dna連接反應(yīng)的影響因素提高平端連接效率的方法

1、DNA連接反應(yīng)的影響因素&提高平端連接效率的方法&外源和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)&平端連接接反應(yīng)1、 連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多 用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L， 作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過(guò)稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是 連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的

2、ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應(yīng)所必需的。2、 pH的影響：一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有實(shí)驗(yàn)表明，若把pH為7.5-8.0時(shí)的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時(shí)僅為全部活力的65%；當(dāng)體系偏酸（PH為6.9）時(shí)僅為全部活力的40%。3、 ATP濃度的影響：連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol /L，過(guò)濃會(huì)抑制反應(yīng)。例如，5mmol/L的ATP會(huì)完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報(bào)道，當(dāng)ATP的濃度為0.1mmol/L 時(shí)，去磷酸載體的自環(huán)比例

3、最大。由于ATP極易分解，所以當(dāng)連接反應(yīng)失敗時(shí)，除了DNA與酶的問(wèn)題外，還應(yīng)考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應(yīng)于 -20保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時(shí)最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長(zhǎng) 期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長(zhǎng)期保存），臨用時(shí)加入新配制的ATP母液。4、 連接溫度與時(shí)間的影響：因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過(guò)高會(huì)使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37。為了解決這一矛盾，在經(jīng) 過(guò)綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16，時(shí)間為4-16h?，F(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一般的黏性末端

4、來(lái)說(shuō)，20 30min就足以取得相當(dāng)好的連接效果，當(dāng)然如果時(shí)間充裕的話，20 60min能使連接反應(yīng)進(jìn)行得更完全一些。對(duì)于平末端是不用考慮氫鍵問(wèn)題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。5、 酶濃度的影響：日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時(shí)酶用量要比連接黏端大10-100倍。進(jìn)行黏末端連接時(shí)需先行稀釋，稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長(zhǎng)時(shí)間保持活力，也便于隨時(shí)取用。6、 DNA濃度的影響：要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物， DNA濃度不可過(guò)高，一般不會(huì)超過(guò)20nmol/L。要求線性化的連接產(chǎn)物， DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。在

5、用大質(zhì)粒載體進(jìn)行大片段克隆時(shí)，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，DNA濃度還應(yīng)降低，甚至是DNA的總濃 度低至幾個(gè)nmol/L。另?yè)?jù)研究，T4 DNA連接酶對(duì)DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時(shí)DNA濃度不應(yīng)低于1nmol/L。即應(yīng)具有2nmol/L的末端濃度。提高平端連接效率的方法：1、 低溫下長(zhǎng)時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好，平端連接需要過(guò)夜反應(yīng)。2、 在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來(lái)的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。足夠多的載體和插入片段是最重要的 。要看片段具體情況而言，有時(shí)載體和片段濃度過(guò)高，容易產(chǎn)生線性化產(chǎn)物，不利于環(huán)

6、化的。插入的DNA片段的摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的5-10倍，這個(gè)很關(guān)鍵。 載體通常50ng就夠了，若載體在10k左右，可用50100ng。3、 平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感，回收的時(shí)候多洗洗，加PEG和擴(kuò)大酶量，22度2小時(shí)后4C過(guò)夜。4、 盡可能縮小連接反應(yīng)的體積，最好不超過(guò)10微升，在5、6微升左右最佳。5、 建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好。（一）外源和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)外源片段和線狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價(jià)鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成個(gè)新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒已去磷酸化，則吸能形成個(gè)新的磷酸二酯

7、鏈。在這種情況 下產(chǎn)生的兩個(gè)雜交體分子帶有個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜本導(dǎo)入后可被修復(fù)。相鄰的'磷酸和'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌連接酶和噬菌體連接酶。實(shí)際上在有用途中，噬菌體連接酶都是首選的用酶。這是因?yàn)樵谙鲁练磻?yīng)條件下，它就能有效地將平端片段連接起來(lái)。一端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，其反應(yīng)速度完全由互相匹配的末端的濃度決定。不論末端位于同一分子（分子內(nèi) 連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡(jiǎn)單的情況，即連接混合物中只含有一種，也就是用可產(chǎn)生粘端的單個(gè)限制酶切割制備的磷 酸化載體。在瓜作用的底物。如

