吡咯烷二硫氨基甲酸酯對犬心肌線粒體損傷的保護作用

1、    作者：孟素峰，李有清，王啟明 【摘要】  目的 觀察吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)對體外循環(huán)(extracorporeal circulation,ECC)中犬心肌線粒體損傷的保護作用。方法 12只犬隨機分為對照組(C組,n=6)和PDTC組(P組,n=6)，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉25 mg/kg麻醉后建立ECC心肌缺血再灌注模型。P組于ECC前靜脈注射PDTC 20 mg/kg，C組靜脈注射等量生理鹽水。分別于ECC前、阻斷主動脈60 min、開放主動脈30 min和60 min時，測定心肌線粒體超氧化物歧化酶（SOD）、谷

2、胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX）、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)和線粒體腫脹度(MSD)。結(jié)果 與ECC前比較，兩組阻斷主動脈后SOD、GSH-PX及T-AOC均降低(P0.01)，MDA和MSD含量均升高；開放主動脈后C組SOD、GSH-PX及T-AOC均降低(P0.01)，MSD和MDA含量均升高(P0.01)；P組在開放主動脈60 min時SOD、GSH-PX、T-AOC、MSD和MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。P組在阻斷主動脈60 min時和開放主動脈后SOD、GSH-PX及T-AOC均顯著高于C組(P0.01)，MSD和MDA含量均顯著低于C組(P0.01)。

3、結(jié)論 ECC中使用PDTC可提高心肌線粒體抗氧化能力，減輕心肌線粒體損傷。 【關(guān)鍵詞】  吡咯烷二硫氨基甲酸酯；線粒體；體外循環(huán)；心肌保護    Abstract: OBJECTIVE   To observe the effect of pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)on canine myocardial mitochondrial injury during extracorporeal circulation (ECC). METHODS  Twelve healthy

4、mongrel dogs undergoing ECC were randomly allocated into control group(group C,n=6)and PDTC pretreatment group(group P,n=6).All  dogs were anesthesitized with 2.5% sodium pentobarbitone 25 mg/kg.After tracheal intubation,the myocardial ischemia-reperfusion injury model during ECC was made

5、by declamping(DC)after  aortic cross-clamping(AC)for 60 min.In group P,PDTC 20 mg/kg was administered intravenously before ECC，while in group C physiological saline was given instead of PDTC.Myocardial mitochondria were isolated before ECC,60 min after AC，30 min and 60 min after DC for det

6、ermination of superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase(GSH-PX),malondialdehyde(MDA),total anti-oxidation capacity (T-AOC) and mitochondrial swelling degree(MSD). RESULTS  The myocardial mitochondria of SOD,GSH-PX and T-AOC were decreased，while MDA and MSD were increased after AC a

7、s compared to the value before ECC in both groups(P0.01).SOD,GSH-PX and T-AOC were decreased，while MDA and MSD were increased after DC as compared to the value before ECC in group C(P0.01).The myocardial mitochondria of group P at 60 min after DC had not significant differences in content of MDA,SOD

8、,GSH-PX,T-AOC and MSD(P0.05).SOD,GSH-PX and T-AOC were distinctly lower，while MDA and MSD were distinctly higher at 60 min after AC and after DC in group P than those in group C(P0.01). CONCLUSION  Pretreatment with PDTC is effective in improving the anti-oxidation ability of myocardial mi

9、tochondria and attenuate myocardial mitochondrial injury.    Key words：  Pyrrolidine dithiocarbamate;Mitochondria;Extracorporeal circulation；Myocardial protection    線粒體是心肌細胞進行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所,線粒體損傷和功能障礙與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生有密切關(guān)系1-2。但迄今為止，有關(guān)ECC中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和抗氧化能力影響的報道甚少。抗氧化劑

10、吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一種新型抗氧化劑，具有抑制炎性反應(yīng)、減少氧自由基的產(chǎn)生和穩(wěn)定細胞膜的作用。本研究旨在探討PDTC對ECC犬心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和抗氧化能力的影響，為PDTC在心肌缺血再灌注損傷中的治療研究提供依據(jù)。    1  資料與方法    1.1  主要試劑  PDTC（美國Sigma公司），超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)試劑盒（中國南京建成生

