一株絲狀真菌的分類鑒定與特性研究

1、一株絲狀真菌的分類鑒定與特性研究生物系 王凡指導(dǎo)老師 趙文婧 韓建榮摘要；運(yùn)用載片觀察法和菌落平板培養(yǎng)法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離到的絲狀真菌Mars進(jìn)行了培養(yǎng)觀察，并與標(biāo)準(zhǔn)菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428進(jìn)行比較，初步鑒定Mars可能屬于白僵菌屬 (Beauveria)。采用明膠瓊脂平板法測(cè)定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶，結(jié)果表明Mars的胞外蛋白酶酶活略小于3.4428。另外，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了Mars和3.4428的產(chǎn)孢量，發(fā)現(xiàn)Mars的產(chǎn)孢量小于3.4428。并進(jìn)行了室內(nèi)感染松毛蟲毒力的比較，結(jié)果顯示3.4428的毒力強(qiáng)于Mars。關(guān)鍵詞：絲狀真菌；觀察鑒定；胞外蛋

2、白酶；產(chǎn)孢量本實(shí)驗(yàn)室分離到一株絲狀真菌Mars，它在Mas培養(yǎng)基上能產(chǎn)生明顯的溶鈣圈，在牛奶培養(yǎng)基中培養(yǎng)能導(dǎo)致酸凝，并且使培養(yǎng)基由白色變?yōu)樽霞t色。該菌株在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)都沒有發(fā)現(xiàn)有性孢子，初步鑒定是一種半知菌。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察，并與購(gòu)于中科院的標(biāo)準(zhǔn)菌株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428相對(duì)比，以確定該菌株的準(zhǔn)確分類地位。另外，根據(jù)球孢白僵菌所具有的一些生理生化特征，本實(shí)驗(yàn)對(duì)Mars的產(chǎn)孢量，胞外蛋白酶的活力及毒力等特性進(jìn)行了初步研究。1 材料與方法1.1 供試菌株Mars菌株，保存在PDA斜面上，由山西大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株球孢白僵菌（Beau

3、veria bassiana）3.4428購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院北京微生物研究所，保存在查氏斜面上。1.2 試劑Hgcl2，吐溫-100，磷酸緩沖溶液等。1.3儀器高壓蒸氣滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，電子顯微鏡，電子天平等。1.4 培養(yǎng)基共使用下列培養(yǎng)基12：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），添加了蛋白胨的馬鈴薯培養(yǎng)基（PPDA），查氏培養(yǎng)基（CA培養(yǎng)基），明膠瓊脂培養(yǎng)基：平板由1的明膠和1.5的瓊脂配成。1.5實(shí)驗(yàn)方法固體平板培養(yǎng)法從PDA斜面和CA斜面上分別挑取少量孢子接種到PDA、CA、PPDA平板上，25黑暗培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)。 載片觀察法1將圓形濾紙鋪于培養(yǎng)皿的底部，其上放一U形玻棒及蓋玻片和載玻片

4、各一片，蓋好培養(yǎng)皿蓋，滅菌；用無菌玻棒直接蘸取已融化的固體培養(yǎng)基滴于培養(yǎng)皿中載玻片的中央；用接種環(huán)取少量孢子接種于載玻片上培養(yǎng)基小塊的四周，加上蓋玻片，并略向下輕壓；為防止培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基干燥，可于培養(yǎng)皿中的濾紙圓片上滴加無菌的20%甘油液3-4毫升，蓋好皿蓋；將蓋好的培養(yǎng)皿置適宜的溫度下培養(yǎng)，定期取出，觀察顯微結(jié)構(gòu)。 胞外蛋白酶的測(cè)定（使用明膠瓊脂平板法3）平板由1的明膠和1.5的瓊脂配成，各待試菌株配成1×108孢子/mL的孢子懸液，用微量取樣器取25L點(diǎn)滴在平板中央。每待試菌株6次重復(fù)，25黑暗培養(yǎng)三天，用15%的HgCl2（溶于2mol/L的鹽酸）溶液處理,待菌落周圍顯現(xiàn)清晰

