標(biāo)書-ceRNA介導(dǎo)的miR-7SP1IGF-1R調(diào)控環(huán)路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機制

1、ceRNA介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路影響胃痛細(xì)胞惡性表型的研究機制中文摘要胃癌作為最常見的惡性腫病之一已嚴(yán)重威脅人們的健康，對其發(fā)生發(fā) 展的機制研究巳成為當(dāng)今腫瓶研究的熱點。近年來，競爭性內(nèi)源性*pethig endogenous RNA, ceRNA)在癌癥發(fā)生發(fā)展的的作用已日益被重視。我們通過預(yù) 實驗研究發(fā)現(xiàn)：Spl為miR-7的直接耙基因；IGF1R的3' UTR區(qū)存在miR7 的結(jié)合位點；胃痛細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染IGF_1R 3' UTR序列能明顯逆轉(zhuǎn)miR-7對Spl 的抑制作用。由此我們推出假說：IGF_1R 3' UTR作為競爭性內(nèi)源性RNA (

2、ceRNA),參與iniR_7/Spl/IGFlR調(diào)控環(huán)路。本課題擬以SGC7901胃痛細(xì)胞 為模型，以轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因回復(fù)等手段，全面分析ceRNA (IGF-1R 3' UTR) /miR-7/Spl/IGF-lR調(diào)控通路對胃痛表型的影響，從而為尋找胃痛的 治療配點提供依據(jù)。英文摘要(一)立項依據(jù)與研究內(nèi)容L項目的立項依據(jù)一、ceRNA在腫瘤中的作用腫瘤分子生物學(xué)的研究表明細(xì)胞癌變是多基因異常調(diào)控導(dǎo)致的結(jié)果，主要 的改變包括癌基因的活化和抗癌基因的失活?，F(xiàn)有的結(jié)果表明，胃癌癌變過程中 有多種基因的異常改變，但目前時胃癌癌變過程中基因變異的規(guī)律,特別是與胃癌 發(fā)生直接相關(guān)的

3、基因變化還不清楚。因此尋找胃癌疾病的易感基因是胃癌癌變機 理研究的熱點之一。近年來，競爭性內(nèi)源性*peting endogenous RNA, ceRNA)在癌癥發(fā)生發(fā)展的的作用已成為研究熱點：Pandolfi等1人認(rèn)為這種ceRNA活 性能形成一種大規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以擴(kuò)大人類基因組中的功能性遺傳信息。他們認(rèn)為這種活性通過miRNAs應(yīng)答元件(microRNAs response elements, MREs), 可以作為mRNAs轉(zhuǎn)錄假基因，以及長鏈非編碼RNAs相互“交流”的新語言， 此外ceRNA活性也在癌癥中扮演了重要角色，因此對于解開一些癌癥研究之謎 具有重要意義。Xia等人研究

4、表明在胃癌中存在著長鏈非編碼RNA和微小 RNA通過MREs而相互作用的網(wǎng)絡(luò)從而調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展。Liu等人證實 長鏈非編碼RNA HOTAIR作為ceRNA抑制胃癌的生長，侵襲并且促進(jìn)其凋亡。由此可見，越來越多的研究表明，ceRNA正H趨成為胃癌領(lǐng)域的研究熱點。ceRNA假說是一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，其核心內(nèi)容是具有相同MREs的mRNA、假基 因轉(zhuǎn)錄物、長鏈非編碼RNA等轉(zhuǎn)錄物通過競爭性結(jié)合同種miRNA來調(diào)控各自的表達(dá)水平， 從而影響細(xì)胞的功能。miRNA作為ceRNA假說的核心，而miRNA主要通過與轉(zhuǎn)錄物3,非翻 譯區(qū)-untranslated region, 歲-UTR)的M

5、RE互配對來沉默基因的表達(dá)，所以3，-UTR值得我 們重點關(guān)注。早在1993年，研究者就已發(fā)現(xiàn)過表達(dá)一些基因的3，-UTR會促進(jìn)細(xì)胞分化，究 其原因，相當(dāng)反式作用因子調(diào)控了細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。這一現(xiàn)象可以通過ceRNA 假說加以解釋：過表達(dá)的才-UTR與細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物具有相同的MRE,當(dāng)3，-UTR 表達(dá)上調(diào)時，它就會結(jié)合大量的本來能與這些分化相關(guān)基因mRNA結(jié)合的miRNA,從而解 除了對細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后抑制作用，結(jié)果促進(jìn)了細(xì)胞分化。引-UTR在此過程中發(fā)揮 了反式作用因子的作用?；谝陨侠碚摬浑y發(fā)現(xiàn)，ceRNA確實在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，W 此對ceRNA形