11、物工程研究所）。    1.2  動物分組及模型的建立  健康成年雜種犬12條(天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心供)，手術(shù)當(dāng)日晨禁食，體重1218 kg，雌雄不拘，隨機分為對照組(C組）和PDTC組(P組)，每組6只。麻醉后行氣管內(nèi)插管,連接呼吸機行機械通氣，潮氣量12 ml/kg，呼吸頻率16 次/min。股動、靜脈置管監(jiān)測平均動脈壓(MAP)和中心靜脈壓(CVP)。取胸骨正中切口,切開心包，右心房內(nèi)注射肝素3 mg/kg,左鎖骨下動脈和右心房分別插管,連接人工心肺機、氧合器及動、靜脈管道。升主動脈根部安置一次性使用心臟停搏液灌注器。開始E

12、CC前5 min，調(diào)節(jié)循環(huán)水溫度至2830，P組與C組分別經(jīng)股靜脈注射PDTC 20 mg/kg及等量生理鹽水。穩(wěn)定并行循環(huán)5 min后阻斷升主動脈，主動脈根部灌入4St.Thomas停搏液(10 ml/kg)，轉(zhuǎn)機流量為6080 ml/(min·kg)，阻斷升主動脈60 min。開放升主動脈后觀察循環(huán)情況60 min。    1.3  指標測定  采用差速離心法提取心肌線粒體3。分別于ECC前、阻斷60 min、開放60 min時取左心室前壁心肌，稱重后,按19(w/v)比例加入分離液(包括0.225 mol/L D-ma

13、nnitol,0.075 mol/L sucrose,0.05 mol/L EDTA,10 mol/L Tris-HCI，pH 7.4), 置于04冰浴中的燒杯內(nèi),快速剪碎,以超聲勻漿器勻漿，600×g 4低溫離心5 min，取上清液,分離液懸浮沉淀，再次超聲勻漿,重復(fù)2次。4次離心所得到的上清液再以10 000×g 4低溫離心10 min,沉淀即為線粒體。用分離液重懸后，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，考馬斯亮藍法測定線粒體懸液蛋白濃度，分別取100 g/L的線粒體0.2 ml測定MDA和GSH-PX，分別取10 g/L的線粒體50 L測定SOD和T-AOC。參照文獻3

14、測定線粒體懸液520 nm處吸光度值，作為線粒體腫脹的指標。    1.4  統(tǒng)計學(xué)方法   數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。   2  結(jié)  果    2.1  心肌線粒體SOD、GSH-PX和T-AOC的變化  與ECC前比較，阻斷主動脈60 min、開放主動脈30 min和60 min時C組SOD、GSH

15、-PX和T-AOC均降低(P0.01)；阻斷60 min主動脈和開放主動脈30 min時P組SOD、GSH-PX和T-AOC均降低(P0.05)；開放主動脈60 min時P組SOD、GSH-PX和T-AOC均恢復(fù)至CPB前水平(P0.05)。阻斷主動脈60 min、開放主動脈30 min和60 min時P組SOD、GSH-PX和T-AOC均高于C組(P0.01)。見表1。    2.2  心肌細胞線粒體MDA和MSD的變化  線粒體腫脹導(dǎo)致其濁度降低,表現(xiàn)為520 nm處吸光值的下降，吸光度降低與線粒體的腫脹程度呈正比。與ECC前比較

16、，阻斷主動脈60 min、開放主動脈30 min和60  min時C組MDA和MSD均增加 (P0.01)，阻斷主動脈60 min和開放主動脈30 min時P組MDA和MSD均增加(P0.05或P0.01)，開放主動脈60 min時P組MDA和MSD差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。阻斷主動脈60 min、開放主動脈30 min和60 min時P組MDA和MSD均低于C組(P0.01)。見表1。    3  討  論    線粒體損傷可引起一系列的細胞功能障礙，線粒體損傷與心

17、肌細胞線粒體膜功能和抗氧化能力的表1  心肌線粒體SOD、GSH-PX、T-AOC、MDA和MSD的比較注：與ECC術(shù)前比較*P0.05，*P0.01；與C組比較 #P0.05    改變有著密切的關(guān)系。心肌細胞線粒體腫脹度是評價線粒體膜通透性和流動性的敏感指標，提示線粒體腫脹度的變化在心肌細胞線粒體損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用十分重要4。    SOD、GSH-PX活力和MDA的含量既是反映抗氧化能力的重要指標，又可反映心肌缺血再灌注損傷的程度。研究證實，線粒體在氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的氧自由基可被GSH-PX、SOD等清除，在一定程度上防

