動力學機理研究

1、磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸反應抑制動力學的研究摘要：磷脂酶D (PLD)催化磷脂酰膽堿(PC)磷脂?；D(zhuǎn)移合成磷脂酰絲氨酸 (PS)的反應在油-水兩相體系中進行，此法是目前制備PS最為廣泛的一種方式，但其機理尚不明確。本文在 PH 5.5,溫度28C, 200 rpm/min的恒溫搖床中，進行 不同濃度PC在PLD催化下發(fā)生的轉(zhuǎn)磷脂酰基反應，發(fā)現(xiàn)隨著PC濃度的增加，PC 的轉(zhuǎn)化率及PS的收率均呈下降趨勢。為驗證PC轉(zhuǎn)化率及PS收率的下降是由于生成膽堿濃度的增高所影響的，繼而在不同PC濃度下分別加入3、6mM的抑制劑 (膽堿)進行轉(zhuǎn)磷脂?；磻?，探討膽堿在PLD催化下的抑制機理，建立了無膽堿抑

2、制和有膽堿抑制時的動力學模型，實驗結果很好的符合了所提假設，對PS的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導意義。關鍵字：磷脂酰絲氨酸；磷脂酰膽堿；磷脂酶 D ;轉(zhuǎn)磷脂?；磻狪nhibition kinetics of conversion of phosphatidycholine tophosphatidylserine by phospholipase DAbstract:The syn thetic react ion of phosphatidyseri ne(PS) from phosphatidylcholi ne(PC) catalyzed by phospholipase D(PLD) was

3、carried in oil-water two phase system. It is the most exte nsive widely-used way for the preparati on of PS, but the react ion mecha nism of tran sphosphatidylati on and hydrolysis by PLD remains unclear. The conversion of PC to PS was carried out at a Constant temperature shak ing table with the sp

4、eed of 200 rpm/mi n, pH 5.5 and 28 °C , with an in crease in the PC concentration, the conversion of the PC and the yield of the PS all decreased. The effect of the high choline concentration for the decrease was investigated by the addition of 3、 6mM depressor (choline) in the transphosphatidy

5、lation system with different concentration of PC,respectively. The in hibitory mecha ni sms of choli ne in PLD catalytic reacti on was explored, the n we described two react ion models which are free in hibiti on intrin sic kin etic model and in hibiti on intrin sic kin etic model, The experimental

6、data agreed well with the simulation results, these model may serve as a predictor for the in dustrialized product ion of the PS.Key words: phosphatidylserine; transphosphatidylation; kinetic model; inhibition;磷脂酰絲氨酸（PS）是一種體內(nèi)分布廣而功能獨特的稀有磷脂，研究表明， PS能夠增強神經(jīng)遞質(zhì)效率，促進腦部信息傳遞，激發(fā)大腦活化狀態(tài)，具有促進用 腦疲勞的恢復、改善記憶力、預防老年癡

7、呆癥、治療兒童多動癥、平衡情緒、緩 解抑郁等多種療效1-4。PS已成為重要的保健品，市場需求不斷擴大5。然而，天 然磷脂中PS含量很低，利用磷脂酶D （ PLD）催化的磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應由廉價的大 豆磷脂（磷脂酰膽堿，PC）合成PS是受到研究人員廣泛重視的工藝。典型PLD催化的磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應是水-有機溶媒雙液相體系。據(jù)報道，盡管 在大大過量的磷脂?；荏wL-絲氨酸存在下，產(chǎn)物收率仍難于進一步提高，這不 僅增加了原料、酶的消耗，也影響了產(chǎn)品 PS的純度。為了掌握磷脂?；D(zhuǎn)移反應 的規(guī)律，需要研究磷脂酶D催化磷脂合成PS過程中，酶、受體和底物磷脂的動力 學行為。Ogino等人發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌屬磷脂酶D

8、催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應過程中， 受體乙醇胺存在抑制，而甘油無抑制效應 ，說明不同受體其抑制效應不同；而據(jù)Juneja等報道，絲氨酸無抑制效應；Damnjanovi? J等總結了磷脂?；D(zhuǎn)移反應過 程的受體效應，認為無抑制效應時，受體的濃度應該足夠高以確保高效，并有效 抑制與轉(zhuǎn)磷脂酰基反應相競爭的底物水解作用；為滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，人們期 待通過增加底物PC濃度達到高效生產(chǎn)PS的目的，結果發(fā)現(xiàn)隨著PC濃度的增大， 其轉(zhuǎn)化率反而有所下降，Juneja等認為磷脂酶D催化反應的副產(chǎn)物膽堿對轉(zhuǎn)磷脂 ?；磻哂幸种菩?。不同來源的磷脂酶D具有高度保守的序列結構，所包 含HKD模體構成活性部位10-12