6、式和作用機制的進(jìn)一步研究將有助于拓展我們對腫瘤發(fā)病機理的 認(rèn)識，也有助于建立新的診治方法。二、腫病細(xì)胞的惡性表型與miRNA的研究微小RNA(microRNA, miRNA)是一組由基因組編碼的長度約2023個核昔酸的非編碼RNA,通過與耙基因的互補配對，降解相應(yīng)的mRNA和抑制翻譯，以負(fù)性調(diào)控耙基因的表達(dá)。大量研究已證實，每個miRNA可以有多個耙基因， 而幾個miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一個耙基因。miRNA及其耙基因種類繁多并且 數(shù)目巨大，廣泛參與到細(xì)胞信號的調(diào)節(jié)，近年發(fā)現(xiàn)50%以上的miRNA基因定位 于腫瘤相關(guān)的染色體座位或其脆性位點，直接或間接導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。大量的文獻(xiàn)報道證實mi

7、RNA對胃癌的發(fā)生發(fā)展同樣發(fā)揮著重要的作用。例 如，MiR-145, miR-133a和miR-133b能通過靶向抑制Spl的表達(dá)而調(diào)控胃癌細(xì) 胞的周期進(jìn)程6; MiR-22同樣也可以靶向抑制Spl的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞的 侵襲和轉(zhuǎn)移7; MiR-1271通過靶向抑制IGF1R的表達(dá)從而調(diào)控胃癌細(xì)胞的耐藥 性8。在前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)：MiR-7在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)并且與病人的預(yù)后相 關(guān)，在體外實驗中上調(diào)MiR-7的表達(dá)胃癌細(xì)胞的生長受到抑制（見工作基礎(chǔ)）。 提示MiR-7對胃癌的惡性表型有著重要的作用。三、ceRNA介導(dǎo)的miR7/SPVIGFlR調(diào)控環(huán)路影響胃痛細(xì)胞惡性衰型Spl屬于Sp/類K

8、rppel轉(zhuǎn)錄因子家族（Sp/KLF家族）是參與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄 的高度相關(guān)的鋅指蛋白，以細(xì)胞和啟動子特異性方式通過富含GC啟動子的基因 表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能如細(xì)胞增生、凋亡、分化和腫瘤形成，依功能不同可以 分為四部分：DNA結(jié)合區(qū)域、Spl的活化區(qū)、Btd盒以及Spl盒9, 10。Spl的 活化區(qū)可以形成四聚體，四聚體的形成是結(jié)合有Spl的DNA彎曲成環(huán)狀，從而 有利于遠(yuǎn)處的Spl的蛋白轉(zhuǎn)移到啟動子上，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。已形成的Spl四 聚體還能招募更多的四聚體與DNA環(huán)連接處相結(jié)合，對基因轉(zhuǎn)錄啟到正反饋調(diào) 控作用。而Btd盒以及Spl盒則可能參與到Spl轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。Spl蛋白在多種 腫瘤組織

9、中都有高表達(dá)10。Zhang等11人發(fā)現(xiàn)，在同一患者體內(nèi)，腫瘤組織中 的Spl表達(dá)水平顯著高于周圍正常組織；且與腫瘤的浸潤程度呈正相關(guān)。Spl過 表達(dá)的患者中位生存期顯著低于低表達(dá)或者不表達(dá)的Spl的胃癌患者，此外下調(diào)Spl的表達(dá)則顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長12。因此，目前Spl可以被認(rèn)為是一個 促癌蛋白。在前期研究中：我們通過體外實驗中上調(diào)MiR-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Spl 的表達(dá)受到明顯的抑制，隨后通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Spl 3，-UTR區(qū)存在 MiR-7的結(jié)合位點，最后我們用熒光素醴報告實驗證實了 Spl為MiR-7的直接 耙基因。腹島素樣生長因子1受體（IGF1R）是一跨膜受體，屬于受體酪氨

10、酸激誨，其 基因定位于染色體15q25-26,在核糖體中合成。IGF1R表達(dá)于多種類型的細(xì)胞 表面，可以促進(jìn)機體的蛋白質(zhì)和核酸DNA的合成以及碳水化合物的代謝。而且 它與細(xì)胞的生長分化、胚胎的發(fā)育密切相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)過度時，細(xì)胞則可以向惡 性表型轉(zhuǎn)化。目前在多種腫瘤中包括乳腺癌，結(jié)腸癌，小細(xì)胞肺癌都檢測到IGF1R 的表達(dá)異常。Li等13人發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IGF1R可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的血管生長從而促 進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長。我們通過體外實驗中上調(diào)MiR-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGF1R的表 達(dá)受到明顯的抑制，隨后通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IGF1R 3，-UTR區(qū)存在MiR-7 的結(jié)合位點，最后我們用熒光素酶報告實驗證

