轉(zhuǎn)基因技術(shù)V2

1、基因打靶技術(shù)(gene targeting ):是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段 .通過對生物活體遺傳信 息的定向修飾(包基因滅活，點(diǎn)突變引入,缺失突變，外源基因定位引入，染色體大片段刪除等),并使修飾后 的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳,表達(dá)突變性狀，從而研究基因功能等生命科學(xué)的重大問題 ，以及提供相關(guān)的 疾病治療，新藥篩選評價(jià)模型等.它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)成就的基礎(chǔ)之上，并促進(jìn)了相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展.同源重組技術(shù)(homologous recombination ):同源重組是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中相同或相 似DNA序列間的重組.它通常通過一對同源分

2、子非姊妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段Knockout (基因敲除)：應(yīng)用同源重組原理，將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，使特 定靶基因失活，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。從而改變受體表型的變化，包括外觀、行為和其它物理和生化特征。Konckin (基因敲入)：是利用基因同源重組，將外源有功能基因(基因組原先不存在、 或已失活的基因)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。Knockdown (基因敲減)：利用基因修飾或和 RNAi的方式(用DNA或 RNA寡肽和靶基因序列互補(bǔ))使一個(gè)或 多個(gè)靶向基因表達(dá)或 m

3、RNA翻譯水平明顯降低?；虿东@技術(shù)(gene trapping ):通過報(bào)告載體隨機(jī)整合到基因組，產(chǎn)生插入失活突變并揭示基因表達(dá)模式 及其功能，是建立高通量變大規(guī)?；蛲蛔兡Ｐ偷囊环N便利手段核移植(somatic cell nuclear transfer):是指利用顯微外科手術(shù)的方法將胚胎細(xì)胞或成體細(xì)胞的細(xì)胞核移人去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建成重組胚，通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細(xì)胞基因型相同 的后代的技術(shù)過程，又稱為動(dòng)物克隆技術(shù)。治療性克隆(therapeutic cloning ):是指將病人體細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，在核重新編程后， 供體體細(xì)胞核重新獲得發(fā)育的全能性，并可

4、啟動(dòng)胚胎發(fā)育，產(chǎn)生攜帶有病人基因組的多潛能干細(xì)胞；然后，經(jīng)誘導(dǎo)分化成各種類型的替代細(xì)胞，來修復(fù)損傷組織或器官的過程反向遺傳學(xué)(reverse genetics ):由轉(zhuǎn)基因小鼠體系發(fā)展而建立的，則先在體外使基因某一片段發(fā)生突變， 然后導(dǎo)入基因組，從而研究基因結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系以及建立人類遺傳病動(dòng)物模型這種從特定基因的改造到 整體動(dòng)物的表型分析的研究思路稱為反向遺傳學(xué)傳統(tǒng)遺傳學(xué)/正向遺傳學(xué)(forward genetics):是從具有特定異常病理表型的突變小鼠開始，通過染色體定位和分子克隆的方法，最終克隆導(dǎo)致特定表型的基因組突變位點(diǎn)，從而建立某一基因與相應(yīng)生物學(xué)現(xiàn)象之 間的關(guān)系.乳腺生物反應(yīng)器(ma

5、mmarygland bioreactor):是將外源基因在乳腺中特異表達(dá)，以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺組織生產(chǎn)藥用蛋白，采用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是一種全新的生產(chǎn)模式，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展的 重要方向。TALE技術(shù) (transcription activator-like effector): 細(xì)菌分泌的 AvrBs 蛋白與宿主基因組上的特定 序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系。細(xì)菌通過這種恒定的對應(yīng)關(guān)系識(shí)別宿主的基因，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的。由于這種調(diào)節(jié)作用通常表現(xiàn)為激活某一宿主基因的表達(dá)，因此把AvrBs及其類似蛋白統(tǒng)稱為 TAL呂利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化