5、的透明環(huán)后，倒去HgCl2，用直尺測(cè)量縱橫兩個(gè)方向的透明環(huán)直徑和菌落直徑，以透明環(huán)和菌落直徑平均值之比作為胞外蛋白酶產(chǎn)酶量的指標(biāo)。產(chǎn)孢量的測(cè)定4分別將Mars和3.4428接種于PDA培養(yǎng)基、PPDA培養(yǎng)基、CA培養(yǎng)基上，25黑暗培養(yǎng)10d后，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在菌落核心至1/2處用直徑為4.5mm打孔器打孔取樣,置入盛有10mL 0.1吐溫水的500mL三角瓶中，手搖震動(dòng)10-15min。用兩層紗布過濾后得孢子懸液，用無菌滴管滴一滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，小心加放蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。從血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上每個(gè)小方格（體積1/5，000，000mL）中的孢子數(shù)可進(jìn)一步計(jì)算出3個(gè)重

6、復(fù)單位面積產(chǎn)孢量的平均值。計(jì)算公式如下：樣品孢子數(shù)/mm2=A5×25×104×稀釋倍數(shù)15.9毒力測(cè)定4配制2×108個(gè)/mL,2×107個(gè)/mL的兩種不同濃度的孢子懸液，挑取大小均勻、健康活潑的供試松毛蟲蟲體，取新鮮的松針孢子液中浸510s，取出停留23s，連同供試蟲（100頭）一并放入干凈玻璃制養(yǎng)蟲缸（直徑10cm，高15cm）中，用白紗窗布罩住缸口，每個(gè)處理設(shè)三次重復(fù)，空白對(duì)照不噴任何物質(zhì)，注意噴灑前先將菌液搖勻，后置入恒溫培養(yǎng)箱中在25下黑暗培養(yǎng)，處理后3d更換新鮮松針，以后每2d更換1次松針，并在培養(yǎng)箱中放入濕棉花以保持濕度，至少保

7、證濕度在75%左右，每2d定時(shí)檢查幼蟲的死亡情況，同時(shí)揀出死蟲，PDA平板保濕培養(yǎng)以確診死因。在除去蟲糞，計(jì)算校正死亡率，并求死亡中時(shí)LT50。2 結(jié)果與分析2.1 載片觀察法結(jié)果及分析將接有Mars與3.4428孢子的載玻片培養(yǎng)7d后，從培養(yǎng)箱中取出，將載玻片直接置于顯微鏡上觀察。具體形態(tài)特征59描述如下： Mars：營(yíng)養(yǎng)菌絲無色，粗1.23.0m，分生孢子梗多著生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，產(chǎn)孢細(xì)胞常濃密簇生于菌絲或泡囊上，有時(shí)可多達(dá)十幾個(gè)，極少數(shù)單生，產(chǎn)孢細(xì)胞基部多為球形，近球形，少柱形，個(gè)別產(chǎn)孢細(xì)胞基部特化為較長(zhǎng)的細(xì)絲。頸部明顯延長(zhǎng)成粗1m，長(zhǎng)達(dá)14m的產(chǎn)孢軸。軸上具小齒突，呈膝狀彎曲（“之”字形彎

8、曲），培養(yǎng)后期，在低倍鏡下常見球型的密集孢子頭（由泡囊，產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子組成），分生孢子透明，光滑，多為亞卵型和橢圓型。（見圖1、圖2）。 Beauveria bassiana 3.4428：營(yíng)養(yǎng)菌絲無色，粗1.23.0m,分生孢子梗多著生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，產(chǎn)孢細(xì)胞常簇生于菌絲或泡囊上，最多可達(dá)7個(gè)，少數(shù)單生，產(chǎn)孢細(xì)胞基部多為球形，近球形，少柱形，產(chǎn)孢軸較長(zhǎng)，可達(dá)17m。軸上具小齒突，呈膝狀彎曲（“之”字形彎曲），培養(yǎng)后期，在低倍鏡下常見球型的密集孢子頭（由泡囊，產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子組成），分生孢子透明，光滑，多為亞卵型和橢圓型，個(gè)別為長(zhǎng)柱型。（見圖3、圖4）。圖 1 Mars菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（&#