8、果反應(yīng)中濃度低，則配對(duì)的兩個(gè)末端同一分子的機(jī)會(huì)較大（因?yàn)榉肿拥囊粋€(gè)末端找到同一分子的另一末端 的概率要高于找到不同分子的末端的概率）。這倦，在濃度低時(shí)，質(zhì)粒重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應(yīng)中濃度有所增高，則在分子內(nèi) 連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個(gè)分子的末端碰到另一分子末端的可能性也有所增大。因此在濃度高時(shí)，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的 寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時(shí)參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第、期合刊）從理論上探討了濃度對(duì)連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡(jiǎn)而言之，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的 比取決于兩個(gè)參數(shù)：j和i。j是分子的一個(gè)末端在同一分子

9、的另一末端附近的有效濃度，j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的：沉吟液中的呈隨機(jī)卷 曲。這樣，j與分子的長(zhǎng)度成反比（因?yàn)樵介L(zhǎng)，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對(duì)給定長(zhǎng)度的分子來(lái)說(shuō)是一個(gè)常數(shù)，與 深度無(wú)關(guān)。j3/(3lb0)3/2其中l(wèi)是長(zhǎng)度，以cm計(jì)，b是隨機(jī)卷曲的區(qū)段的長(zhǎng)度。b的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移，而 后者可影響的剛度。i是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測(cè)量值，對(duì)于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里o是阿佛伽德羅常數(shù)，是 的摩爾濃度（單位：mol/L)。理論上，當(dāng)j=i時(shí)，給定分子的一個(gè)末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的

10、可能性相等。因而在 這樣的條件下，在反應(yīng)的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當(dāng)j>i時(shí)，有利于重新環(huán)化；當(dāng)i>j，則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖 1.9顯示了區(qū)段的大小與連接反應(yīng)混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時(shí)所需濃度之間關(guān)系（ugaiczyk等，1985）。 現(xiàn)在考慮如下的連接反應(yīng)混合物：其中除線狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源片段。對(duì)于一個(gè)給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組的效率不僅受反 應(yīng)中末端的絕對(duì)濃度影響， 而且還受質(zhì)粒和外源末端的相對(duì)濃度的影響。當(dāng)i是j的倍（即末端的絕對(duì)濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時(shí)） 外源末

11、端濃度的倍時(shí)，有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到最大。這些條什下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40都是由單體質(zhì)粒與外源所形成的嵌合體。當(dāng)連接混 合物中線瘃質(zhì)粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源的量遞增時(shí)，這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn)量。涉及帶粘端的線狀磷酸化質(zhì)粒的連接反應(yīng)應(yīng)包含：）足量的載體，以滿足j:i>1和j:i<3。對(duì)一個(gè)職pUC18一般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應(yīng)中應(yīng)含有載體為20-60g/ml。）未端濃度等于或稍高于載體的外源，如外源濃度比載體低得多，在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。 這種情況下，可考慮采用一些步驟來(lái)減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用

12、磷酸酶處理線狀質(zhì)?；虬l(fā)跡策略以便通過(guò)定向的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒。(二）粘端連接）用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒。通過(guò)酚：氯仿抽提和乙沉淀來(lái)純化，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。）按如下所述設(shè)立連接反應(yīng)混合物：a將0.1l載體轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量中，加等摩爾量的外源。b加水至7.5l，于45加溫分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到。c加入：10xT4噬菌體連接酶緩沖液 l噬菌體連接酶 0.1Weiss單位mmol/L ATP 1l于16溫育小時(shí)10xT4噬菌體連接酶緩沖液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50

