等溫滴定量熱法在生命科學(xué)研究中應(yīng)用

1、等溫滴定量熱法在生命科學(xué)研究中應(yīng)用0等溫滴定量熱法 （Isothermal Titration Calorimetry, ITC） 是近年來發(fā)展起來的一種研究生物 熱力學(xué)與生物動力學(xué)的重要方法， 它通過高靈敏度、 高自動化的微量量熱儀連續(xù)、 準(zhǔn)確地監(jiān) 測和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息。 微量熱法具有許多獨(dú)特之處。 它對被研究體系的溶劑性質(zhì)、 光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何 限制條件，即具有非特異性的獨(dú)特優(yōu)勢，樣品用量小，方法靈敏度和精確度高（本儀器最小可檢測熱功率 2 nW ，最小可檢測熱效應(yīng) 0.125uJ ，生物樣品最小用量 0.4ug ，溫度范

2、圍 2 0C - 80 0C ，滴定池體積 1.43 ml） 。實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短 （典型的 ITC 實(shí)驗(yàn)只需 30-60 分鐘，并 加上幾分鐘的響應(yīng)時(shí)間 ），操作簡單 （整個(gè)實(shí)驗(yàn)由計(jì)算機(jī)控制，使用者只需輸入實(shí)驗(yàn)的參數(shù)， 如溫度、注射次數(shù)、注射量等，計(jì)算機(jī)就可以完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，再由 Origin 軟件分析 ITC 得 到的數(shù)據(jù) ）。測量時(shí)不需要制成透明清澈的溶液, 而且量熱實(shí)驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析。 盡管微量熱法缺乏特異性但由于生物體系本身具有特異性， 因此這種 非特異性方法有時(shí)可以得到用特異方法得不到的結(jié)果， 這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律， 特別 適應(yīng)于研究生物體系中的各種特異過

3、程。ITC 的用途 獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、摩爾結(jié)合焓、 摩爾 結(jié)合熵、摩爾恒壓熱容，和動力學(xué)參數(shù) （如酶活力、酶促反應(yīng)米氏常數(shù)和酶轉(zhuǎn)換數(shù)）。ITC 的應(yīng)用范圍蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用 （包括抗原 - 抗體相互作用和分子伴侶 -底物相互作用 ）；蛋白質(zhì)折疊 / 去折疊；蛋白質(zhì) - 小分子相互作用以及酶 -抑制劑相互作用；酶促反應(yīng)動力學(xué)；藥物 -DNA/RN A 相互作用； RNA 折疊；蛋白質(zhì) - 核酸相互作用；核酸 - 小分子相互作用；核酸 - 核酸相互作 用；生物分子-細(xì)胞相互作用；加樣體積：（實(shí)際體積）cell: 1.43 ml, syringe

4、: 300 口1準(zhǔn)備樣品體積（最少量）cell: 2 ml , syringe : 500 口1樣品濃度cell :幾十到幾mMsyringe :幾百 M到幾十 mM測量 Kb 范圍 102-1012M-1滴定實(shí)驗(yàn)前恒溫 30-60 min 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間，一般 1.5-4 hr 微量熱技術(shù) （Microcalorimetry） （2008-05-27 19:58:14）標(biāo)簽：雜談微量熱法（包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱）是近年來發(fā)展起來的一可研究生物熱力學(xué)與生物動力學(xué)的重要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)和準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄一變化過程的量熱曲線，原位（in s

5、itu）、在線（on-line）和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息。微量熱法具有以下特點(diǎn)：1它不干擾蛋白質(zhì)和核酸的生理功能，具有非特異性的獨(dú)特優(yōu)勢，即對被研究蛋白質(zhì)和核酸 體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件。2樣品用量小，方法靈敏度高，測量時(shí)不需要制成透明清澈的溶液。3量熱實(shí)驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析。4微量熱法缺乏特異性。但由于蛋白質(zhì)和核酸本身具有特異性，因此'種非特異性方法有時(shí)可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律。微量熱法在生物大分子研究中的應(yīng)用主要有：1酶促反應(yīng)2.蛋白質(zhì)去折疊/折疊3抗原-抗體相互作用4分子伴侶-底物相

6、互作用5藥物-核酸相互作用等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry ， ITC）實(shí)驗(yàn)是通過滴定反應(yīng)物到含有反應(yīng)所必須的另一反應(yīng)物的樣品溶液中。每次滴定后，反應(yīng)熱放出或吸收，這些都可以被ITC所檢測到。檢測到的熱效應(yīng)的熱力學(xué)分析提供了結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定量特征，可以直接測量與常溫下發(fā)生的反應(yīng)過程相關(guān)的能量學(xué)參數(shù)。1 ITC的特點(diǎn)ITC能測量到的熱效應(yīng)最低可達(dá) 125 nJ,最小可檢測熱功率 2 nW,生物樣品最小用量 0.4卩 g,而且這些年來ITC的靈敏度得到了提高，降低了響應(yīng)時(shí)間（小于 10 s）o ITC不需要固定或改變反應(yīng)物，因?yàn)榻Y(jié)合熱的產(chǎn)生