9、，而GG/GS模體構成結合部位13,14。反應被認為 是兩步ping-pong機理，首先組氨酸殘基咪唑-N親核進攻底物磷原子形成共價結合 的磷脂酰-酶中間物，然后中間物被水解或醇解。綜上所述，本文著眼于雙液相磷 脂酰基轉(zhuǎn)移反應中的受體底物大量過量事實，提出了受體底物預飽和假設，關聯(lián) 副產(chǎn)物膽堿抑制效應，建立動力學模型，并對其中的模型參數(shù)進行了數(shù)值計算， 為優(yōu)化反應條件并提高產(chǎn)物收率提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1儀器與設備電子天平（T-114,美國De nver），pH計（PB-10，德國Sartorius），掃描儀 （Pro800,日本Ca non）,碘蒸氣染色缸（200cmK400cm,上

10、海信誼）；恒溫搖床 （KYC 100B，上海?，敚槐诱归_缸（PQ,上海信誼）；干燥箱（DHG-9031A， 上海一恒）。1.2材料與試劑PLD （比活力大于8.0 U/mg，實驗室自制，方法參見文獻15），大豆磷脂酰 膽堿（PC-90,平均分子量760,上海復力），L-絲氨酸（無錫必勝），氯化膽堿 （國藥集團），薄層硅膠預制板（GF254, 上海信誼）。其它化學試劑均為市購分 析純。1.3實驗及檢測方法1.3.1磷脂?；D(zhuǎn)移反應由PC磷脂?；D(zhuǎn)移合成PS的反應在雙液相體系中進行，有機相為 15.0 ml 乙醚溶解一定濃度的大豆磷脂酰膽堿；水相由溶解1.05 g的L-絲氨酸7.8 ml的0.

11、2 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 5.5）和0.2 ml磷脂酶D組成。有機相與水相在磨口錐形 瓶中混合后開始反應，密封良好的反應瓶于28C、200 r/min的搖床中搖振進行雙相反應。一定時間間隔提取0.1 ml有機相樣品，并以TCL檢測磷脂組成。1.3.2膽堿對反應的抑制作用在1.3.1的反應體系中，水相添加一定濃度的氯化膽堿，其它條件不變，測定 膽堿存在下磷脂酶D催化反應過程組分濃度的變化。驗證膽堿對PC磷脂?；D(zhuǎn)移合成PS反應的抑制作用。1.3.3磷脂濃度測定反應樣品的磷脂濃度采用薄層層析（TLC ）法測定，有機相樣品用乙醚稀釋一定倍數(shù)后點樣 10此 于GF254薄層硅膠預制板上，以氯仿

12、-甲醇-水 -冰醋酸（65:25:5:1,體積比）為展開劑在展開缸中展開，碘蒸氣顯色。TCL板用掃描儀掃描，斑點用Photoshop軟件計算面積及灰度值，并與標品濃度對照得到樣品中磷 脂的濃度。2結果與討論2.1磷脂?；D(zhuǎn)移反應過程磷脂酶D催化磷脂醇解 在絲氨酸存在的雙液相體系（水-乙醚）中催化PC磷 脂?；D(zhuǎn)移反應生成PS。圖1表示有機相PC濃度為10 mmol/L、水相絲氨酸濃度 為1250 mmol/L （摩爾比為1:66.67，濃度比為1:125）時，在pH 5.5、28C和搖床 轉(zhuǎn)速200 r/min下反應過程的組分濃度變化情況。1Ll*omNC820255075100125tmie

13、/mm0圖1轉(zhuǎn)磷脂酰基反應過程各組分濃度與時間的關系在反應初期，PC、PS、PA和Cho各物質(zhì)的量呈線性變化，即反應速率可視 為一個定值常數(shù)，此反應過程可視為無抑制的零級動力學反應過程。30分鐘后隨著反應的進行，轉(zhuǎn)化率升高，反應速率不斷減小并趨于零，產(chǎn)物組成趨于一個定 值常數(shù)，分析造成這一現(xiàn)象的原因很有可能產(chǎn)物膽堿對反應過程的抑制效應。2.2膽堿對磷脂?；D(zhuǎn)移反應的抑制作用為了驗證膽堿對轉(zhuǎn)酯反應是否真的存在抑制效應，本實驗通過向反應體系中 直接加入膽堿，觀察實驗現(xiàn)象。實驗結果如圖2所示，兩組反應除膽堿濃度外，其余反應條件均一樣。10圖2膽堿的加入對轉(zhuǎn)磷脂?；磻^程的影響結果表明，膽堿的加入

