重組人生長激素對裸鼠胃癌移植瘤生長及血清VEGF濃度的影響

1、    重組人生長激素對裸鼠胃癌移植瘤生長及血清VEGF濃度的影響作者：程璐,林巖,李蘇宜 作者單位：東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210009;南京醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210011【摘要】 目的：研究重組人生長激素(rhGH)對裸鼠人胃癌移植瘤生長及血清VEGF水平的影響。方法：取60只雄性裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測胃癌細(xì)胞株SGC7901及MKN45生長激素受體(GHR)的表達(dá)狀況，將GHR陽性表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC7901及GHR陰性表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MKN45分別接種于4只裸鼠皮下，制作裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，3周后取出

2、移植瘤制成組織勻漿，接種于剩余52只裸鼠。依據(jù)接種細(xì)胞種類不同分為移植瘤GHR陽性表達(dá)和GHR陰性表達(dá)裸鼠，不同GHR表達(dá)的裸鼠進(jìn)一步分為對照組(C組：予0.9%NaCl，0.2 ml·d-1)、rhGH低劑量組(L組：予rhGH 0.5 U·kg-1·d-1)、rhGH高劑量組(H組：予rhGH 2.5 U·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥14 d，觀察并記錄各組裸鼠體重和腫瘤體積變化，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清VEGF含量。結(jié)果：SGC7901為GHR陽性表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株，MKN45為GHR陰性表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株。對于接種GHR陽性表達(dá)的人胃癌細(xì)

3、胞株的裸鼠，rhGH給藥組皮下移植瘤體積較對照組增大(P<0.05)，且H組促增長效應(yīng)顯著(P<0.05)，3組間體重差異不明顯(P>0.05);血清VEGF檢測，L組為(167.60±9.54 ) pg·ml-1，H組為(252.94±15.32 ) pg·ml-1，較C組(49.94±5.73) pg·ml-1升高(P<0.05);對于接種GHR陰性表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株的裸鼠，L組、H組體重均大于對照組(P<0.05)，而3組之間腫瘤體積大小、血清VEGF水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

4、。結(jié)論：rhGH能促進(jìn)GHR陽性表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC7901移植瘤生長，并促進(jìn)血清VEGF表達(dá)增高;對GHR陰性表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MKN45移植瘤沒有表現(xiàn)出明顯的促腫瘤生長及促血清VEGF表達(dá)效應(yīng)。GHR表達(dá)情況可能是rhGH影響血清VEGF分泌的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一?！娟P(guān)鍵詞】 重組人生長激素; 生長激素受體; 血管內(nèi)皮生長因子; 胃癌Effects of recombinant human growth hormone on tumor growth and serum VEGF concentration of human gastric carcinoma xenografts in nude

5、 miceCHENG Lu,LIN Yan,LI Suyi(School of Medicine,Southeast University,Nanjing 210009,China;Department of Oncology,the Second Affiliated Hospital to Nanjing Medical University,Nanjing 210011,China)Abstract Objective：To investigate the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on tumor growth

6、and serum VEGF levels of human gastric carcinoma xenografts in nude mice.Methods：Sixty male nude mice were bought for the experiment.Immunocytochemistry method was used to detect the expression of growth hormone receptor(GHR) in human gastric carcinoma cell lines SGC7901 and MKN45. Human gastric cel

7、l line SGC7901 with a positive expression of GHR and human gastric cell line MKN45 with a negative expression of GHR were injected subcutaneously into 4 nude mice respectively to create the subcutaneous xenografts models derived from human gastric carcinoma in nude mice.Three weeks later,the xenogra

8、fts were picked out to make homogenate.Then injected subcutaneously into the remaining 52 nude mice.According to the different types of the injected cells, the nude mice were divided into GHR positive group and GHR negative group,then divided into three experimental groups:control group(C group:0.9%