9、215;40） 圖2 Mars菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（×10）圖3球孢白僵3.4428 的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（×40） 圖4球孢白僵菌3.4428的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（×10）通過實(shí)驗(yàn)觀察，雖然Mars和3.4428在顯微結(jié)構(gòu)上有很大的相似性，但二者之間仍有細(xì)微差別。詳見表1。表1 Mars與3.4428的異同菌株孢子頭產(chǎn)孢細(xì)胞分生孢子Mars可見密集的孢子頭大多數(shù)濃密簇生，多達(dá)十幾個(gè),極少數(shù)單生，產(chǎn)孢軸“之”字形 結(jié)構(gòu)彎曲幅度較大，偶在短,的產(chǎn)孢軸頂端可發(fā)出不孕的細(xì)長(zhǎng)的產(chǎn)孢絲.分生孢子透明光滑，多為球形、亞卵形，個(gè)別為長(zhǎng)柱形.3.4428可見較密集的孢子頭大多數(shù)簇生，最多達(dá)七個(gè)，少數(shù)單生，

10、產(chǎn)孢軸“之”字形結(jié)構(gòu)彎曲幅度較小.分生孢子透明，光滑，多為球形、亞卵形.2.2 固體平板培養(yǎng)觀察10結(jié)果接種后的平板培養(yǎng)7d后，從培養(yǎng)箱中取出，觀察菌落形態(tài)由表2可以看出在不同的培養(yǎng)基上Mars與3.4428的菌落形態(tài)比較相似，這兩種菌在PPDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)都有褶皺，呈輻射狀分支，在PDA和CA培養(yǎng)基上菌落都無褶皺。所不同的是Mars的菌落形態(tài)呈絨毛狀，在PPDA培養(yǎng)基上基質(zhì)色澤為墨綠色；3.4428的菌落形態(tài)呈毛氈狀。（詳見表2）。表2 25培養(yǎng)7天的菌落形態(tài)菌株培養(yǎng)基菌落質(zhì)地菌落色澤基質(zhì)色澤Mars3.4428PPDAPDACAPPDAPDACA致密絨毛狀，有褶皺，呈輻射狀分支致密絨

11、毛狀，無褶皺稀疏絨毛狀，無褶皺毛氈狀，有褶皺，呈輻射狀分支毛氈狀，無褶皺毛氈狀，無褶皺白色乳白色乳白色乳白色乳白色白色墨綠色淡黃色淡黃色黃色淡黃色橙黃色2.3不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量結(jié)果通過測(cè)定Mars與3.4428在3種不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，可以看出Mars的產(chǎn)孢量低于3.4428。所用的三種培養(yǎng)基中Mars在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大，而3.4428在PPDA上的產(chǎn)孢量最大。（具體數(shù)值見表3）。表3 不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量及平均值菌株培養(yǎng)基產(chǎn)孢量 （×106mm2）1 2 3平均值Mars3.4428PPDAPDACAPPDAPDACA1.48 1.54 1.763.11 2.39 2

12、.993.68 2.36 2.018.05 7.89 8.086.70 4.66 3.623.93 4.21 4.841.592.832.688.014.994.332.4胞外蛋白酶的結(jié)果 利用明膠瓊脂培養(yǎng)法測(cè)定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶產(chǎn)量，結(jié)果表明Mars的胞外蛋白酶產(chǎn)量略低于3.4428。（具體數(shù)值見表4）。表4 Mars和3.4428的胞外蛋白酶產(chǎn)量比值及平均值。菌株胞外蛋白酶產(chǎn)量比值 1 2 3 4 5 6平均值 3.4428Mars2.06 2.13 1.94 2.03 1.95 2.99 1.83 2.00 2.02 2.08 2.13 1.772.101.972.5毒

13、力測(cè)定結(jié)果表5不同種類和不同濃度百僵菌對(duì)油松毛蟲的室內(nèi)感染死亡情況菌株濃度（個(gè)/ml）試蟲（頭）不同時(shí)間幼蟲的校正死亡率%2d 4d 6d 8d 10dMars3.44282×1072×1082×1072×1081001001001002 28 40 47 655 31 47 63 793 35 51 68 826 41 54 77 96 表6不同種類和不同濃度百僵菌對(duì)油松毛蟲的室內(nèi)感染死亡情況菌株濃度（個(gè)/ml）回歸方程(Y=a+bX)相關(guān)系數(shù)（R）死亡中時(shí)LT50顯著性檢驗(yàn)Mars3.44282×1072×1082×10