7、是自發(fā)的。獲得物質(zhì)相互作用完整的熱力學(xué)數(shù)據(jù)包括結(jié)合常數(shù) 恒壓熱容（厶Cp）和動力學(xué)數(shù)據(jù)（如酶促反應(yīng)的 ITC也比那些選擇分析方式（如分析型超速離心法,（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）,結(jié)合焓（ H）、Km 和 Oat）。AUC、快，一個(gè)單純的 AUC實(shí)驗(yàn)需要幾個(gè)小時(shí)甚至幾天去完成，而典型的ITC實(shí)驗(yàn)只需3060分鐘，在加上幾分鐘的響應(yīng)時(shí)間。整個(gè)實(shí)驗(yàn)有計(jì)算機(jī)控制，使用者只需輸入實(shí)驗(yàn)的參數(shù)（溫度、注射次數(shù)、注射量等）計(jì)算機(jī) 就可以完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，再由Origin軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù)。其精確度高以及操作簡單。ITC獲取的結(jié)果示意圖上圖：峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時(shí)釋放或吸收的總熱量。F圖：以產(chǎn)生或

8、吸收的總熱量為縱坐標(biāo)，以加入杯中的兩反應(yīng)物之摩爾比為橫坐標(biāo)作圖，可 得整個(gè)反應(yīng)過程的結(jié)合等溫曲線。2 ITC的應(yīng)用1）蛋白質(zhì)-小分子和酶-抑制物相互作用；2）蛋白質(zhì)-糖類相互作用；3） 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：如 Jacobson等用ITC研究了人細(xì)胞 RNA聚合酶n轉(zhuǎn)錄因子 TFIID 的最大亞單位 TAFII250 的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性 （Jacobson et al., 2000）。日本Kanagawa科學(xué)技術(shù)研究所的 Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了 AML1/Runx-1小結(jié)構(gòu) 域識別的DNA結(jié)構(gòu)及CBF B控制的構(gòu)象調(diào)整，闡明了 CBF B與CBF a間的相互作用模

9、式 及前者調(diào)控后者結(jié)合到 DNA上的機(jī)制（Tahirov, et al., 2001）。3）蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用；4）脂質(zhì)間以及脂質(zhì)-小分子相互作用；5）核酸-小分子相互作用；6）蛋白質(zhì)-核酸相互作用；7）核酸-核酸相互作用；8） 抗體研究：美國Johns Hopkins大學(xué)生物系的生物量熱學(xué)中心是-.丨世界上從事生物量熱學(xué)最活躍和處于領(lǐng)先水平的實(shí)驗(yàn)室，該中心的Freire小組（Murphy et al., 1993, 1995）應(yīng)用高靈敏度ITC分別研究了血管緊縮素與其單克隆抗體和酸誘導(dǎo)去折疊細(xì)胞色素c與其單克隆抗體的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)合過程均為焓和熵同時(shí)驅(qū)動的反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些過程中溶

10、劑釋放所導(dǎo)致的熵增過量補(bǔ)償了因結(jié)合而引起的構(gòu)象熵的損失。9）受體相互作用；10） 蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性：如美國的Wright小組應(yīng)用ITC和核磁共振（NMR）等技術(shù)研究了核激素受體蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域與甲狀腺素及類纖維素A受體相互作用的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)雖然分開的結(jié)構(gòu)域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅(qū)動的，并以一種獨(dú)特的協(xié)同折疊的機(jī)制形成螺旋異二聚體。11） 酶分析：女口 Freire小組應(yīng)用等溫滴定微量熱法 （ITC）結(jié)合高靈敏度差示掃描量熱法（DSC）和分光光度法研究了酵母細(xì)胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物一亞鐵細(xì)胞色素c的熱力學(xué)和動力學(xué)，并分析了原鹽效應(yīng)對該酶活性的影響。我們應(yīng)用等溫微

11、量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應(yīng)體系，獲得了這些酶促反應(yīng)的各種熱力學(xué)和動力學(xué)信息，探討了相關(guān)催化機(jī)理，同時(shí)用該法研究了博萊霉素催化切割DNA的反應(yīng)，從熱力學(xué)和動力學(xué)的角度嚴(yán)格地證明了博萊霉素在催化機(jī)制上類似于DNA切割酶，但其催化效率低于 DNA切割酶，并用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時(shí)肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)的熱力學(xué)，從熱力學(xué)的觀點(diǎn)確定了該酶促反應(yīng)為快速平衡的隨機(jī)順序反應(yīng)，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法一微量熱測活法。值得指出的是，ITC不僅被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)折疊/去折疊，而且被應(yīng)用于核酸折疊，例如英國的Hammann等人利用IT

12、C研究了鎂離子誘導(dǎo)錘頭狀核酶折疊的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)鎂離子與天然序列核酶的結(jié)合是一個(gè)強(qiáng)烈的放熱反應(yīng)，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結(jié)合有很大的區(qū)別，這些工作對于核酸折疊的熱力學(xué)研究是良好的開端。ITC應(yīng)用示例1 ITC法測量結(jié)合/解離常數(shù)Christian Herrmann等運(yùn)用ITC研究了 Ras與效應(yīng)物和 Cdc42與效應(yīng)物的相互作用。Ras是一種在 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的蛋白質(zhì)?？梢韵蚱湎掠蔚脑S多 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑輸送細(xì)胞內(nèi)調(diào)控信號。Ras在非激活態(tài)，與 GDP結(jié)合，當(dāng)GDP被GTP取代時(shí)被激活，與其效 應(yīng)物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈現(xiàn) 蟲緊密的結(jié)合。Cdc42是一種