9、NaCl was given 0.2 ml·d-1), lowdose rhGH group(L group:rhGH was given 0.5 U·kg-1·d-1) ,and highdose rhGH group(H group:rhGH was given 2.5 U·kg-1·d-1),once a day for 14 days.The changes of body weight and tumor volume of nude mice in each group were recorded.The serum concent

10、rations of VEGF in peripheral blood were analyzed by ELISA.Results:We defined SGC7901 as GHR positive group and MKN45 as GHR negative one.For GHR positive groups,the tumor volumes were significantly larger in rhGH administration groups than in the C group(P<0.05),and the H group revealed greater

11、effect(P<0.05).No significant difference was found in body weight of the mude mice among the 3 groups(P>0.05).The serum VEGF concentrations of the L group and H group were (167.60±9.54) pg·ml-1 and (252.94±15.32) pg·ml-1 respectively, much higher than which of the C group,

12、with only (49.94±5.73) pg·ml-1(P<0.05);While for GHR negative groups, the body weights of the nude mice increased with the concentration of rhGH(P<0.5), but no obvious effect on tumor growth and serumVEGF secretion was observed(P>0.05).Conclusion：RhGH can promote the growth of tum

13、or,and increase the expression of serum VEGF in the SGC7901 xenograft tumor model in which GHR is highly expressed.But not for the MKN45 xenograft tumor model in which the expression of GHR is almost undetectable.Key words recombinant human growth hormone; growth hormone receptor; vascular endotheli

14、al growth factor; gastric carcinoma胃癌患者發(fā)生營養(yǎng)不良較為常見,治療應(yīng)以延長患者生存期、改善生活質(zhì)量為目標(biāo),不能僅僅針對腫瘤組織本身,應(yīng)重視代謝支持與調(diào)理的作用,從整體增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能,從而提高抗腫瘤治療療效。重組人生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH)在改善患者營養(yǎng)狀況、調(diào)節(jié)免疫功能方面存在優(yōu)勢。由于生長激素(growth hormone,GH)具有促細(xì)胞有絲分裂效應(yīng),理論上具有潛在的促腫瘤生長作用,故其能否用于惡性腫瘤患者的代謝調(diào)理仍有爭議。有報(bào)道1認(rèn)為,rhGH不僅可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,而且可能與腫瘤血管新

15、生有關(guān),但尚無明確的理論證據(jù)。生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)的存在,則是GH發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵2-3。本研究通過建立GHR差異表達(dá)的裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,給予不同劑量的rhGH干預(yù),了解動物體內(nèi)rhGH對腫瘤生長及血清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響。1 材料和方法1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物人低分化胃癌細(xì)胞株SGC7901和MKN45購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。BALBc,nunu,雄性裸鼠60只,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司,鼠齡45周,體重1416 g,無特定病

16、原體(SPF)條件下飼養(yǎng)。1.2 主要藥物和試劑注射用重組人生長激素rhGH(珍怡)為上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司產(chǎn)品。兔抗人GHR多克隆抗體,小鼠VEGF ELISA試劑盒,SABC免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 胃癌細(xì)胞的GHR表達(dá)檢測胃癌細(xì)胞株SGC7901和MKN45均在含10%胎牛血清的RPM1640、37 、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色測定SGC7901和MKN45的GHR表達(dá)情況。操作步驟按說明書進(jìn)行。細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)棕黃色或棕褐色并呈顆粒狀為陽性。高倍鏡下(×200)隨機(jī)選擇5個(gè)視野并分

17、別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,根據(jù)陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比,將免疫染色分級如下：陰性(-),染色細(xì)胞5%;弱陽性(+),染色細(xì)胞為6%25%;中等陽性(+),染色細(xì)胞為26%50%;強(qiáng)陽性(+),染色細(xì)胞51%。1.3.2 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的建立取處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞SGC7901和MKN45細(xì)胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液,臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)占95%以上。收集細(xì)胞,調(diào)節(jié)濃度為2×107個(gè)·ml-1,隨機(jī)選取4只裸鼠,右前肢腋下接種SGC7901細(xì)胞,0.2 ml·只-1,同法,再取4只,接種MKN45細(xì)胞。7 d后接種部位可觸及腫瘤組織,

