植物學(xué)實驗基本技能

1、普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和使用一、顯微鏡構(gòu)造顯微鏡由機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成（圖1-1）。光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造(圖1-1)1. 物鏡轉(zhuǎn)換器 2. 接物鏡 3.游標(biāo)卡尺 4.載物臺 5.聚光器 6. 彩虹光闌 7.光源 8. 鏡座 9. 電源開關(guān) 10. 光源滑動變阻器 11. 粗調(diào)螺旋 12. 微調(diào)螺旋 13. 鏡臂 14.鏡筒 15.目鏡 16.標(biāo)本移動螺旋1機械裝置鏡座（base）和鏡臂（arm）鏡座位于顯微鏡底部，呈馬蹄形，它支持全鏡。鏡臂有固定式和活動式兩種，活動式的鏡臂可改變角度。鏡臂支持鏡筒。鏡筒（body tube）是由金屬制成的圓筒，上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器。鏡筒有單筒和雙筒兩種，單

2、筒又可分為直立式和后傾式兩種。而雙筒則都是傾斜式的，傾斜式鏡筒傾斜45°。雙筒中的一個目鏡有屈光度調(diào)節(jié)裝置，以備在兩眼視力不同的情況下調(diào)節(jié)使用。轉(zhuǎn)換器（no sepiece）為兩個金屬碟所合成的一個轉(zhuǎn)盤，其上裝34個物鏡，可使每個物鏡通過鏡筒與目鏡構(gòu)成一個放大系統(tǒng)。載物臺（stage）又稱鏡臺，為方形或圓形的盤，用以載放被檢物體，中心有一個通光孔。在載物臺上有的裝有兩個金屬壓夾稱標(biāo)本夾，用以固定標(biāo)本；有的裝有標(biāo)本推動器，將標(biāo)本固定后，能向前后左右推動。有的推動器上還有刻度，能確定標(biāo)本的位置，便于找到變換的視野。調(diào)焦裝置 是調(diào)節(jié)物鏡和標(biāo)本間距離的機件，有粗動螺旋（coarse adju

3、stment）即粗調(diào)節(jié)器和微動螺旋（fine adjustment）即細(xì)調(diào)節(jié)器，利用它們使鏡筒或鏡臺上下移動，當(dāng)物體在物鏡和目鏡焦點上時，則得到清晰的圖像。2光學(xué)系統(tǒng)物鏡（objective）物鏡安裝在鏡筒下端的轉(zhuǎn)換器上，因接近被觀察的物體，故又稱接物鏡。其作用是將物體作第一次放大，是決定成像質(zhì)量和分辨能力的重要部件。物鏡上通常標(biāo)有數(shù)值孔徑、放大倍數(shù)、鏡筒長度、焦距等主要參數(shù)。如：NA030；10×；160/017；16mm。其中“NA030”表示數(shù)值孔徑（numerical aperture，簡寫為NA），“10×”表示放大倍數(shù)，“160/017”分別表示鏡筒長度和所需蓋

4、玻片厚度（mm），16mm表示焦距。目鏡（ocular lens）裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡組成。 鏡把物鏡造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般標(biāo)有7×、10×、15×等放大倍數(shù)，可根據(jù)需要選用。一般可按與物鏡放大倍數(shù)的乘積為物鏡數(shù)值孔徑的500700倍，最大也不能超過1000倍的選擇。目鏡的放大倍數(shù)過大，反而影響觀察效果。聚光器（condenser）光源射出的光線通過聚光器匯聚成光錐照射標(biāo)本，增強照明度和造成適宜的光錐角度，提高物鏡的分辨力。聚光器由聚光鏡和虹彩光圈（iris diaphragm）組成，聚光鏡由透鏡組成，其數(shù)值孔徑可大于1，當(dāng)使用大于1的聚光鏡

5、時，需在聚光鏡和載玻片之間加香柏油，否則只能達(dá)到10。虹彩光圈由簿金屬片組成，中心形成圓孔，推動把手可隨意調(diào)整透進光的強弱。調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，可得到適當(dāng)?shù)墓庹蘸颓逦膱D像。光源（light source）較新式的顯微鏡其光源通常是安裝在顯微鏡的鏡座內(nèi)，通過按鈕開關(guān)來控制；老式的顯微鏡大多是采用附著在鏡臂上的反光鏡，反光鏡是一個兩面鏡子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍鏡觀察時，用平面反光鏡；使用油鏡或光線弱時可用凹面反光鏡。濾光片（filter）可見光是各種顏色的光組成的，不同顏色的光線波長不同。如只需某一波長的光線時，就要用濾光片。選用適當(dāng)?shù)臑V光片，可以提高分辨力，

6、增加影像的反差和清晰度。濾光片有紫、青、藍(lán)、綠、黃、橙、紅等各種顏色的，分別透過不同波長的可見光，可根據(jù)標(biāo)本本身的顏色，在聚光器下加相應(yīng)的濾光片。3油鏡物鏡的基本原理微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，4045×）和油鏡（18 mm，95100×）三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大10002 000多倍。從圖-3中可看出油鏡的焦距和工作距離（標(biāo)本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈

7、則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=152，與玻璃相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度（圖1-2）。(圖1-1)利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上

8、玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：NAn·sin式中 NA=數(shù)值孔徑；n=介質(zhì)折射率；=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖-5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。同時，的理論限度為90°，sin90°=1，故以空氣為介質(zhì)時（n=1），數(shù)值孔徑不能超過1，如以香柏油為介質(zhì)時，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入射角為120°，其半數(shù)的正弦為sin60°=087，則：以空氣為介質(zhì)時：NA=1×087=087以水為介質(zhì)時：NA=133×087=115

9、以香柏油為介質(zhì)時：NA=152×087=132顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來。因此，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨距離，這兩個因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表示的。式中=光波波長。我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L度為055m，假如數(shù)值孔徑為065的高倍物鏡，它能辨別兩點之間的距離為042m。而在042m以下的兩

10、點之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。例如用數(shù)值孔徑為125的油鏡時，能辨別兩點之間的因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=065），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有042m。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=125），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出022m間的距離。二、顯微鏡使用步驟1觀察前的準(zhǔn)備（1）顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運到實驗桌上。（2） 將顯微

11、鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。（3） 調(diào)節(jié)光照:不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，光線較強的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡，使視野的光照達(dá)到最明亮最均勻為止。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強弱。凡檢查染色標(biāo)本時，光線應(yīng)強；檢查未染色標(biāo)本時，光線不宜太強。可通過擴大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。2.低倍鏡觀察鏡檢

12、任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣。因為低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將標(biāo)本片放置在載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢下降載物臺，直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。3.高倍鏡觀察在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在轉(zhuǎn)換物鏡時要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，慢慢下降載物臺直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至

13、物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察,并準(zhǔn)備用油鏡觀察。4油鏡觀察（1）用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。（2）在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。（3）從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。（4）從接目鏡內(nèi)觀察，進一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。5. 觀察完后復(fù)原下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦

14、鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇混合液擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，（注意向一個方向擦拭）。將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再將載物臺下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，最后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。6.注意事項1.學(xué)生使用顯微鏡固定鏡號、位置，填寫使用卡，本學(xué)期一直使用本臺顯微鏡。2.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞3.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。4.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗

15、調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。5.觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。 6.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 徒手切片的制作一、實驗材料及器材的準(zhǔn)備1、鋒利的刀片。2、潔凈的載玻片、蓋玻片。3、盛清水的培養(yǎng)皿。4、毛筆、鑷子等。二、實驗材料的處理1、軟硬適中、便于手持的材料，一般截成小塊（長23cm，切片斷面不超過35mm2）。2、過于柔嫩的器官，可選用胡蘿卜根或土豆塊莖作為夾持物。夾持物截成規(guī)范的小塊，再用刀從一端的中線縱向劈開（不要劈到底），以夾住材料。如新鮮蠶豆葉片，切去葉柄、葉尖和葉緣后，

16、切成長度和寬度都小于夾持物劈縫的長方塊，再放入夾持物劈縫中。3、有些葉片可以卷成圓筒再進行切片。三、握夾持物和持刀用左手的拇指和食指捏緊夾有葉片的夾持物，并使其劈縫與自己本身平行，拇指要稍低于食指，以免被刀割破。夾持物上端要略握夾持物和持刀低于食指，以免被刀割破。夾持物上端要略高于手指，但勿過高，以防切割時夾持物和刀搖動。右手拿刀將刀片平穩(wěn)地放在左手食指上，與材料切面平行。四、拉切這是切片的關(guān)鍵階段。沾水的刀口保持水平對著夾持物,自左前方向右后方，以均勻、快捷的動作，斜著向后進行連續(xù)拉切。切時用臂力而不用腕力。如此循環(huán)多次，切下許多薄片后，把切下的薄片，迅速用毛筆刷入清水中備用。五、制片用毛筆

17、挑選透明的薄片，制臨時裝片。六、注意事項實驗器材的準(zhǔn)備1、在切片前，要不斷地用水濕潤材料和刀片。2、夾持物上端要保持表面平整。3、切片時，雙手應(yīng)該保持活動狀態(tài)，不要使它們緊靠身體或?qū)嶒炁_。4、用力不要過猛，不能用刀片擠壓材料或來回切割材料。5、動作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形狀的完整。速度要快，才能切得又薄又平。臨時裝片法植物學(xué)實驗中常需借助顯微鏡來觀察、研究一些新鮮植物材料的細(xì)胞、組織和器官的微細(xì)結(jié)構(gòu)。對于這些只要求臨時觀察的內(nèi)容，通常是先以徒手切片法將這些植物材料切成薄片，再用臨時裝片標(biāo)本法制成臨時裝片，以便在顯微鏡下觀察。而對于一些小的或扁平的材料（如單細(xì)胞、絲狀或葉狀的藻類、