11、實了 IGF1R為MiR-7的直接耙基 因。此外,我們采用Chip M叩per（）數(shù)據(jù)庫在IGF1R的啟動子區(qū)的 保守序列中成功篩選Spl的潛在結(jié)合位點（圖），提示Spl也可能直接調(diào)控IGF1R 的轉(zhuǎn)錄。四、科學(xué)假說的內(nèi)容與意義基于上述理論以及前期相關(guān)研究工作，申請人提出擬解決的科學(xué)問題 “ceRNA介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機 制”。本研究擬構(gòu)建不同胃癌細(xì)胞系模型，初步探索ceRNA調(diào)控胃癌細(xì)胞惡 性表型的機制；（2）明確miR-7在胃癌在組織與胃癌周圍組織表達(dá)量，同時在不 同胃癌細(xì)胞系的進(jìn)一步驗證；（3）確立miR

12、-7與Spl和IGF1R之間的耙向調(diào)控關(guān) 系；(4)驗證胃癌細(xì)胞中Spl和IGF1R之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系；(5)探索Spl和IGF1R 3，-UTR介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控胃癌細(xì)胞惡性表型的影響；(6)確認(rèn) ceRNA在體內(nèi)的抑制成瘤作用。上述思路是建立在課題組成員多年來對胃癌發(fā) 生發(fā)展的機理探討的基礎(chǔ)上，結(jié)合國內(nèi)的研究進(jìn)展，在體外實驗中逐步驗證 ceRNA在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的作用。為探索ceRNA在胃癌發(fā)病機制中的調(diào)控作用 具有重要的意義，為尋求胃癌新的治療耙點奠定基礎(chǔ)。圖1科學(xué)假說示意圖1 . Salmena L, Poliseno L, Tay Y, Kats L, Pan

13、dolfi PP. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language?JCell.2011,146(3):353-8.2 . Xia T, Liao Q, Jiang X, et al. Long noncoding RNA *peting endogenous RNAs in gastric cancerJSci Rep.2014,4:6088.3 . Liu XH, Sun M, Nie FQ, et al. Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RN

14、A to regulate HER2 expression by sponging miR-331-3p in gastric cancerJMol Cancer.2014,13:92.4 . Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functionsJCell.2009,l 36(2):215-33.5 . Rastinejad E Blau HM. *plementation reveals a novel regulatory role for 3' untranslated regions in growt

15、h and differentiationJCell. 1993,72(6):903-17.6 . Qiu 1, Zhou X, Wang J, et al. MiR-145, miR-133a and miR-133b inhibit proliferation, migration, invasion and cell cycle progression via targeting transcription factor Spl in gastric cancerJFEBS Lett.2014,588(7):1168-77.7 . Guo MM, Hu LH, Wang YQ, et a

16、l. miR-22 is down-regulated in gastric cancer, and its overexpression inhibits cell migration and invasion via targeting transcription factor SplJMed Oncol.2013,30(2):542.8 . Yang M, Shan X, Zhou X, et aL niiR-1271 regulates cisplatin resistance of human gastric cancer cell lines by targeting IGF1R,

17、 IRS1, mTOR, and BCL2JAnticancer Agents Med Chem.2014,14(6):884-91.9 . Black AR, Black JD, Azizkhan-CIifford J. Spl and kruppel-like factor family of transcription factors in cell growth regulation and cancerJJ Cell Physiol.2001,188(2): 143-60.10 . Safe S, Abdelrahim M. Sp transcription factor famil

18、y and its role in cancerJEur J Cancer.2005,41(16):2438-48.11 . Zhang J, Zhu ZG, Ji J, et al. Transcription factor Spl expression in gastric cancer and its relationship to long-term prognosis J World J Gastroenterol.2005,11(15):2213-7.12 . Lou Z, O'Reilly S, Liang H, Maher VM, Sleight SD, McCormi

19、ck JJ. Down-regulation of overexpressed spl protein in human cell lines inhibits tumor formationJCancer Res.2005,65(3): 1007-17.13 . Li H, Adachi 丫 Yamamoto H, et al. Insulin-like growth factor-1 receptor blockade reduces tumor angiogenesis and enhances the effects of bevacizumab for a human gastric