18、3周后可見直徑1.52 cm腫塊。引頸處死裸鼠,皮膚消毒,無菌條件下于右前肢腋下取出瘤塊,置于有少許生理鹽水的培養(yǎng)皿中,去掉壞死組織,稱重,按瘤塊重量,每 1 g 腫瘤加入4 ml生理鹽水,于組織勻漿器中研磨,配成混懸液,濃度約為12×107個(gè)·ml-1,給26只實(shí)驗(yàn)裸鼠右前肢腋下接種SGC7901細(xì)胞的組織勻漿,0.2 ml·只-1,同法將MKN45細(xì)胞的組織勻漿接種于另26只裸鼠右前肢腋下。10 d后可見52只裸鼠右前肢腋下均形成直徑約0.5 cm的腫瘤。1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組與觀察指標(biāo)按接種胃癌細(xì)胞的類別不同,分別取24只接種SGC7901細(xì)胞的裸鼠和24只接

19、種MKN45細(xì)胞的裸鼠，隨機(jī)平均分為3組：L組注入rhGH 0.5 U·kg-1·d-1;H組注入rhGH 2.5 U·kg-1·d-1;C組(對照組)注入0.9%NaCl,0.2 ml·d-1。均予腹壁皮下注射,自腫瘤接種后第15至第28天,共14 d,每日觀察裸鼠的行動、對外界刺激的反應(yīng)、皮毛色澤及攝食情況。自第12至第30天,每3 d監(jiān)測裸鼠的體重和皮下移植瘤的生長情況并記錄,測量腫瘤長徑(A)和垂直橫徑(B),按公式V=A×B2/2計(jì)算腫瘤體積,描繪腫瘤體積增長曲線。停藥2 d后,每只裸鼠摘除眼球取血約0.3 ml,后處死裸鼠

20、,取皮下移植瘤,并仔細(xì)檢查其他臟器有無轉(zhuǎn)移。1.3.4 血清VEGF含量檢測將裸鼠眼球所取血液于室溫下靜置2 h,待血液凝固后,以3 000 r·min-1離心10 min,提取上層血清，于-80 凍存?zhèn)錂z，以ELISA試劑盒檢測各組血清中VEGF水平,方法參照說明書。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)處理軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)以x-±s表示,不同組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,配對設(shè)計(jì)的樣本均數(shù)比較用兩因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 胃癌細(xì)胞株GHR表達(dá)情況SGC7901細(xì)胞染為棕黃色,主要為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)著色,陽性細(xì)胞數(shù)約83%,

21、GHR呈強(qiáng)陽性表達(dá);MKN45細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)無明顯染色,陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)小于5%,GHR為陰性(圖1，見封三)。本實(shí)驗(yàn)以SGC7901和MKN45細(xì)胞作為GHR陽性和GHR陰性表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行研究。2.2 腫瘤體積和體重變化見圖2。接種GHR陽性和陰性表達(dá)細(xì)胞株的裸鼠第15天起予以rhGH藥物干預(yù)。給藥前3 d,GHR陽性和陰性表達(dá)的3組裸鼠之間體質(zhì)量和腫瘤體積變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),予以rhGH的裸鼠活動狀態(tài)和進(jìn)食量好于對照組。給藥后第3天起(接種后第18天),GHR陽性表達(dá)的裸鼠中L組、H組與對照組相比,皮下移植瘤體積增加明顯(P<0.05),L組與H組間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)