6、蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的。ZFN技術(shù)（Zinc Finger Nucleases）:鋅指核糖核酸酶（ZFN）由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA識(shí)別域是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般34個(gè)），每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。鋅指蛋白源自轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族（transcription factorfamily ），在真核生物中從酵母到人類廣泛存在，形成alpha-beta-beta二級結(jié)構(gòu)。其中alpha螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的 DNA結(jié)合特異性，骨架結(jié)構(gòu)保守。對決定DNA結(jié)合特異性的氨基酸引入序列的

7、改變可以獲得新的DNA結(jié)合特異性。Cas9 技術(shù)：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs），這是一類 廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)。（CRISPR）/CRISPR-associated （Cas）是細(xì)菌和古細(xì)菌一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識(shí)別并剪切DNA以降解外來核酸分子。條件性基因打靶（conditional gene targeting）:可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶方法。以Cre-

8、LoxP系統(tǒng)與基因打靶技術(shù)相結(jié)合的基因打靶技術(shù)。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因打靶的基礎(chǔ)上，利用Cre重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可 控狀態(tài)。超級小鼠的岀現(xiàn) 標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的成熟，它在科學(xué)上的意義至少有4個(gè)方面： 證實(shí)了 “中心法則”（即DNA> RNA>蛋白質(zhì)的遺傳信息傳遞過程）的概念在哺乳動(dòng)物體內(nèi)仍然適用； 物種之間的生殖隔離被打破； 找到了一條按照人們意愿定向創(chuàng)造哺乳動(dòng)物遺傳性狀的有效途徑； 有了一套集分子水平、細(xì)胞水平和活體動(dòng)物水平于一體的全新的綜合研究體系?；虼虬行∈蟮膶?/p>

9、現(xiàn) 至少是四個(gè)方面技術(shù)的發(fā)展和綜合應(yīng)用的結(jié)果： 是胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ES） 分離的成功，并證實(shí)了這種細(xì)胞還能重新加入處于胚泡階段發(fā) 育 是發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，外源的DNA可以與內(nèi)源基因組 DNA中的同源區(qū)域之間發(fā)生重組 （這種重組現(xiàn)象 可稱之為定點(diǎn)整合，也有人稱之為基因打靶） 是證實(shí)了可將存在于 ES細(xì)胞中的突變基因引入活體動(dòng)物，并通過生殖系向后代傳遞 是正負(fù)選擇系統(tǒng)的應(yīng)用，使小鼠ES細(xì)胞中的內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變在技術(shù)上變得可行為何小鼠成為最重要的模式生物? 生理生化特性生長發(fā)育過程及疾病發(fā)生機(jī)制和人類相似，所以小鼠的結(jié)果可能為相關(guān)的人類生理和病理現(xiàn)象提供重

10、要線索 比較基因組研究表明人類90%以上基因在小鼠有 DNA序列高度保守的同源基因，提示小鼠基因組學(xué)研究對人類基因功能研究的重要性 種類繁多的近交系小鼠為突變基因定位及多基因性狀分析提供了有效工具 小鼠基因組已基本完成測序 建立了極為有效的小鼠基因組改造技術(shù)（轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù)）為什么轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制藥將成為最主要的基因工程制藥技術(shù)呢？1. 產(chǎn)岀高產(chǎn)品活性高乳腺組織是一種高效的產(chǎn)奶器官，一頭奶牛一年可產(chǎn)奶 800010000升，而一只綿羊和山羊也可產(chǎn)奶 800 1000升，以最低表達(dá)量1克/升的重組蛋白計(jì)算（即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奶液中重組蛋白的含量，一般為120克/升），一頭奶牛一年就可生

11、產(chǎn) 810公斤重組蛋白，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)重組蛋白表達(dá)量為0.11克/升, 一頭奶牛重組蛋白年產(chǎn)量相當(dāng)于1000升的發(fā)酵罐；而且動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器可以生產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子量大的蛋白，而且生產(chǎn)的重組蛋白藥物生理活性好，與人同源性高，非常接近天然產(chǎn)品。2. 成本低、周期短由于動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白不需要昂貴的生產(chǎn)設(shè)備（如發(fā)酵罐），動(dòng)物飼養(yǎng)和繁殖成本都比較低，國外經(jīng)濟(jì)學(xué)家曾算過一筆賬，若用其他生產(chǎn)工藝（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法）來生產(chǎn)1克藥物蛋白質(zhì)，成本需8005000美元，而利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物只需0.020.5美元；目前一種新藥由研制開發(fā)到上市，需1520年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥則可縮短到5年。3.