20、 cancer cell line, MKN45JCancer.2011/117(14):3135-47.2.項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)、以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。(此部分為重點闡述內(nèi)容)*研究內(nèi)容第一部分 分析IGF-1R、miR-7、Spl在胃癌中的表達(dá)及ceRNA (IGF-1R3，UTR序列)、miR-7、 Spl對胃癌惡性表型的影響；1 .檢測正常胃粘膜上皮組織及胃癌組織中IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)(其中miR-7、Spl的表達(dá)檢測已完成）。2 .建立ceRNA （IGF-1R3PTR序列）、miR-7、Spl的不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞 模型。3 .在上述細(xì)胞模型中分析細(xì)胞增

21、殖、侵襲和遷移的生物學(xué)行為變化，RNA測序 分析篩選差異表達(dá)基因，檢測可能信號通路變化，初步確定胃癌發(fā)生發(fā)展中 IGF-1R3PTR序列、IGF-1R、m退-7、Spl對下游通路的影響。第二部分明確Spl是miR-7的直接作用耙點；1 .在miR-7不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞系中檢測Spl的mRNA及蛋白表達(dá)水平 （蛋白檢測已完成）。2 .克隆含有Spl 3，UTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素誨報告載體，通過熒光素語 報告基因?qū)嶒炞C實miR-7對Spl的直接調(diào)控。（預(yù)實驗已完成）。第三部分 明確ceRNA （IGF-1R3PTR序列）能作用競爭性結(jié)合miR-7從而降低miR-7對Spl的抑制作用。

22、1 .克隆含有IGF-1R 3PTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素磁報告載體，通過熒光 素醴報告基因?qū)嶒炞C實IGF-1R3PTR區(qū)與miR-7的直接結(jié)合效應(yīng)。2 .在IGF-1R 3PTR不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型中檢測Spl的蛋白及mRNA 水平。第四部分 驗證Spl對IGF-1R的調(diào)控；1 .在Spl不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞中檢測IGF-1R的蛋白及mRNA表達(dá)水平2 .染色體免疫沉淀技術(shù)（Chip）驗證Spl與IGF-1R啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點。3 .熒光素磁實驗進(jìn)一步確認(rèn)Chip驗證的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。第五部分 回復(fù)實驗探索ceRNA （IGF-1R3PTR序列）通過miR-7調(diào)控Spl進(jìn)而

23、影響IGF-1R表達(dá)形成環(huán)路對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過程的影響。1 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）高表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7模擬物提高miR-7的表達(dá),檢測Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對細(xì)胞惡性表型的影響。2 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）低表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7的siRNA,降低miR-7的表達(dá)，檢測Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對細(xì)胞惡性表型的影響。第六部分 體內(nèi)實驗證實IGF-1R3PTR序列/miR-7/Spl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路對胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。*研究目的本研究主要驗證在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中miR-7通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子

24、SP1,繼而調(diào)控下游 IGF-1R,而ceRNA （IGF-1R3ZUTR）能競爭性結(jié)合miR-7從而降低miR-7對Spl的抑制作用, 形成IGF-lR3，UTR/miR-力SPVIGF-1R調(diào)控環(huán)路，影響胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的過程以及 對下游通路的影響。本研究提出了 ceRNA介導(dǎo)的影響胃癌發(fā)生發(fā)展的新機制，為同癌的分 子生物學(xué)診斷、治療及預(yù)后提供了實驗基礎(chǔ)及臨床參考。*擬解決的關(guān)鍵問題1 .驗證胃癌發(fā)生發(fā)展過程中miR-SP1/IGF-1R通路中關(guān)鍵行點的相關(guān)性：本課題擬在組織樣本及體外實驗中分析通路中的關(guān)鍵節(jié)點IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)檢測，以及體外細(xì)胞實驗中干涉和過表

25、達(dá)這些關(guān)鍵節(jié)點的干預(yù)性處理 及相應(yīng)表型的檢測。2 .驗證胃癌中miR-7對Spl的耙向調(diào)控關(guān)系，Spl對IGF-1R的調(diào)控關(guān)系:本課題擬用RNA干涉技術(shù)與熒光素醴報告質(zhì)粒實驗進(jìn)行miRNA耙基因調(diào) 控的研究。3驗證ceRNA （IGF-1R3PTR序列）能競爭性結(jié)合miR-7從而降低miR-7對Spl 的抑制作用：本課題擬建立ceRNA （IGF-1R3PTR序列）不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型。在上述細(xì)胞模型中分析Spl的表達(dá)以及細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生 物學(xué)行為變化。4. RNA測序分析篩選差異表達(dá)基因，檢測可能信號通路變化，初步確定胃癌發(fā) 生發(fā)展中IGF-1R3PTR、IGF-1R, miR

