質(zhì)粒圖譜大全

1、質(zhì)粒圖譜大全質(zhì)粒圖譜大全（轉(zhuǎn)載）1 .九種表達(dá)載體Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA2 .克隆載體pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS()L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD9263 .PET系列表達(dá)載體ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p

2、ETDsbFusionSystems39band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystem33bProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystemsProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETGSTFusionSystems41and42Pr

3、oteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETNusAFusionSystems43.1and44ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?S trep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表達(dá)載體TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X pGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5

4、X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11 PTYB12六.真核表達(dá)載體 pCDNA3.1(-) pCDNA3.1()pPICZalphaApGAPZ APYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何閱讀分析質(zhì)粒圖譜載體主要有病毒和非病毒兩大類(lèi)，其中質(zhì)粒DNA 是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一、一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素復(fù)制起始位點(diǎn)Ori?即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原 核生物DN粉子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核 生物DN粉子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)?？股乜剐曰蚩?/p>

5、以便于加以檢測(cè)，如Amp ?,Kan多？克隆位點(diǎn)MCSE：隆攜帶外源基因片段P/E?啟動(dòng)子/增強(qiáng)子Terms終止信號(hào)？加poly (A)信號(hào)？可以起到穩(wěn)定mRN徘用八如何閱讀質(zhì)粒圖譜 第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類(lèi)型(原 核/真核/穿梭質(zhì)粒)第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么 篩選標(biāo)記。(1)Ampr水解3內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芳的毒性。(2) tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。(3) camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。(4) neor (kanr)氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶使 G418(長(zhǎng)那霉素衍生物)失活(5) hygr使潮霉素3失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)(MCS 。它具有

6、多個(gè)限 制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在 這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志 基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基 因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNAif入片段大小。質(zhì)粒一般 只能容納小于10Kb的外源DNAt段。一般來(lái)說(shuō), 外源DNAt段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化 效率越低 第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子一核 糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 這是 用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入 一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選 用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。啟動(dòng)子一核糖體結(jié)合位點(diǎn)一克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終 止信號(hào)啟動(dòng)子一促進(jìn)DNA專(zhuān)

7、錄的DNA版序，這個(gè)DN嶇 域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA+ 子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開(kāi)始轉(zhuǎn)錄 的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。？增強(qiáng)子/沉默子-為真核？基因組（包括真核病毒 基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的 調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無(wú) 關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。 /沉默子一負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列 （Rbs/AGU/SDS : mRNAt核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是 AUG（起始密碼）和SD序 列。？轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA勺

8、保 守序列）此位點(diǎn)down stream有一段GT或T富 豐區(qū)）這2部分共同構(gòu)成poly （A）加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的保守序列）此位點(diǎn)down stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly （A）加尾信號(hào)。？回答有人之前提出的一個(gè)問(wèn)題：為什么質(zhì)粒圖譜 上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代 表兩條DNA連，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA它的啟 動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一 條鏈上.三、介紹一下關(guān)于載體的知識(shí)（雖然課本上都有 寫(xiě)）1 .什么是載體即要把一個(gè)有用的基因（目的基因一一研究或應(yīng) 用基因）通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體 細(xì)

9、胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基 因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體(vector )P.S.基因工程所用的vector實(shí)際上是DN冊(cè)子,是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA2 .載體的分類(lèi)按功能分成：（1）克隆載體都有一個(gè)松弛 的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制 擴(kuò)增。它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNAt段（基因）的 載體。（所以有時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增效率低下，要注意 是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體）（2）表達(dá)載體具有克隆載體的基本元件 （ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA版序的載體。按進(jìn)入受體細(xì)胞類(lèi)型分：（1）原核載體（2） 真核載體（3）穿梭載體（sbuttle

10、vector ）指在 兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn) 載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.P.S.穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復(fù)制子，以 確保兩類(lèi)細(xì)胞中都能擴(kuò)增。3 .基因工程載體的3個(gè)特點(diǎn)：（一）都能獨(dú)立自主的復(fù)制：載體DN份子中有 一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如 MCS插 在其中的外源DNM段，能被動(dòng)的跟著載體一起 復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。(二)都能便利的加以檢測(cè)：如載體的藥物抗性 基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含 有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，只有攜帶這些 抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。(三)都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主 細(xì)胞中分離純

11、化出來(lái)。4 .載體的選擇和制備：選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體 中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是 要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載 體。載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：【1】構(gòu)建DN履組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表 達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體?！?】.載體的類(lèi)型：(1)克隆載體的克隆能力一據(jù)克隆片段大小(大 選大，小選小)。如10kb選質(zhì)粒。(2)表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類(lèi)型一原核/真核/穿 梭，E.coli/哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體。(3)對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點(diǎn)：選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌；用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考O【3】載體MC滸的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載 體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不 產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。選用質(zhì)粒（最常用）做載體的4點(diǎn)要求：選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1 1.5kb）一 不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