13、mmol/K MgCl250mmol/L二硫蘇糖醇500g/ml牛血清白蛋白（組分.Sigma產(chǎn)品）（可用可不用）該緩訓(xùn)液應(yīng)分裝成小份，貯存于20。另外，再設(shè)立兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)，其中含有（）只有質(zhì)粒載體；（）只有外源片段。如果外源量不足，每個(gè)連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒 ，并盡可能多加外源，同時(shí)保持連接反應(yīng)體積不超過(guò)10l。可用至少種不同方法來(lái)測(cè)定噬菌體連接酶的活性。大多數(shù)制造廠商（除 New England Biolabs公司外）現(xiàn)在都用Weiss等，1968)對(duì)該酶進(jìn)行標(biāo)化。個(gè)Weiss單位是指在37下20分釧內(nèi)催化mmol32P從焦磷酸根 置換到,-32PATP所需酶時(shí)，個(gè)Weiss單位

14、相當(dāng)于0.2個(gè)用外切核酸酶耐受試驗(yàn)來(lái)定義的單位（Modrich和 Lehman,1970)或者60個(gè)粘端單位（如ew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015eiss單位的噬菌體連接酶在16下30分鐘內(nèi)可使50的噬菌體Hind片段 （5g）得以連接。在本書中，噬菌體連接酶一律用Weiss單位表示。par 目前提供的噬菌體連接酶均為濃溶液（1-5單位/l），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500g/ml牛血清白蛋白、50甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的噬體 連接酶于-20

15、保存?zhèn)€月可保持穩(wěn)定。）每個(gè)樣品各取l轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 （三）平端連接噬菌體連接酶不同于大腸桿菌連接酶，它可以催化平端片段的連接（Sgaramella和 Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于很容易成為平端，所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的 物性，才能使任何分子彼此相連。然而，相對(duì)而言，平端連接是低效反應(yīng)，它要求以下個(gè)條件：）低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。）不存在亞精胺一類的多胺。）極高濃度的連接酶（50Weiss單位ml）。）高濃度的平端。凝聚劑在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大

16、分子群聚作用并可導(dǎo)致分子凝聚成集體的物質(zhì)，如聚乙二醇（Pheiffer和 Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT arrison,1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端的總是 迎刃而解。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩作用：）它們可使平端的連接速率加大個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可使連接反應(yīng)在酶濃度不高的條件下進(jìn)行。）它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化（j:i=10）的濃度下，所有的產(chǎn)物也將是線狀多

17、聚體。par 在設(shè)立含凝聚劑的連接反應(yīng)時(shí)，下列資料可供參考。（）聚乙二醇（PEG8000）用去離子水配制的8000貯存液（40）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應(yīng)混合物之前應(yīng)將其融化并使其達(dá)到室溫。在含15PEG 8000的連接反應(yīng)混合物中，對(duì)連接反刺激效應(yīng)最為顯著。除PEG 800和噬菌體連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應(yīng)于混合，然后加適當(dāng)體積的PEG 8000（處于室溫），混勻，加酶后于20進(jìn)行溫育。）連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時(shí)對(duì)連接反應(yīng)的刺激效應(yīng)最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或gCl2濃度略有降低，都會(huì)嚴(yán)重降低刺激的強(qiáng)度（Pheiffe

18、r和Zimmerman,1983）。）濃度為15的PEG 8000可刺激帶粘端的分子的連接效率提高至原來(lái)的10-100倍，反應(yīng)的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。）PEG 8000可刺激短至個(gè)核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。（）氯化六氨合高鈷）氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20，它對(duì)連接反應(yīng)的刺激具有高度的濃度信賴性。當(dāng)連接反應(yīng)混合物中鹽深度為 1.0-1.5mol/L時(shí)，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來(lái)的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來(lái)的倍 （Rusche和Howard-Flanders,1985）。）在

19、單價(jià)陽(yáng)離子（30mmol/L KCl）存在下，它對(duì)平端連接仍有一定的刺激作用，但此時(shí)連接產(chǎn)物的分布有所改變。連接產(chǎn)物不再是清一色的分子間連接產(chǎn)物，相反，環(huán)狀將點(diǎn)盡優(yōu)勢(shì)。）與 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。 一、轉(zhuǎn)化由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化，早在1943年，Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無(wú)毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎 雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為， 再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