26、-7、Spl對下游通路的影響3.擬采取的研究方案及可行性分析。*技術(shù)路線（見國2）圖2研究技術(shù)路線*詳細(xì)研究方案第一部分 分析IGF-1R、miR-7、Spl在胃癌中的表達(dá)及ceRNA （IGF-1R3'UTR序列）、miR-7、 Spl對胃癌惡性表型的影響；1 .檢測正常胃粘膜上皮組織及胃癌組織中IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)（其中 miR-7、Spl的表達(dá)檢測已完成）。已收集臨床獲得家屬或病人同意后手術(shù)切除的15例胃癌組織。另外收集10例獲 得家屬同意后在胃穿孔術(shù)中取得的正常胃粘膜上皮組織作為陰性對照。Realtime PCR檢測組織中miR-7的表達(dá)，Westemblot

27、檢測IGF-1R及Spl的表達(dá)。Real-time PCR: Ambion mirVanaTM miRNA （Ambion 公司）提取試劑盒抽提總 miRNA, ND 1000 （NanoDrop Technologies）測定總 miRNA 濃度和純度。73OOHT 熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時行熒光定量，檢測目的基因 （hsa-miR-181b）和內(nèi)參基因（U6）在不同濃度稀釋樣本中的擴(kuò)增情況，選擇當(dāng) 反應(yīng)達(dá)到域值時，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù)均位于15-30個循環(huán)之間的樣 本濃度為最佳稀釋濃度，反應(yīng)結(jié)束后分析PCR反應(yīng)曲線，得到Ct值，即熒光達(dá) 域值所需的PCR循環(huán)數(shù)，隨后在

28、ABI 7300 System SDS Software 1軟件上 分析，查看每個基因的擴(kuò)增情況，記錄相應(yīng)的Q值。計算方法：以U6rRNA為陽 性對照基因來校正PCR模板的細(xì)胞拷貝數(shù)（目標(biāo)基因AQ值=目標(biāo)基因Q值-同 一樣本U6ct值），消除組間的加樣量誤差，重復(fù)三次。目標(biāo)組的ACt平均值減去 其對照組的ACt平均值得到每個目的基因相對循環(huán)數(shù)（Ct值），即AACt目標(biāo)基 因二處理組ACt目標(biāo)基因-對照組口目標(biāo)基因，基因相對表達(dá)量采用2 -AACt 方法計算。Western blot： RIPA裂解液裂解，冰上消化15min,離心取上清并行BCA法定量，20卜1 1上樣量進(jìn)行電泳。

29、ECL顯色，GAPDH為內(nèi)參。2 .建立ceRNA （IGF-1R3PTR序列）、miR-7、Spl的不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞 模型。細(xì)胞培養(yǎng)：SGC7901胃癌體外細(xì)胞系課題組實驗室長期保存，生長狀態(tài)良好。10%熱滅活FBS,4 mM 谷氨酰胺,50U/ml青霉素和50.g/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，37, 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：分別合成針對IGF-1R3PTR、miR-7、SP1、IGF-1R的干擾 和過表達(dá)的OligoDNA,與經(jīng) MluI和Clal誨切后和帶有EGFP的pLVTHM 載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。篩選陽性克隆，測序。溶于除菌 的TE中，保

30、證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.82.0之間，DNA濃度在500 ng（ 1以上。分別轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞。3 .在上述細(xì)胞模型中分析細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生物學(xué)行為變化，RNA測序 分析篩選差異表達(dá)基因，檢測可能信號通路變化，初步確定胃癌發(fā)生發(fā)展中 IGF-1R3PTR序列、IGF-1R、miR-7、Spl對下游通路的影響。笫二部分明確Spl是miR-7的直接作用耙點；1 .在miR-7不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞系中檢測Spl的mRNA及蛋白表達(dá)水平 （蛋白檢測已完成）。PCR檢測Spl的mRNA表達(dá)，westernblot檢測Spl的蛋白水平表達(dá)，具體方法 同上。2 .克隆含有Sp

31、l 3PTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素誨報告載體，通過熒光素施 報告基因?qū)嶒炞C實miR-7對Spl的直接調(diào)控。（預(yù)實驗已完成）。熒光素陳報告實驗：克隆含有SP1 3' UTR miR-7結(jié)合“種子序列”的熒光素誨 報告載體，通過熒光紊酶報告實驗驗證miR-7對SP1的直接調(diào)控。1）目的片段的獲得：PCR擴(kuò)增構(gòu)建的DNA序列中的3' UTR序列，克隆至 pGL-Basic報告基因質(zhì)粒（pGL-UTR），測序驗證?；瘜W(xué)合成的miR-181b duplexes 與對照miRNAduplexes由上海吉瑪公司完成。2）熒光素酶報告載體構(gòu)建：提取總RNA, RT-PCR擴(kuò)增SP13&#