14、72×108Y=0.826X-0.227Y=1.013X-0.275Y=1.090X-0.302Y=1.213X-0.3210.9850.9840.9940.9797.595.965.454.75*注：X=lgd(天數(shù)) Y=校正死亡率 結(jié)果表明，濃度是影響白僵菌分生孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)速度及白僵菌致病力的重要因素。松毛蟲經(jīng)兩種菌、兩種濃度懸液感染10d后，校正死亡率分別為65%、79%、82%、96%，經(jīng)Duncon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2×108個(gè)/mL的孢子液的使用效果和2×107個(gè)/mL孢子的使用效果比較差異性顯著。將校正死亡率轉(zhuǎn)換為死亡幾率，死亡時(shí)間轉(zhuǎn)換成時(shí)間的對(duì)數(shù)，

15、求出回歸方程（見表6）。不同菌株和不同濃度的孢子液處理松毛蟲的LT50值分別為7.59、5.96、5.45、4.75d，說明油松毛蟲幼蟲的死亡中時(shí)（死亡率達(dá)50%的天數(shù)）隨濃度的降低而升高，分析其原因可能是孢子濃度低，對(duì)蟲體的入侵能力下降。另外，Mars菌株和3.4428菌株的相同濃度對(duì)幼蟲感染死亡率也不同。標(biāo)準(zhǔn)菌株3.4428的毒力（對(duì)松毛蟲的致死力）強(qiáng)于Mars菌株。當(dāng)然感染效果可能不僅受濃度因素和菌株因素影響還與環(huán)境因素和蟲體間相互感染有關(guān)。 3討論真菌分類主要基于形態(tài)特征（顯微特征，菌落形態(tài)）和生理生化指標(biāo)來研究，這種分類方法在分類史上仍占有很重要的地位11。載片培養(yǎng)法是觀察各種菌株的

16、顯微特征的一種有效方法，這種方法既可以保持真菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)，還便于觀察不同發(fā)育期的培養(yǎng)物且培養(yǎng)物不易染菌。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用了標(biāo)準(zhǔn)菌株球孢白僵菌3.4428與Mars菌株進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)菌落形態(tài)與顯微特征，初步推斷Mars是球孢白僵菌菌種下的一個(gè)菌株。 球孢白僵菌屬于半知菌亞門（Deteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetales）、從梗孢科（Moniliaceac）、白僵菌屬（Beauveria）是一種蟲生真菌11，主要寄生在鱗翅目、半翅目、膜翅目等多種昆蟲和多種壁虱上。在生物防治中受到人們的極大重視。迄今已發(fā)現(xiàn)，白僵菌會(huì)產(chǎn)生多種類型的代謝產(chǎn)

17、物，包括毒素類，水解酶類有機(jī)酸類13。這些生理生化特征為菌種的分類鑒定提供了重要的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，只測(cè)定了Mars的胞外蛋白酶產(chǎn)量，產(chǎn)孢量及毒力等一些基本的生理生化特征，并與標(biāo)準(zhǔn)菌株球孢白僵菌做了對(duì)比，結(jié)果表明Mars也具有這些生理生化特征，結(jié)合菌落形態(tài)與顯微特征的觀察結(jié)果，初步鑒定Mars屬于球孢白僵菌屬。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將Mars和3.4428分別接種在牛奶培養(yǎng)基上搖床振蕩培養(yǎng)數(shù)天后，Mars可使培養(yǎng)基發(fā)酵變酸，且培養(yǎng)基顏色由白色變成紫紅色,，雖然標(biāo)準(zhǔn)菌3.4428也能使培養(yǎng)基變酸，但不能使培養(yǎng)基變色。但由于時(shí)間關(guān)系，目前這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。致謝：本論文是在山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)

18、學(xué)院韓建榮教授的悉心指導(dǎo)下完成的。在完成論文的過程中，山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的康曼師姐、王麗同學(xué)以及山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物生理實(shí)驗(yàn)室的其他同學(xué)都給予了我大量的指導(dǎo)和幫助，在此我對(duì)他們表示衷心的感謝！參考文獻(xiàn)：1沈萍,范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：高等教育出版社，1996.2趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：科學(xué)出版社，2003，251265.3唐曉慶，李增智.球孢白僵菌胞外蛋白酶產(chǎn)生水平及其與毒力關(guān)系的研究1996，23（3）：279284. 2005，24（4）：365368.56黃勃,李如春,王四寶,樊美珍,李增智.大別山區(qū)三中白僵菌的分離和鑒定.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2000，27（

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