22、意義(P<0.05);3組間裸鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GHR陰性表達(dá)的裸鼠中L組、H組與對照組之間比較腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),給予rhGH干預(yù)組裸鼠的體重均較對照組增加(P<0.05),H組增幅明顯大于L組(P<0.05)。隨著腫瘤體積的增大,給藥的后半程,GHR陽性與陰性表達(dá)裸鼠體重增長速度均較前半程減緩。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動物,各組裸鼠肝臟、肺臟、胸腹腔均未見轉(zhuǎn)移病灶。2.3 血清VEGF水平GHR陽性表達(dá)裸鼠中,對照組血清VEGF水平為(49.94±5.73) pg·ml-1,L組為(167.60±9

23、.54) pg·ml-1,H組為(252.94±15.32) pg·ml-1,3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GHR陰性表達(dá)裸鼠中，對照組、L組和H組血清VEGF表達(dá)分別為(55.53±5.32) pg·ml-1、(57.33±7.35) pg·ml-1和(58.96±8.57) pg·ml-1,3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。3 討論rhGH具有直接的代謝調(diào)理作用,已作為一種促合成代謝藥物廣泛應(yīng)用于非腫瘤患者蛋白熱卡不足型營養(yǎng)不良的治療,可糾正手術(shù)及創(chuàng)傷后的負(fù)氮平衡狀

24、態(tài),能顯著改善患者的營養(yǎng)狀況,促進(jìn)胃腸道管壁細(xì)胞增殖和修復(fù)。上消化道惡性腫瘤患者常發(fā)生惡液質(zhì),癌性惡液質(zhì)的發(fā)生與腫瘤對氮的過量攝取密切相關(guān),而腫瘤患者需氮量可超過非腫瘤患者的50%100%。給予單純的腸內(nèi)、腸外營養(yǎng)支持治療并不能顯著逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤患者的高分解代謝狀態(tài),因此,許多學(xué)者試圖通過應(yīng)用rhGH的代謝調(diào)理和免疫調(diào)節(jié)作用來糾正負(fù)氮平衡,增強(qiáng)機(jī)體抵抗力,從而提高抗腫瘤治療療效,延長生存期。然而考慮到rhGH的間接促細(xì)胞生長增殖效應(yīng),大劑量使用是否會促進(jìn)腫瘤的生長,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,臨床研究資料仍存在分歧4-6。腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的的重要條件。腫瘤通過血管從宿主獲得豐富的營養(yǎng),并依賴它

25、向宿主輸出大量惡性細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤不斷生長和轉(zhuǎn)移,形成一個(gè)促血管生成循環(huán)7-8。腫瘤的血管生成與多種生長因子的刺激有關(guān),其中VEGF是最主要、最直接的血管生長因子之一,VEGF的表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度及有無轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)9。鑒于GHR是GH發(fā)揮作用的生理基礎(chǔ),體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,rhGH對GHR陽性表達(dá)的肝癌細(xì)胞具有明顯促增殖作用,但對于GHR陰性表達(dá)的肝癌細(xì)胞,由于缺少結(jié)合位點(diǎn),不存在rhGH發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的生理基礎(chǔ),故未發(fā)現(xiàn)rhGH有促其增殖的作用10-12。本實(shí)驗(yàn)通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色挑選出GHR陽性表達(dá)的SGC7901胃癌細(xì)胞株和GHR陰性表達(dá)的MKN45胃癌細(xì)胞株,構(gòu)建了不同GHR表達(dá)狀

26、態(tài)的皮下移植瘤模型,在裸鼠體內(nèi)觀察rhGH對腫瘤生長、營養(yǎng)狀況改善和VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥初期,rhGH治療組的所有裸鼠,活動狀態(tài)及飲水進(jìn)食量均較對照組為佳。說明rhGH確實(shí)能夠在一定程度上改善機(jī)體代謝狀態(tài)。但不同劑量的rhGH對不同GHR表達(dá)的裸鼠體重和皮下移植瘤大小的影響存在差異。對于GHR陽性表達(dá)的裸鼠,高、低劑量rhGH組的腫瘤生長速率明顯快于對照組,腫瘤體積大,說明rhGH對GHR陽性表達(dá)的腫瘤有較明顯的促生長作用,且高劑量組的促生長效應(yīng)更顯著;但三組裸鼠體重?cái)?shù)值相差無幾,且在給藥的后半程,rhGH治療組的裸鼠體重隨著腫瘤體積的逐步增大,增長速度逐漸減緩,最后高劑量rhG

