基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素

1、基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素的工藝一，背景知識1, 基因工程科技名詞定義 中文名稱：基因工程 英文名稱： genetic engineering;gene engineering 其他名稱：重組脫氧核糖核酸技術(shù) （recombinant DNA technique） 定義1 :狹義的基因工程僅指用體外重組DNA技術(shù)去獲得新的重組基因；廣義的基因工程則指按人們意愿設(shè)計，通過改造基因或基因組而改變生物的遺傳特性。如用重組DNA技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達，使大腸桿菌能夠生產(chǎn)人所需要的產(chǎn)品；將外源基因轉(zhuǎn)入動物，構(gòu)建具有新遺傳特性的轉(zhuǎn) 基因動物；用基因敲除手段，獲得有遺傳缺陷的動物等。定

2、義2 :將在體外進行修飾、改造的脫氧核糖核酸分子導入受體細胞中進行復制和表達的技術(shù)。 擴充：基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。一個完整的、用于生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：（1 ）外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。這一部分的工作是整個基因工程的基礎(chǔ)，因此又稱為基因工程的上游部 分；（2）適合轉(zhuǎn)移、表達載體的構(gòu)建或目標基因的表達調(diào)控結(jié)構(gòu)重組；（3）外源基因的導入；（4）外源基

3、因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選；（5）外源基因表達產(chǎn)物的生理功能的核實；（6）轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立，以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析；（7）生態(tài)與進化安全保障機制的建立；（8 ）消費安全評價?；静僮鞑襟E（上游技術(shù)）提取目的基因獲取目的基因是實施基因工程的第一步。如植物的抗?。共《究辜毦┗颍N子的貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因干擾素基因等，都是目的基因。要從浩瀚的 基因海洋”中獲得特定的目的基因，是十分不易的?？茖W家們經(jīng)過不懈地探索，想岀了許 多辦法，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。直接分離基因最常用的方法是鳥槍法

4、”又叫散彈射擊法”鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體， 然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA （即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細胞的 基因含有不表達的DNA片段，一般使用人工合成的方法。目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成

5、互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測岀相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對的原則，推測岀它的基因的核苷 酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通 過人工合成基因的方法獲得。目的基因與運載體結(jié)合基因表達載體的構(gòu)建（即目的基因與運載體結(jié)合）是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。將目的基因與運載體結(jié)合的過程，實際上是不同來源的 DNA重新組合的過程。如果以質(zhì)粒作為運載體，首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒岀現(xiàn)一個缺口，露岀黏性末端。然后用同一種限制酶切斷

6、目的基 因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端（部分限制性內(nèi)切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。將切下的目的基因的片段插入質(zhì)粒的切口處，首先堿基互補配對結(jié)合，兩個黏性末端吻合在一起，堿基之間形成氫鍵，再加入 適量DNA連接酶，催化兩條 DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來，形成一 個重組DNA分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子結(jié)合，形成重組DNA分子（也叫重組質(zhì)粒）的。將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞是實施基因工程的第三步。目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重 組DNA分子后，下一步是將重組 DNA分子引入受體細胞中進行擴增?；蚬?/p>

7、程中常用的受體細胞有大腸桿菌，枯草桿菌，土壤農(nóng)桿菌，酵母菌和動植物細胞等。用人工方法使體外重組的 DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。例如， 如果運載體是質(zhì)粒，受體細胞是細菌，一般是將細菌用氯化鈣處理，以增大細菌細胞壁的通透性，使含有 目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。目的基因?qū)胧荏w細胞后，就可以隨著受體細胞的繁殖而復制，由于 細菌的繁殖速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。目的基因的檢測和表達目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這 是基因工程的第四步工作。以上步驟完成后，在全部的受體細胞中，真正能夠攝入

8、重組DNA分子的受體細胞是很少的。因此, 必須通過一定的手段對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測。檢測的方法有很多種，例如，大腸桿菌 的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細胞后， 就可以根據(jù)受體細胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因。重組DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。2， 糖尿病糖尿病（diabetes ）是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各 種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等

9、一系 列代謝紊亂綜合征。臨床上以高血糖為主要特點，典型病例可岀現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即三多一少”癥狀，糖尿病（血糖）一旦控制不好會引發(fā)并發(fā)癥，導致腎、眼、足等部位的衰竭病變，嚴重者會 造成尿毒癥。糖尿病人應(yīng)常煮紫芝水喝，來控制血糖，預(yù)防并發(fā)癥。3， 胰島素科技名詞定義中文名稱：胰島素英文名稱：insulin定義：胰腺朗格漢斯小島所分泌的蛋白質(zhì)激素。由A、B鏈組成，共含51個氨基酸殘基。能增強細胞對葡萄糖的攝取利用，對蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝有促進合成的作用。性質(zhì)K英文Insulin顯微鏡下的胰島beta細胞化學本質(zhì)蛋白質(zhì)分子式C257 H383 N65 077 S6分子量5807.69性狀白

10、色或類白色的結(jié)晶粉末熔點233 'C (分解)比旋度-64 ° ±(C=2,0.003mol/L NaOH)溶解性在水、乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶；在礦酸(無機酸)或氫氧化堿溶液中易溶酸堿性兩性，等電點 pl5.35-5.45結(jié)構(gòu)不同種族動物(人、牛、羊、豬等)的胰島素功能大體相同，成分稍有差異。圖中為人胰島素化學結(jié)構(gòu)。胰島素由A、B兩個肽鏈組成。人胰島素(Insulin Human)A 鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種 30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的 巰基形成兩個二