18、菌類、蕨類的原葉體和孢子囊、纖細(xì)的苔蘚植物等等），則可以直接制成臨時玻片標(biāo)本加以貫徹。以上方法的使用，既簡單又快捷，同時可以保持材料的生活狀態(tài)和天 然的色彩。  1. 清潔玻片將載玻片和蓋玻片用清水洗凈，再用紗布擦干。擦玻片時用左手食指和拇指夾住玻片的兩邊，右手食指和拇指包住紗布，同時擦到的玻片的兩面，用力要均勻。    注意：蓋玻片薄脆易碎，擦拭時要特別小心，用力要輕而均勻。2. 放置材料將載玻片平放在桌面上，中央加一滴蒸餾水或稀甘油，然后用鑷子鑷取或吸管吸取少量植物材料，放在水滴或甘油中，再用鑷子和解剖針將材料小心的展平或分散開，避免材料折

19、疊或干燥。  3. 蓋片大拇指和食指拿著蓋玻片的兩個角或用鑷子夾住其一端，使蓋玻片的一邊先與載玻片上的水滴邊緣接觸 ，而后徐徐放下另一邊，當(dāng)蓋玻片被夾持的一邊將貼近載玻片時，則可放手或抽出鑷子，使其自然輕輕復(fù)蓋，這樣可以擠出蓋玻片下的空氣，避免產(chǎn)生氣泡。     注意：載玻片中央的液滴量要適中，使其恰好充滿蓋玻片下方。蓋玻片的上面及載玻片的其他區(qū)域必須保持干燥。液滴量如果不夠，易產(chǎn)生氣泡，可用吸管小心地從蓋玻片的邊上再滴入一小滴水，使它和蓋玻片下面的水相接觸；如果水太多，溢出蓋玻片，會使蓋玻片浮動或從蓋片下外溢，此時可用吸水紙吸去。  4. 染

20、色如需染色，臨時水裝片做好后直接在蓋玻片的一側(cè)加一滴染液，用吸水紙條在蓋玻片的另一側(cè)吸水，引入染液，靜置片刻，以使蓋片下的材料均勻著色。5. 鏡檢注意：用以臨時觀察，不欲久留的裝片均可用水封片，制成水裝片；需要提前半天或一天就備出的裝片或者觀察后須保留一定時間的裝片，則適宜制成甘油裝片，以防止水分蒸發(fā)，出現(xiàn)材料收縮現(xiàn)象。用甘油封片時，保留時間短者，可用10%甘油水溶液，保留時間長者則須從10%甘油中再轉(zhuǎn)入50%甘油水溶液中，或浸后再轉(zhuǎn)入純甘油中封片。甘油裝片的不僅可使封片保留較長的時間，且有加強材料透明的作用。如裝片效果理想，也可根據(jù)需要選擇適宜的染料染色，制成永久制片或用某些化學(xué)試劑作組織化

21、學(xué)反應(yīng)。植物學(xué)繪圖方法 在實驗報告中，或是在將來的科學(xué)研究報告中，都需要用一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖或輪廓圖來表些組織或器官的結(jié)構(gòu)。盡管目前顯微攝影已很普遍，但有時也要襯以簡潔的線條圖以使所顯示結(jié)構(gòu)更加清晰。因此，在學(xué)習(xí)過程中有必要掌握正確的繪圖方法和技巧，現(xiàn)簡要說明植物學(xué)繪圖方法。1. 首先要注意科學(xué)性和準(zhǔn)確性。必須認(rèn)真觀察要畫的對象，學(xué)習(xí)有關(guān)的文字記載、實驗指導(dǎo)等，正確理解各部特征，才能在繪圖時保證形態(tài)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，并說明某一科學(xué)問題。繪圖前先要把你所需要畫的對象觀察仔細(xì)，各部分的結(jié)構(gòu)都要看清楚，同時要把正常的結(jié)構(gòu)與偶然的、人為的一些“結(jié)構(gòu)”區(qū)分開，然后選那些有代表性的典型的部位進行繪圖。2. 畫圖前還要確定你所要畫的圖在報告紙上的位置和大小，然后才能開始畫。不能任意地、毫無計劃地在紙上畫圖，這樣常常會使所畫的圖在紙上的位置不當(dāng)，或過大過小都會影響注字和說明。一般根據(jù)在報告紙上要畫幾個圖來確定位置，如果要畫兩個圖，那么先要在報告紙上方留下一部分空檔，以便寫本次實驗名稱，余下部分可一分為二，作為畫兩個圖的地方，一定要在報告紙上方規(guī)定位置上寫上班級、專業(yè)、姓名、學(xué)號、日期。3. 當(dāng)畫圖的位置確定以后，就要確定圖的大小，一般要盡可能地把圖畫大一些。如果畫的是