14、使得 PC的轉(zhuǎn)化率下降了約10%，同時PS的產(chǎn)率下降 接近18%。分析可能造成這一現(xiàn)象的原因：膽堿為三甲基氨的氫氧化物，強有機 堿；磷脂酶D催化水/醇解的活性部位為HKD保守基序，其中的天冬氨酸為酸性 氨基酸，容易與膽堿結合生成結晶鹽，即膽堿與PLD結合導致PLD與底物親和力 下降，影響PC轉(zhuǎn)化率及PS產(chǎn)率。2.3動力學模型的導出2.3.1無膽堿抑制的動力學模型對于低濃度PC下PLD催化的轉(zhuǎn)磷脂酰基反應，由于膽堿生成量很少，對反 應過程抑制不明顯，本實驗在采取先忽略膽堿抑制的前提下，建立反應模型。對 于酶促反應來說，其反應過程總是以生成絡合物的形式來實現(xiàn)的，對于PLD催化PC所發(fā)生的轉(zhuǎn)磷脂?；?/p>

15、反應與水解反應可通過以下過程來實現(xiàn)(如圖 3):基 于受體底物預飽和假設，酶首先與受體絲氨酸(Ser)結合得到E-Ser；E-Ser與 PC發(fā)生親核反應生成PC-E-Ser復合物；PC-E-Ser發(fā)生轉(zhuǎn)磷脂酰基反應生成PS 并釋放出膽堿，在發(fā)生此反應的同時，PC-E-Ser還會發(fā)生水解反應最終生成 PA并 釋放膽堿。一一；k+ik+2:E+Ser .E-Se葉PCPC-E-SerPS+Chok-ik-3 k+31k+4E-PCPA+Cho圖3:無膽堿抑制時，酶催化 PC分別發(fā)生轉(zhuǎn)酯與水解反應的機理由于PC水溶性很差，而絲氨酸又只溶解在水相中，因此假設轉(zhuǎn)磷脂酰基反應 只發(fā)生在兩相接觸面上，在攪拌

16、狀況下各相中各物質(zhì)濃度均勻一致，不考慮擴散 引起的傳質(zhì)效應。以PS和PA的生成步為控速步驟，其他反應過程可以迅速達到 平衡，其中E表示反應體系中的游離酶：Ki二心，心=匕 (1)J k,Rpc= - RA - Rps(2)(3)Rpa=KiK3K.4EPC1 K1PC K1K3 PCRps=KgEI PC1 K1PC K1K3 PC(4)2.3.2有膽堿抑制的動力學模型4020(a)(b)圖 4： PC 濃度對生成 PS相對含量的影響。(a) ,PS(2mM PC); ,PS(4mM PC); ,PS(6mM PC);,PS(8mM PC); ,PS(10mM PC) ; (b戶,PC(2mM

17、) ; ,PC(4mM) ; ,PC(6mM) ; ,PC(8mM)嚴,PC(10mM)由圖4可知，隨著PC濃度的增大，PS的相對生成含量不斷下降，PC轉(zhuǎn)化率 也明顯降低，此時無抑制動力學模型已經(jīng)無法良好地預測反應過程。為探究產(chǎn)生 這一現(xiàn)象的原因，膽堿抑制機理被廣泛接受9。通過向酶促反應中加入定量膽堿， 證實膽堿抑制機理。同時圖3中無抑制動力學模型也應得到修改，結果如圖5所示。K5=k 5k _5R' PA=k+2PC-E-SerPS+ChoE+Ser二 E-Ser+PCCho-E-Ser圖5:有膽堿抑制時，酶催化相應的動力學方程如下：(5)KKK 4EPC1 K1PC K1K3PC

