry w

5、as applied to measure intracellular free Ca2 at once.Earlyresponse genes /proteins （cfos,cjun and cmyc）were examined by RTPCR and immunocytochemical stain.ResultThe application of mechanical strain  increased intracellular cfos,cjun and cmyc mRNA /protein levels.The resulting effect is partiall

6、y inhibited before MSCs were preincubated with verapamil (P<0.01).ConclusionMechanical strain could change intracellular free calcium ion concentration of bone marrow mesenchymal stem cells,which was partially inhibited by verapamil,and the change playes a key role in early response of MSCs 

7、 to mechanical loading.    Key words：mesenchymal stem cells (MSCs);  strain;  cfos;  cjun;  cmyc;  verapamil    力學(xué)因素在各種組織細(xì)胞中起重要的調(diào)控作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells ，MSCs）是體內(nèi)成骨和骨重建的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。體外研究表明，適當(dāng)?shù)膽?yīng)力可促進(jìn)MSCs增殖及向成骨分化1、2，而過(guò)度的應(yīng)力則對(duì)MSCs造成一定的損傷3、4。細(xì)胞響應(yīng)

8、機(jī)械應(yīng)力的早期反應(yīng)相當(dāng)復(fù)雜5。鈣離子被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使之一，對(duì)細(xì)胞各種生理活動(dòng)具有廣泛調(diào)控作用。胞內(nèi)Ca2極少，當(dāng)細(xì)胞受到理化因素等外界刺激后，胞漿Ca2濃度大幅度增加。cfos、cjun、cmyc等是細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)信號(hào)的重要中間產(chǎn)物，受刺激后短時(shí)間后即可檢測(cè)到這些基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。但這些基因誘導(dǎo)表達(dá)非常短暫，其mRNA壽命也很短，而且誘導(dǎo)這些基因不依賴(lài)于新蛋白的合成，故也稱(chēng)之為早期反應(yīng)基因，它們能夠激活下游調(diào)節(jié)分泌蛋白酶細(xì)胞因子，啟動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等生物效應(yīng)。維拉帕米（Verapamil）是一種選擇性鈣拮抗劑，能阻斷L型Ca2通道。在加載力學(xué)信號(hào)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入一定濃度的Ver

9、apamil預(yù)處理，觀察其在MSCs內(nèi)Ca2以及早期反應(yīng)基因表達(dá)的情況，以推斷細(xì)胞響應(yīng)應(yīng)力的早期反應(yīng)依賴(lài)于鈣離子通道的活化。    1  材料與方法    1.1  主要儀器及試劑    DMEMLG培養(yǎng)基（Gibco），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Hyclone），維拉帕米（Alexis），Trizol細(xì)胞裂解液（Sigma），胰蛋白酶及瓊脂糖（Amersco），RT及PCR試劑盒（TaKaRa），鈣離子探針fluo4/AM（invitrogren）、cfos、cjun、cmyc一抗（Santa&

10、#160; cruz），sp法二抗試劑盒（北京中衫），各引物（上海英峻基因生物公司）等；主要儀器包括參考Schaffer等6的方法自行建立的體外細(xì)胞牽張力學(xué)裝置（其結(jié)構(gòu)與原理見(jiàn)文獻(xiàn)7）、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,日本)、流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）、分光光度計(jì)(島津1240紫外，日本)、PCR儀（Eppendorf，美國(guó)）等。    1.2  細(xì)胞取材與培養(yǎng)    MSCs取自先天性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良行骨盆截骨術(shù)的患者（69歲，征得患者及家屬同意），術(shù)中髂前上棘無(wú)菌穿刺取材，Percoll淋巴分離液密度梯度法分離MSCs細(xì)

11、胞，接種于LDMEM10胎牛血清雙抗（100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素）中，置37、5CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱原代培養(yǎng)，換液傳代，反復(fù)貼壁純化，并進(jìn)行增殖活性以及多向分化潛能檢測(cè)8。    1.3  應(yīng)力及維拉帕米對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響    取第36代細(xì)胞，以每孔1.5×105/2 ml的密度接種于6孔彈性硅膠膜培養(yǎng)板（Flexcell，USA）內(nèi)培養(yǎng)，次日細(xì)胞貼壁，待細(xì)胞完全覆蓋培養(yǎng)基膜后，分組干預(yù)細(xì)胞（維拉帕米在細(xì)胞受力前30 min加入，濃度為20 mol/L9），如表1，力學(xué)參數(shù)為正弦波

12、形，頻率為1 Hz、強(qiáng)度為12，各組細(xì)胞來(lái)源一致，不受應(yīng)力刺激組除不受牽張應(yīng)力刺激外，其他條件與受力組保持一致；各組實(shí)驗(yàn)均放置細(xì)胞培養(yǎng)箱里進(jìn)行。各組細(xì)胞受刺激結(jié)束后，立即行細(xì)胞內(nèi)鈣離子的檢測(cè)，用細(xì)胞外液洗滌2次，按照說(shuō)明書(shū)原位加載fluo4/AM，37避光孵育30 min，去除上清，細(xì)胞外液清洗細(xì)胞3次，以徹底去除細(xì)胞外殘留的探針，胰酶消化離心收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，檢測(cè)波長(zhǎng)為488 nm。 表1  實(shí)驗(yàn)分組以及干預(yù)條件組別受力刺激時(shí)間有無(wú)加入維拉帕米預(yù)處理    1.4  應(yīng)力及維拉帕米對(duì)細(xì)胞內(nèi)cfos、cjun和c

13、myc表達(dá)的影響    另取細(xì)胞分4組，A（力-、V-）、B（力-、V）、C（力、V）、D（力、V-），受力組加載力學(xué)信號(hào)1 h，余參數(shù)同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集標(biāo)本以行RTPCR、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各指標(biāo)mRNA以及蛋白表達(dá)。由英峻公司合成引物（表2），Trizol裂解提取各組細(xì)胞RNA，常規(guī)RTPCR，將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳，GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察并分析各條帶；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，PBS漂洗3次，4多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，剪下硅膠膜，裁成小片狀，0.2triton破膜，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，按順序加入封閉液、一抗（180稀釋?zhuān)⒍?/p>

14、抗，DBA顯色，鏡下觀察，并進(jìn)行細(xì)胞染色灰度值定量分析。表2  cfos、cjun、cmyc以及內(nèi)參的引物設(shè)計(jì)基因    1.5  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析    實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以±s表示，各參數(shù)之間的差異顯著性應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)。    2  結(jié)  果    2.1  活體細(xì)胞的形態(tài)排列顯微鏡觀察    原代細(xì)胞接種后24 d開(kāi)始貼壁，呈成纖維樣梭形。第34 d首次換液后即可見(jiàn)細(xì)胞迅速增殖，呈克隆樣生長(zhǎng)，經(jīng)多次換液及PBS洗滌后，造血細(xì)胞逐漸被清除。1214 d細(xì)胞融合達(dá)80 。傳代后的MSCs生長(zhǎng)速度增快，710 d可鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底，呈細(xì)長(zhǎng)梭形旋渦狀分布直至融合細(xì)胞消化后接種于底部為硅膠膜的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)約48 h，細(xì)胞覆蓋率達(dá)80，經(jīng)周期性牽張應(yīng)力或（和）維拉帕米短暫干預(yù)后，各組細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差別，未見(jiàn)脫壁、破裂等現(xiàn)象。    2.2  各組刺激對(duì)小兒MSCs游離鈣離子的影響    如圖1所示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞受不同時(shí)間應(yīng)力作用后，胞內(nèi)鈣離子的