12、不耗能、無污染該技術(shù)基本上為一畜牧業(yè)過程，雖飼養(yǎng)環(huán)境要求特別潔凈，但仍是給牛羊草料，由牛羊奶中提取藥品，因此蛋白生產(chǎn)過程不需昂貴設(shè)備，不消耗能源，不會(huì)產(chǎn)生工業(yè)廢料，也不會(huì)對環(huán)境產(chǎn)生污染，因此動(dòng)物乳腺 生物反應(yīng)器制藥技術(shù)是一種可持續(xù)發(fā)展的新型生物制藥技術(shù)。4. 由于動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制藥技術(shù)具有如此巨大的優(yōu)勢，將成為一種產(chǎn)業(yè)化潛力巨大的高新技術(shù)，也是國內(nèi)外政府和企業(yè)的研究和開發(fā)熱點(diǎn)。據(jù)美國紅十字會(huì)預(yù)測，至U2010年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額將達(dá)到350億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類的90頰上。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)應(yīng)用:1、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動(dòng)物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。2、建

13、立多種疾病的動(dòng)物模型，研究發(fā)病機(jī)理及治療方法。3、改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，提高動(dòng)物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價(jià)的人體藥用蛋白5. 在改良和培育動(dòng)物新品種的應(yīng)用V轉(zhuǎn)基因動(dòng)燒1豊礎(chǔ)損型2肖用畫白生產(chǎn)3. 我疾余動(dòng)齒4畀科器宜薦植1 VIA2保持此良基因3農(nóng)業(yè)上引沖 4生嚴(yán)菸睪醫(yī)益初S拯截巔危動(dòng)截1. Wt供可崢fll喈務(wù) 音和組織，謹(jǐn)免 免疫排肩辰應(yīng)* 龍決購富姐奴平 怎問1E2鹹厭藥材陽選簫眄關(guān)益司半悟L（犁務(wù)臥司莎從冬詡域卜1. PPLimM)pp- -thrirflpedic.a t-omIranian con3. Nexia 3拿知niS

14、KdMrKI.MWn1. Cy«gr« (MWwwwwn? Genetic Savins and Clone 恠 siww*3. Gone int 的wwn xtor«n0rinMi(rAJ.mn4H4.aam1 ACTWfcfWWWI com2 Wig展閭Www.o»ign.CG*n3. BwaGerwww tnaegflin4 Mueieotseh (Am轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備途徑和方法：1. DNA顯微注射優(yōu)缺點(diǎn)：1）可靠性高、重復(fù)性好2）對于小鼠來說，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率比較高3）導(dǎo)入DNA片段的大小和類型不受限制4）轉(zhuǎn)基因在代與代之間傳遞的穩(wěn)定性好5）

15、整合位點(diǎn)的隨意性可能對轉(zhuǎn)基因表達(dá)造成影響6）可能會(huì)出現(xiàn)不希望的插入突變7）開發(fā)裝置和技術(shù)的花費(fèi)大時(shí)間長2. 胚胎干細(xì)胞技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：1）用多種方法將外源基因?qū)?ES細(xì)胞，其細(xì)胞的鑒定和篩選比較方便；2）可預(yù)先在細(xì)胞水平上檢定外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性等故轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因整合率的可控程度高于微注射法；3）ES細(xì)胞注入囊胚以及囊胚移植到子宮，在操作上比較簡便。不足之處為：1）法中建立ES細(xì)胞系的本身就是一種高難技術(shù)，其培養(yǎng)條件至今無突破性進(jìn)展；2）ES細(xì)胞的保存和維持也不容易；3）所得個(gè)體為嵌合性，如發(fā)生性嵌合，將導(dǎo)致生殖功能紊亂和不育4 ）所需的時(shí)間較長。3. 逆轉(zhuǎn)錄病毒介