18、K5ChoKgEIPC1 K1PC K1K3PC K5ChoE-PCPA+ChoPC分別發(fā)生轉(zhuǎn)酯與水解反應的機理(6)(7)2.4模型參數(shù)2.4.1無膽堿抑制的動力學參數(shù)采用MATLAB工具對方程（1）（ 4）進行處理。用龍格-庫塔算法實現(xiàn)對速 率微分方程的求解，結合最小二乘的方法擬合方程中的四個參數(shù)（平衡常數(shù)：K1、K3；反應速率常數(shù)：k+2、k+4），擬合過程基于下式：' PC®i 一 PCsimul，i PSreal，i22_ PS simul， ireal， i -PA(8)QChoheal，i -Chosimul，i其中，PCreal,i、PSreal,i、PAre

19、al,i、Ch。 real,i 分別為 PC、PS、PA、ChO 實驗 測定值；PCsimul,i、PS simul,i、PA simul,i、Cho simul,i 分別為 PC、PS PA、ChO 在 對應時刻，相同條件下，軟件的擬合值，所得參數(shù)值如表1所示。2.4.2有膽堿抑制的動力學參數(shù)方法同無膽堿抑制時相同，對方程（1）、（ 2）、（ 5）（7）進行求解，加 入不同濃度膽堿時的動力學參數(shù)如表1所示。表1外加不同濃度膽堿時的動力學參數(shù)參數(shù) 外加膽堿K1k+2K3k+4K500.47231.2220.23331.1842/30.48231.3540.26311.18260.36560.4

20、8291.3590.26171.18220.365化學反應速率常數(shù)及平衡常數(shù)都是溫度的函數(shù)，與濃度無關；本實驗中各反應溫度等條件均一致，只改變膽堿的濃度，故所求參數(shù)應保持不變，與表1結果相符，說明機理穩(wěn)定。由K5可看出確實存在膽堿抑制效應，表明膽堿的加入會直 接影響酶與底物的親和力，造成酶和底物結合能力變?nèi)?，屬于競爭性抑制?.5模型評價30-_6-10204060 BO 100120time (minlime (min)(a)(b)（c）圖6對所提機理的驗證（a，b）不同初始膽堿含量下， PC向PS轉(zhuǎn)化：（ 0mM ； （） 6mM ；（c）不同初始膽堿含量下， PC濃度對PS初始生成速率的

21、影響：（ 0mM ； （） 6mM圖（a）、（b）分別為反應體系中PC、PS含量隨時間的變化情況，其中曲線 是根據(jù)上文建立的模型，利用 matlab軟件進行數(shù)值計算得到的擬合曲線，點表示 實驗過程的測定值。如圖所示，PC的轉(zhuǎn)化速率及PS的生成速率都隨初始膽堿含 量的增加而減小，PC的轉(zhuǎn)化率也有所降低，兩者的擬合數(shù)據(jù)和實驗數(shù)據(jù)吻合良好， 驗證了膽堿抑制假設；為了進一步驗證機理的合理性，根據(jù)上述所求動力學參數(shù) 表達出PS的生成速率方程，在不同初始膽堿含量下進行實驗，分別測定不同PC濃度對PS初始生成速率的影響，理論值與實驗值如圖（c）所示，在固定初始膽 堿含量的情況下，PS初始生成速率隨PC濃度的

22、增加而增加，而在相同PC濃度時， 增大膽堿初始含量，PS初始生成速率明顯降低，計算結果和實驗數(shù)據(jù)吻合良好， 從而進一步驗證了假設模型的合理性。3、結論采用PLD催化磷脂酰膽堿進行酯交換反應是合成 PS最有效的方法。本文通過 在反應體系中加入膽堿與不加膽堿時對 PS與PA生成速率的影響，建立了 PLD催 化磷脂酰膽堿發(fā)生轉(zhuǎn)?；磻膭恿W方程。本實驗中絲氨酸與磷脂酰膽堿（PC）加入的物質(zhì)的量之比為100:1，反應條件為PH 5.5，溫度28°C, 200 rpm/min的恒 溫搖床。由動力學實驗發(fā)現(xiàn)，隨著底物PC濃度的增大，生成膽堿的含量也在增多， 膽堿與PLD結合造成PLD與PC親和

23、力變?nèi)酰瑢е翽S的生成速率與PC的轉(zhuǎn)化率 降低。從動力學角度可知，若在反應過程中移除膽堿，則可以大大提高PS的生成量。參考文獻1 Suzuki S, Yamatoya H, Sakai M, et al. Oral admi nistrati on of soybea n lecith in tran sphosphatidylated phosphatidylseri ne improves memory impairme nt in aged rats.J. Journal of Nutrition, 2001, 131(11):2951-2956.2 Crook T, Petrie W,

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