32、39; UTR結(jié)合區(qū)域, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收。采用上海生工生物工程公司pGEM-T Easy載體進(jìn)行TA 克隆。目的基因與載體的摩爾比約為3: 1, lOXLigase Buffer 1回，純化的目的 基因 5Ong,載體 pGEM-T Easy 約 50 ng, T4DN A Ligase lul, ddH2O 補齊至 10 回，16連接過夜，Sall磁切鑒定。pGL-3質(zhì)粒載體的Xbal誨切處理，1%瓊脂 糖凝膠電泳，回收純化線性質(zhì)粒DNA,溶于適量TE中。目的基因與E.coliDH5 “表達(dá)載體的連接，使用限制性內(nèi)切誨Sall酶切鑒定構(gòu)建質(zhì)粒：將含有插入片段 的重組質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pGL

33、-UTR。由大連寶生物公司完成測序工作。3）脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將熒光素霜報導(dǎo)質(zhì)粒（pGL-UTR或?qū)φ誴GL-Basic）與化學(xué) 合成的 miRNAduplexes （hsa- miR- 181b duplexes 或?qū)φ?miRNAduplexes）轉(zhuǎn)染 細(xì)70%匯合的HEK293細(xì)胞,48小時后應(yīng)用Promega公司的luciferase assays Kit 檢測熒光素活性，間接反映miR-7與耙標(biāo)蛋白SP1的作用關(guān)系；提取瞬時共轉(zhuǎn) 染48小時的HEK293細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR及Western blot的方法檢測耙標(biāo)蛋白編 碼基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。笫三部分 明確ceRNA （IGF

34、1R3，UTR序列）能作用競爭性結(jié)合miR-7從而降 低miR7對Spl的抑制作用。1 .克隆含有IGF-1R 3PTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素酶報告載體，通過熒光素藤報告基因?qū)嶒炞C實IGF-1R3PTR區(qū)與miR-7的直接結(jié)合效應(yīng)。熒光素報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-7與IGF-1R3PTR結(jié)合，具體方法同上。2 .在IGF-1R 3PTR不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型中檢測Spl的蛋白及mRNA 水平。SGC7901胃癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染IGF-1R3PTR片段，提高IGF-1R 3，UTR序列在細(xì) 胞中的表達(dá)，PCR檢測Spl的mRNA表達(dá)，westernblot檢測Spl的蛋白水平表 達(dá)，具體方法

35、同上。笫四部分驗證Spl對IGF_1R的調(diào)控；1 .在Spl不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞中檢測IGF-1R的蛋白及mRNA表達(dá)水平。 構(gòu)建Spl的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入SGC7901胃癌細(xì)胞系提高Spl的表達(dá)，PCR檢測 IGF-1R的mRNA表達(dá),westernblot檢測IGF-1R的蛋白水平表達(dá)，具體方法同 上。2 .染色體免疫沉淀技術(shù)(Chip)驗證Spl與IGF-1R啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位 點。染色體免疫沉淀技術(shù)(Chip):1)體外交聯(lián)和細(xì)胞的裂解:：取各種處理的細(xì)胞2X107, 37%福爾馬林體外交 聯(lián)10分鐘,冰預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞后裂解液(l.l%Triton X-100, 1.2 mM

36、EDTA, 167 mM NaCl, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.01% SDS, protease inhibitors)裂解后離心。 50W、2分鐘超聲打斷基因組DNA。3 ) Protein G Agarose分離：應(yīng)用免疫沉淀級抗體(SP1)和Protein G Agarose分離，抗體-妥白-基因組DNA復(fù)合物用懸浮緩沖室溫懸浮(1% SDS, 0.1 M NaHCO3） 20 分鐘。3000-5000 g 離心 1 分鐘。3）純化基因組DNA:通過溶解（8p I 5M NaCk 65° C, 4-5 hours）和反交聯(lián) （0.5M EDTA,

37、 8p 1 IM Tris-HCk Ija 1 Proteinase K, 45° C, 1-2 hours.）釋放并用離心柱純化基因組DNA。4） PCR擴(kuò)增目的片斷：根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測與IGF-1R啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 部位分別設(shè)計PCR引物，PCR法擴(kuò)增目的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，應(yīng)用2.5-4%瓊 脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物染色體免疫沉淀技術(shù)（Chip）:驗證SP1與IGF-1R啟動子 區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點。3.熒光素誨實驗進(jìn)一步確認(rèn)Chip驗證的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。（具體方法同上）笫五部分 回復(fù)實驗探索ceRNA （IGF1R3，UTR序列）通過miR-7調(diào)控Spl進(jìn) 而影響IGF-1R表達(dá)形