18、止氧自由基及其介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起的損害5。而ECC時，血液與人工管道的直接接觸引起的血液激活是產(chǎn)生大量氧自由基的主要途徑6。我們發(fā)現(xiàn)，對照組心肌缺血后心肌細胞線粒體內(nèi)MDA含量與線粒體腫脹度均明顯增加，與此同時，抗氧化酶GSH-PX、SOD及T-AOC顯著下降；開放主動脈后心肌細胞線粒體MDA含量與線粒體腫脹度未見進一步改善,相反較缺血期間進一步增加；GSH-PX、SOD和T-AOC繼續(xù)下降，從而證實ECC和心肌缺血再灌注過程中產(chǎn)生大量氧化代謝產(chǎn)物造成線粒體抗氧化水平下降。開放升主動脈后雖然恢復(fù)心臟的血液循環(huán)，但大量的氧自由基所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會消耗心肌細胞線粒體抗氧化酶類，導(dǎo)致線粒

19、體氧化與抗氧化嚴重失衡，使其膜結(jié)構(gòu)更易于受到氧自由基的攻擊，導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能都遭到破壞。所以改善缺血/再灌注過程中心肌線粒體氧化與抗氧化的動態(tài)平衡對于減輕線粒體膜損傷有重要意義。    研究表明，心肌細胞線粒體膜脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸對氧自由基損傷非常敏感，易受自由基攻擊而被氧化，產(chǎn)生脂類過氧化物，其主要分解產(chǎn)物是MDA7。MDA是脂質(zhì)過氧化物中毒性最大的一種，它能與核酶分子中的氨基和含有游離氨基酸的蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成交聯(lián)產(chǎn)物，降低生物膜的流動性和通透性。ECC期間，機體MDA增高、抗氧化酶類(GSH和SOD)及T-AOC的降低反應(yīng)了氧化應(yīng)激的程度，通過測定線粒體MDA、

20、GSH-PX、SOD及T-AOC可間接了解線粒體的損傷情況8。本研究從氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)入手，ECC中應(yīng)用PDTC治療可增加心肌線粒體SOD、GSH-Px活性，降低線粒體MDA含量，在一定程度上清除氧自由基以及降低氧自由基的介導(dǎo)放大效應(yīng)，使過度的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)得到控制。提示PDTC可有效抑制氧自由基對線粒體膜的氧化損傷，提高線粒體抗氧化能力。    本研究發(fā)現(xiàn)PDTC對線粒體膜結(jié)構(gòu)有明顯的保護作用，這種作用主要表現(xiàn)在開放主動脈后的過程中，P組線粒體腫脹度顯著低于相應(yīng)時點C組，并逐漸恢復(fù)至ECC前水平，說明ECC中PDTC對線粒體膜等均有很好的保護作用，這可能是由于PD

21、TC與膜中不飽和脂肪酸競爭性地與脂過氧基結(jié)合以直接阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈式反應(yīng)，減低脂質(zhì)過氧化速率；再者，PDTC能插入到有不飽和脂肪酸存在的生物膜，使得含有不飽和脂肪酸的膜具有更大的穩(wěn)定性9。本研究證實，ECC期間和心肌缺血再灌注過程中隨著氧自由基的釋放，心肌細胞線粒體的氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)呈現(xiàn)病理性變化，表現(xiàn)為線粒體抗氧化水平降低，線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性損害。而PDTC對缺血再灌注心肌線粒體功能有保護作用，主要表現(xiàn)在PDTC可有效提高線粒體抗氧化酶的活性，清除氧自由基，降低過氧化脂質(zhì)含量，加速低溫缺血心肌細胞線粒體抗氧化能力的恢復(fù)，可有效抑制自由基對線粒體膜的氧化損傷?！緟⒖嘉墨I】

22、60; 1 Kavianipour M,Ronquist G,Wikstrom G,et al.Ischaemic preconditioning alters the energy metabolism and protects the ischaemic myocardium in a stepwise fashionJ. Acta Physiol Scand,2003,178(2):129-137.2 Mallet RT,Sun J.Antioxidant properties of myocardial fuelsJ.Mol Cell Biochem, 2003, 253 (

23、1-2):103-111.3 Shlafer M,Gallagher KP,Adkins S.Hydrogen peroxide generation by mitochondria isolated from regionally ischemic and nonischemic dog myocardiumJ.Basic Res Cardiol, 1990, 85 (4): 318-329.4 Athanasiou A, Smith PA, Vakilpour S,et al.Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: How vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell deathJ. Biochem Biophys Res Commun,2007,354(1):50-55.5 Oz E, Erbas D, Surucu HS,et al.Prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity by melatoninJ.Mol