16、導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：優(yōu)點(diǎn)：1）單拷貝基因?qū)耄? ）整合常發(fā)生在病毒基因 LTR片段，目的基因不會(huì)破壞；3 ）整合受病毒基因插入宿主 DNA的機(jī)制控制，不易發(fā)生大的突變；4 ）單一位點(diǎn)整合，易分析插入位點(diǎn)。不足點(diǎn)：經(jīng)嵌合體途徑，實(shí)驗(yàn)周期長；目的基因要求不超過10kb;轉(zhuǎn)入基因含病毒 DNA可出現(xiàn)自身復(fù)制表達(dá)現(xiàn)象。4. 精子作為載體將外源 DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA并通過受精過程將外源 DNA導(dǎo)入受精卵。此法不僅可免去復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，且可省去不少繁雜的操作和條件準(zhǔn)備。但該法有些結(jié)果不能重復(fù)。5. 核轉(zhuǎn)移技術(shù)（克隆）小結(jié)：方法顯微注射核移植胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合

17、效率較高，不需 要載體，目的基 因的長度可達(dá)100Kb轉(zhuǎn)基因效率高； 預(yù)測基因表達(dá) 水平；可以使用 定點(diǎn)整合技術(shù)外源DNA的整 合率高；整合 在生殖細(xì)胞中 的比例也很高。可在整合點(diǎn)整 合轉(zhuǎn)移基因的 單個(gè)拷貝；該方法簡單、方便缺點(diǎn)精密儀器，技 術(shù)操作較難，易 造成宿主動(dòng)物 基因組的插入 突變供體細(xì)胞易衰 老ES細(xì)胞株不易 建立，長期培養(yǎng) 后岀現(xiàn)分化現(xiàn) 象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物都是嵌 合體插入的基因有 大小限度；嵌合 性很高；外源 DNA在動(dòng)物各 種組織中的分 布不均有些結(jié)果不能重復(fù)基因打靶技術(shù)存在的問題：一、打靶載體設(shè)計(jì)引起問題1. 不完全剔除（incomplete knockout）1）使用了隱

18、含的啟動(dòng)子2）不正常拼接引起的突變外顯子被漏讀，從而產(chǎn)生突變蛋白最常見.3）篩選標(biāo)記基因插入位點(diǎn)下游的起始密碼子引起轉(zhuǎn)錄通讀2. 其他基因編碼區(qū)或者調(diào)控元件的刪除3. 篩選標(biāo)記基因?qū)Ρ硇陀绊懚⒈硇徒忉屩写嬖趩栴}1 基因沉余和代償機(jī)制2. 遺傳背景對小鼠表型影3. 修飾基因?qū)Ρ硇陀绊懠皯?yīng)用4. 亞效等位基因基因敲除的策略：1. 構(gòu)建載體的般原則（完全基因剔除）2. 置換型載體設(shè)計(jì)原則：1）同源臂為5-8KB2）正選擇標(biāo)記框應(yīng)插在靶基因上游的外顯子內(nèi)3）應(yīng)避免將正選擇標(biāo)記框插入到靶基因外顯子兩個(gè)編碼密碼子之間4）若靶基因太小或者外顯子太大應(yīng)刪除整個(gè)靶基因5） 若用PCR方法篩選中靶的棵隆，打靶載體短臂應(yīng)為0.5-2KB6）打靶載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞前要線化，因而在同源臂外側(cè)至少有一個(gè)單切酶點(diǎn)3. 插入型載體設(shè)計(jì)原則：1）同源臂為5-8KB2）正選擇標(biāo)記框可在同源區(qū)內(nèi)或外3）若載體中同源序列僅含有一個(gè)外顯子應(yīng)避