11、硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外 A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。品種按來源不同分類1、 動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基 酸不同，牛胰島素中有 3個氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體。2、 半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰 島素。3、生物合成人胰島素(現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素)：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。功能胰島素能促進全身組織對葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原分 解和糖原異生，因此，胰島

12、素有降低血糖的作用。促進肌肉、脂肪組織等處的靶細胞細胞膜載體將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運入細胞。通過共價修飾增強磷酸二酯酶活性、降低CAMP水平、升高cGMP濃度，從而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。通過激活丙酮酸脫氫酶磷酸酶而使丙酮酸脫氫酶激活，加速丙酮酸氧化為乙酰輔酶A，加快糖的有氧氧化。通過抑制PEP羧激酶的合成以及減少糖異生的原料，抑制糖異生。抑制脂肪組織內(nèi)的激素敏感性脂肪酶，減緩脂肪動員，使組織利用葡萄糖增加。二，基因工程大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素的步驟1，提取目的基因本工藝的目勺基因采用人工合成的方法，以目勺基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈

13、DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。具體的操作步驟如下：取材：人胰腺 細胞試劑：DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，異丙醇，無水乙醇，0.050.1 % DEPC - H2O，75 %乙醇，TE緩沖液，瓊脂糖。提取方法：TRIzol抽提法(異硫氰酸胍/酚TRNzol總RNA提取試劑)TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA 可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中

14、間層的 DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化 DNA對于樣品間標準化 RNA的產(chǎn)量十分有用操作步驟詳解：(1 )，獲取所有的mRNA。a .樣品處理：A :培養(yǎng)細胞：收獲細胞1-5 X 10 7，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol ，混勻，室溫靜置 5min。 B :組織：取50-100mg組織(新鮮或-70 °C及液氮中保存的組織均可)置 1.5ml離心管中，加入 1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置5 min。b .加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。c.4 C 離心，12000g X 15min ，取上清。d .加入0.5ml異丙醇，將管中

15、液體輕輕混勻，室溫靜置10min。e .4 C 離心，12000g X 10min ，棄上清。f .加入1ml 75% 乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 C ， 7500g X 5min，棄上清。g.晾干，加入適量的 DEPC H 2 O 溶解(65 C促溶10-15min )(2) ，mRNA的分離。方法：分離的總 RNA可利用mRNA3 '端含有poly(A)的特點，用oligo(dT)纖維素柱分離，當 RNA 流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐 漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經(jīng)過兩次o

16、ligo (dT)纖維素柱，可得到較純的 mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70 C可保存一年以上。試劑：1X 柱層析加樣緩沖液：20mmol/L Tris.Cl, pH7.6; 0.5mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA, pH8.0;0.1%SDS.滅菌洗脫緩沖液：10mmol/L Tris.Cl, pH7.6; 1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.05%SDS.步驟：A. 用 1ml O.1mol/L NaOH 懸浮 500mg oligo(dT)纖維素. 用 1ml 0.1mol/L NaOH 懸浮 500mg | oligo(dT)纖維素.B. 將懸浮液裝

17、入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌喊玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積的滅菌水沖洗柱床。|C. 用1X柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，知道流出液的pH值小于8.0。D. 將提取的總RNA液于65 'C溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2X柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1X柱層析加樣溶液。E. 測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入23倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。F. 測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。G. 加入1/10體積的3mol/L NaAC

18、(pH5.2)、2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20 C放置30分鐘。H. 4 C下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4 C下12000g離心5分鐘。I. 小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。J. 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70 C中)。(3) ，分離目的mRNA。將RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳9 J RNA樣品23 H上樣液輕輕混勻，上樣電泳：120伏，1020分鐘注意：電泳槽的清潔及新的電泳液！瓊脂糖凝膠要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結(jié)果(4) ，逆轉(zhuǎn)錄。以mRNA為模板的DNA聚合酶，形

19、成與 RNA堿基相互補DNA鏈，后者稱為互補 DNA cDNA。RNAaseH 的活性：切掉 DNA和RNA雜合鏈上的 RNA。(5) ，PCR 擴增。在一微量離心管中依次加入下列試劑：cDNA4 J10 PCR buffer (含 MgCI2 )5 JdNTPs (10mmol/L)1 口5'引物(10hol/L)1 M3'引物(10hol/L)去離子水(補足反應(yīng)體系)Taq DNA pol. (2U/ J)輕彈管底混合(用離心機甩一下)1 »39 414PCR儀設(shè)定的反應(yīng)條件：94 ° C 45 SDNA 變性55 ° C 45 SDNA 復性72 ° C 1 min 產(chǎn)物鏈延伸25-30 個循環(huán)后 72 ° C 10min2,目的基因與運載體結(jié)合載體：pBR322工具酶：BamH I、T4DNA 連接酶。操作步驟詳解：首先，用 BamH I酶來切pBR322以產(chǎn)生這個酶的特異性黏性末端。同時用 pBR322酶切割外源DNA使其產(chǎn)生同樣