38、成環(huán)路對胃痛細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過程的影響；1 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）高表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7模擬物 提高miR-7的表達(dá)，檢測Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對細(xì)胞惡性表型的影響。2 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）低表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7的 siRNA,降低miR-7的表達(dá)，檢測Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對細(xì)胞惡性表 型的影響。第六部分體內(nèi)實驗證實IGF-1R3，UTR序列/miR7/Spl/IGFlR調(diào)控環(huán)路對胃 痛發(fā)生發(fā)展的作用。在動物實驗中單獨或聯(lián)合干預(yù)IGF-lR3，UTR/miR-7/Spl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路的關(guān)

39、鍵 位點，觀察腫瘤生長變化。以胃癌細(xì)胞SGC7901皮下成瘤裸鼠模型為研究對象，隨即分空白對照組、陰性對照組、ceRNA （IGF-1R 3PTR）治療組、多點聯(lián)合干預(yù)組進(jìn)行治療，定期監(jiān)測SGC7901細(xì)胞在裸鼠皮下生長情況，實驗結(jié)束后處死動物取腫瘤組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。本課題組已成功建立SGC7901皮下成瘤裸鼠模型（圖3）圖3裸鼠皮下成瘤模型*可行性分析本課題是在國內(nèi)外研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合申請人課題組近年來在胃癌研究領(lǐng)域中的工作而 提出。前期研究表明：miR-7在胄癌中低表達(dá)：Spl為miR-7的靶點；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), ceRNA （IGF-1R3，UTR序列）與miR-7能特異性

40、結(jié)合；IGF-1R為Spl的下游信號分子。綜上所 述，考慮到ceRNA（IGF-IRS/UTR序列）、miR-7、Spl在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題“ceRNA 介導(dǎo)的miR刁SP1/IGF-1R調(diào)控環(huán)路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機制”理論上可行。本課題使用的的研究手段包括：細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、Western Blot檢測、定量PCR、染色體免疫沉淀技術(shù)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、熒光素酶報告基因、細(xì)胞生物學(xué)行為評價、動物模型制作等均為經(jīng)典方法，并有申請人課題組多年實踐基礎(chǔ)。使我們了解ceRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及作為治療耙標(biāo)的可能 性。課題組成員結(jié)構(gòu)合理，其中大部分為具有一定的分子生物

41、學(xué)研究背景，并具有充足課題統(tǒng)籌經(jīng)驗的教授作為總體指導(dǎo)。團(tuán)隊成員都具有豐富的胃癌研究經(jīng) 驗，已完成多項相關(guān)課題并在國內(nèi)外雜志發(fā)表相關(guān)論文多篇。4.本項目的特色與創(chuàng)新之處* ceRNA是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點，課題組整合了具有系統(tǒng)性的miRNA研 究與ceRNA研究兩方面，首次提出T ceRNA介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控環(huán) 路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機制，從單純研究胃癌中的miRNA的功能與耙 基因的驗證，深入到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)路和ceRNA的相應(yīng)功能的研究方面，深入解析 了 ceRNA對miRNA功能的相互關(guān)系以及對胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的影響，立體 新穎，內(nèi)容翔實。*信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控

42、、競爭性抑制是本課題的研究核心，包括構(gòu)建ceRNA（IGF-lR3' UTR） 序列以及熒光素酶報告基因等前沿技術(shù)的應(yīng)用到門癌的發(fā)生發(fā)展過程中miR-77SPVlGF-lR調(diào) 控環(huán)路的研究中來，尋找機遇miR-7SPVlGF-lR調(diào)控環(huán)路及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的胃癌靶向 治療的新方案，以建立全新的臨床腫瘤診斷、治療、監(jiān)測及評價體系5.年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合 作與交流計劃等）* *年度研究計劃* *完成第一部分中胃粘膜上皮組織及出癌組織中IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)檢測；不同表 達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型的構(gòu)建；IGF-1R3' UTR