13、 GTPase,也 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 相關(guān)的蛋白。它參與細(xì)胞增殖調(diào)控和肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控。Cdc42在參與細(xì)胞骨架調(diào)控的過程中，很重要的一步是與WASP蛋白的相互作用。Ras及其效應(yīng)物（Raf，RalGDS）的結(jié)合方式都很類似，包括富含親水氨基酸側(cè)鏈的反平行？折疊。Cdc42及其效應(yīng)物（WASP）的結(jié)合區(qū)則富含疏水氨基酸，其復(fù)合物也比Ras/效應(yīng)物復(fù)合物大得多。ITC可以直接測量焓變 H，結(jié)合常數(shù)Ka,而不對反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團(tuán)， 因此測得的結(jié)果更加可信。圖18-7實(shí)驗(yàn)結(jié)果：20 C時(shí)GCN4-D和GCN4-M與AP-1的滴定反應(yīng)和擬合曲線 GCN4-D 滴定 AP-1 ; （b）

14、 GCN-M 滴定 AP-1這里是以獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)模型進(jìn)行最小二乘法擬合計(jì)算出了結(jié)合常數(shù)Kb、結(jié)合焓變 H0和結(jié)合計(jì)量數(shù)N等值（結(jié)果見表18-1、2）。研究結(jié)果：ITC測定的反應(yīng)熱既包含結(jié)合反應(yīng)又包含折疊反應(yīng)。肽與DNA結(jié)合過程伴隨著肽的構(gòu)象折疊和疏水表面包埋。肽的構(gòu)象中熵的損失對熵變的不利貢獻(xiàn)大于溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的有利貢獻(xiàn)， 由于包埋疏水表面時(shí)所引起的結(jié)合水的損失對熵變產(chǎn)生有利貢獻(xiàn)，因此肽與DNA結(jié)合過程中總的熵變對結(jié)合是不利的。產(chǎn)生熵變的因素有：1）疏水作用產(chǎn)生的有利貢獻(xiàn)；2）肽與DNA形成復(fù)合物由于轉(zhuǎn)動和平移自由度的減小引起的熵?fù)p失；3）結(jié)合過程中肽與 DNA的折疊或其他構(gòu)象變化產(chǎn)生的不利貢獻(xiàn)

15、。表18-1 GCN4-D與AP-1和CRE結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)AP-1181.04 ±052.25 ±25-84.2 仕7-35.4 0.3-48.8 10200.98 ±033.26 0.12-87.0 仕8-36.5 0.1-50.5 09220.98 ±033.61 0.28-89.6 生2-37.0 02-52.6 仕4251.09 ±070.73 0.10-94.2 殳9-33.6 0.4-60.7 4.3CRE181.03 ±042.64 0.40-74.5 生4-35.8 0.3-38.7 仕7201.05 ±0

16、57.10 0.61-77.6 仕9-38.4 02-39.2 仕1220.99 ±026.45 0.80-80.3 仕8-38.4 0.3-41.9 仕1251.08 ±036.99 0.25-84.6 2.5-39.0 0.1-45.6 26表18-2 GCN4-D與AP-1和CRE結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)151.94 0.053.36 住15-34.8 0.7-30.5 0.1-4.3 0.8181.98 0.032.20 住09-36.8 0.3-29.8 0.1-7.0 0.4AP-1202.01 0.051.50 住30-39.2 0.4-29.5 0.5-9.7 0.

17、9221.96 0.032.08 住18-40.5 0.6-30.0 02-10.5 0.8251.99 0.051.28 住31-43.8 仕4-29.0 0.6-14.8 2.0152.02 0.042.64 住18-33.4 仕4-29.9 02-3.5 仕6182.04 0.033.75 住23-35.9 0.4-31.0 仕1-4.9 0.5CRE202.05 0.043.21 住40-38.2 0.8-30.9 0.3-7.3 仕1221.99 0.023.09 住31-40.1 0.8-31.0 02-10.1 1.0252.04 0.042.14 住22-44.6 仕8-30.4 0.3-14.2 2.1GCN4和GCN4 M與AP 1和CRE反應(yīng)是焓驅(qū)動的。熵變對反應(yīng)不利，而負(fù)的焓變補(bǔ)償 了不利的熵變。與熵的變化類似，反應(yīng)自由能也包含肽鏈折疊所引起的總的自由能的變化和 結(jié)合反應(yīng)自由能的變化。結(jié)合作用對自由能變化的貢獻(xiàn)主要來自于肽與DNA間形成的氫鍵作用、van der waals作用以及靜電作用等。3其它應(yīng)用美國的Todd小組提出了用功率補(bǔ)償型 ITC測定酶動力學(xué)參數(shù)