27、H組裸鼠體重甚至低于低劑量rhGH組,可能與腫瘤增長過快增加了機(jī)體的消耗有關(guān)。對于GHR陰性表達(dá)的裸鼠,rhGH治療組和對照組腫瘤體積差異不顯著,主要是由于缺少GH作用于腫瘤組織的靶點(diǎn);而其他正常組織部位廣泛分布有GHR,rhGH促體重增長的效應(yīng)得以體現(xiàn),這與以往的研究結(jié)論相一致2。進(jìn)一步研究提示rhGH誘導(dǎo)VEGF分泌可能是通過GHR發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)13。臨床研究發(fā)現(xiàn)14，在腫瘤患者的血清及癌組織中VEGF的表達(dá)水平均異常增高，且兩者中VEGF變化具有高度一致性，顯示兩者存在正相關(guān)性，可以用血清VEGF水平來判斷癌組織中VEGF的表達(dá)情況，借此反映腫瘤血管的生長狀態(tài)，并且血清檢測方法具有微創(chuàng)、

28、操作簡便且能反復(fù)進(jìn)行等特點(diǎn)。有利于腫瘤臨床監(jiān)測和治療。本實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，腫瘤不斷生長分泌的VEGF不僅僅局限于腫瘤組織本身,大量的VEGF釋放入外周血,血清中也可以檢測到高水平的VEGF,且這種促VEGF表達(dá)的作用在GHR陽性表達(dá)的裸鼠中表現(xiàn)更為明顯,推測,GHR的存在極可能是rhGH影響VEGF分泌的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。由于腫瘤本身GHR表達(dá)量的不同,rhGH對腫瘤生長的影響不可一概而論：對于GHR陰性表達(dá)的腫瘤,缺少rhGH結(jié)合位點(diǎn),沒有顯著的促腫瘤生長效應(yīng);對于GHR陽性表達(dá)的腫瘤,除腫瘤體積增大外,還可促進(jìn)VEGF表達(dá)增多,存在促腫瘤生長及血行轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),臨床上使用需謹(jǐn)慎?？梢栽谑中g(shù)切除原發(fā)

29、腫瘤后,盡量短期、或同時(shí)與化療、抗血管生成治療聯(lián)合使用。關(guān)于GH與GHR結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及促VEGF分泌的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 de L A Torre N G,WASS J A,TURNER H E.Morphologic changes and molecular regulation of angiogenesis in pituitary adenomasJ.Front Horm Res,2004,32:133145.2 侍方方,李蘇宜.重組人生長激素聯(lián)合氟尿嘧啶對人胃癌裸小鼠皮下移植瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究J.臨床腫瘤學(xué)雜志,2006,11(6):443447.3

30、郭愛平,李蘇宜.重組人生長激素在體外對人胃癌細(xì)胞作用的研究J.東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2007,47(3):206209.4 CAO J,LUO S M,LIANG L,et al.Effects of parenteral nutrition without and with growth hormone on growth hormone/insulinlike growth factor1 axis after hepatectomy in hepatocellular carcinoma with liver cirrhosisJ.J Parenter Enteral Nutr,2007,31(6):496501.5 PERRYA J K, EMERALDA B S,HICHEM C M,et al.The oncogenic potential of growth hormoneJ.Growth Horm IGF Res,2006,16(56):277289.6 TACKE J, BOLDER U,HERRMANN A,et al.Longterm risk of gastrointestinal tumor recurrence after postoperative