43、、miR-7、Spl及IGF-1R對細(xì) 胞增殖、侵襲、遷移細(xì)胞生物學(xué)行為變化的影響。寫出相關(guān)論文投稿。* *完成第二部分中miR-7對Spl的靶向調(diào)控驗證及第四部分中Spl對IGF-1R調(diào)控關(guān)系驗證。* *完成第三部分中IGF-1R3' UTR競爭性結(jié)合miR-7提升Spl細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的檢測。* *完成第五部分回復(fù)性驗證，在ceRNA （IGF-1R3* UTR序歹/）不同表達(dá)狀態(tài)的的同癌細(xì)胞 模型中檢測miR-7、Spl、IGF-1R等表達(dá)變化，驗證此調(diào)控環(huán)路。* *完成第六部分體內(nèi)實驗驗證IGF-1R3' UTR/miR-7Spl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路對竹癌腫瘤發(fā)生發(fā) 展

44、過程的影響。* *整理和分析數(shù)據(jù)，全面匯總實驗結(jié)果。撰寫論文國內(nèi)外投稿，提交成果鑒定，撰寫結(jié)題 報告。針對課題中的興趣點進(jìn)行后續(xù)實驗。在課題進(jìn)行期間，隨時掌握本課題相關(guān)內(nèi)容的進(jìn)展，必要時對課題內(nèi)容進(jìn)行合理修改。*預(yù)期成果及技術(shù)目標(biāo)明確IGF-1R3，UTR區(qū)、miR-7及Spl在胃癌中的表達(dá)及對其表型的影響，探討三者之間的調(diào) 控環(huán)路關(guān)系，在此基礎(chǔ)上開發(fā)胃癌靶向治療新思路。本課題完成后提供成果鑒定。預(yù)期在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表研究論文2-4篇,其中SCI收錄1-2篇，培養(yǎng)研究生數(shù)名。（二）研究基礎(chǔ)及工作條件一、iniRNA相關(guān)研究：申請者課題組團(tuán)隊在miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的 作用及機制研究

45、中積累了豐富的經(jīng)驗：（1）我們發(fā)現(xiàn)，miR-135a/b能通過靶向 MCL1 （圖4）逆轉(zhuǎn)肺癌A549/CDDP細(xì)胞對順銷的耐藥性（圖5）; （2） miR-503 能夠通過耙向BCL2 （圖6）逆轉(zhuǎn)肺癌A549/CDDP細(xì)胞對順銷的耐藥性（圖7）;（3） miR-145、miR-133a/b 抑制 SGC7901、BCG823 和 MKN45 胃癌細(xì)胞株的惡 性表型。圖4MCL1為m退-135a/b的靶基因4XU al&ic*ti-ian az©Al務(wù)，iwie圖5轉(zhuǎn)染miR-135a/b后增加了 A549/CDDP細(xì)胞對順銷誘導(dǎo)凋亡的敏感性。圖6 Bcl2為miR-503

46、的耙基因meHNA rwmle oootrcM圖7轉(zhuǎn)染miR-503后增加了 A549/CDDP細(xì)胞對順銷誘導(dǎo)凋亡的敏感性。圖 8miR-145、miR-133a/b 抑制 SGC7901、BCG823 和 MKN45 胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。（三）本課題研究的前期工作關(guān)于miR7耙向調(diào)控Spl的研究：在胃癌細(xì)胞SGC7901中，上調(diào)miR-7的表達(dá)能顯著抑制Spl的蛋白水平;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Spl為miR-7潛在靶基因;我們通過熒光素醴報告基因?qū)嶒炞C實，Spl為miR-7的直接靶基因（圖9）?？?miR-NC圖9 Westernblot及熒光素蹲報告基因?qū)嶒炞C實Spl為miR-7的兜基因。

47、關(guān)于IGF1R3，UTR逆轉(zhuǎn)miR-7對Spl的抑制作用的相關(guān)研究:在高表達(dá)miR-7 餓胃癌細(xì)胞SGC7901中，轉(zhuǎn)染IGF-1R3PTR序列升高其在細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Spl的蛋白水平有所回升（圖10）。圖1。轉(zhuǎn)染ceRNA（IGF-lR3，UTR序列）升高其在細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Spl的蛋白水平有所回升。Spl與IGFUR表達(dá)相關(guān)性研究：在胃癌細(xì)胞SGC7901中，下調(diào)Spl的表達(dá),IGF-1R的表達(dá)水平亦下降（圖11）。圖11在SGC7901中，下調(diào)Spl的表達(dá)，IGF-1R的表達(dá)水平亦下降以上這些前期研究結(jié)果，為本課題的實施提供了扎實的理論依據(jù)，為本項目 的順利完成提供了最有力的實驗保證。2 .工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑, 包括利用國家實驗室、國家重點實驗室和部門開放實驗室等研究基地的計劃與落 實情況）申請者及課題組所在科室為江蘇省醫(yī)學(xué)重點實驗室（臨床生物學(xué)診斷和治 療實